Yöntem makalesi

Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

DOI:

10.3791/53243

⸱

1 Ocak 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çekirdek giderici enzimler, antibiyotik direnci ve biyofilm oluşumu ile ilişkili virülans faktörlerinin ve genlerin ekspresyonunu önleyerek, direnç oluşma riski olmadan patogenezi hafifletebilen anti-virülan ve anti-bakteriyel seçeneklerdir. Bu çalışmada, bakteriyel biyofilm bozulmasında çekirdek söndürücü enzimlerin etkinliğini gösteren bir yöntem bildirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoklu ilaca dirençli bakterilerin hızla ortaya çıkması, yaşamı tehdit eden enfeksiyonlara karşı koymak için yeni terapötik yaklaşımlara olan ihtiyacı hızlandırmıştır. Bakteriyel enfeksiyonun kalıcılığı genellikle çekirdek algılama aracılı biyofilm oluşumu ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu sinyalizasyon devresinin bozulması, çekici bir virülans önleme stratejisi sunar. Çekirdek söndürücü laktonazların, çekirdek algılama devrelerinin etkili bozucuları olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu enzimlerin bakteriyel biyofilm oluşumunu bozmada etkili bir şekilde kullanıldığına dair çok az rapor bulunmaktadır. Bu protokol, klinik olarak anlamlı bir A. baumannii S1 suşunda, tasarlanmış bir çekirdek söndürücü laktonaz kullanımı yoluyla biyofilm oluşumunu bozmak için bir yöntemi açıklar. Acinetobacter baumannii, dünya çapında ciddi hastane kaynaklı enfeksiyonlarda rol oynayan önemli bir insan patojenidir ve virülansı ağırlıklı olarak biyofilminin dayanıklılığına atfedilir. Tasarlanmış laktonaz tedavisi, önemli ölçüde A. baumannii S1 biyofilm azalması sağladı. Bu çalışma aynı zamanda, biyofilm aracılı bakteriyel hastalıkların gelecekteki tedavisinde tasarlanmış çekirdek söndürme enzimlerinin kullanılma olasılığını da göstermiştir. Son olarak, yöntem, umut verici çekirdek söndürücü enzimlerin yeterliliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulaşıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri, antibiyotik ilaçlar 1 bir geniş bağışıklık çok ilaca dayanıklı bakterilerin hızlı artışın daha karmaşık bir. Dirençli bakteri kaynaklı enfeksiyonlardan yüksek morbidite ve mortalite oranları ile, ilaç geliştirme süreçlerini yükselmek ve / veya tedavi seçenekleri geliştirmek için daha iyi anti-bakteriyel alternatifleri keşfetmek için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, anti-virülans yaklaşımı dolayısıyla direnç mekanizmaları 2 risklerini azaltmaya olmayan bakteri yöntemlerle virülansını önlemede potansiyeli verilen faiz kazanıyor.

Nisabı algılamalı bakteriyel virülans ve bu sinyal olgusunun bozulması bir 'ana şalteri' patogenezinde 3 karşı vadeden bir anti-virülans yöntemdir olduğunu. Kritik bakteriyel nüfus yoğunluğu ulaşıldıktan sonra virülansına başlangıcı dışı ortamda nisabı moleküllerin birikimini gerektirir. As quoROM molekülleri, komşu reseptörlerine bağlanma hastalık oluşturma faktörlerinin aktivasyonu gibi antibiyotik direnci ve biyofilm 4 ile ilişkili genlerin yol açar, hücre içi matris geri yayılır. Genel, nisap algılama bozulması Birincil metabolik etkilemeden nisabı molekülü ve reseptör etkileşimi inhibe içerir. Bu nedenle, hücre büyümesi üzerinde doğrudan bir ima yoktur. Fitness tehlikeye olmadığından, gelişmeye ve bu tür tedaviler 5 karşı direnç kazanmak için bakteriler için en az seçim baskı var. Buna ek olarak, çekirdek-algılama bozulması, anti-bakteriyel maddeler karşı koruma sağlar ve immün yanıtları ana biyofilm, olduğu gibi, doğal bakteri koruyucu mekanizmaların engelleyebilir.

Bu Dünya'da mikropların% 99 th içinde yaşayan mikroorganizmalar için çok önemli hayatta kalma avantajı kazandıran, karmaşık biyofilm gibi matrisler var olduğu tahmin edilmektedirese yapılar 6. Daha da önemlisi, bu sesil etki oluşumu en kalıcı ve kronik hastane kökenli enfeksiyonların 7 nedenidir. Acinetobacter baumannii küresel hastane kökenli enfeksiyonlarla ilişkilidir ve virülans büyük ölçüde yeterli çoğunluk algılama atfedilir Belli başlı insan patojenleri biridir aracılı biyofilm oluşumu 8. Çekirdek giderici enzimler, Gram-negatif bakterilerin 9 tarafından üretilen N -asil homoserin laktonlar (AHL'ler) olarak bilinen bir bileşikler grubu hedef, çekirdek-kaynaklı sinyal transdüksiyonunun bozulması başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalar da biyofilm 10,11 virülans faktörü ekspresyonu ve hücre sayılarının azaltılması yoluyla bakteriyel hastalık oluşumunun engellemek için bu enzimlerin kullanımına bağlı genişletmiştir. Ne yazık ki, bakteriyel patojenler tarafından biyofilm oluşumuna karşı nisabı-söndürme enzimlerin etkin kullanımı palpabl gösteri eksikliği kalır.Yeniden A. bozmaya, nisap inhibitörleri (AHL analogları), yerine nisabı giderici enzimler kullanmayı girişimleri olmuştur baumannii biyofilm oluşumu 12. Küçük moleküller inhibitörleri kullanılarak bu yöntem, geçerli bir yaklaşım olsa da, translasyon kullanımlarda, bio-mevcudiyetini sürdürülmesi zor olabilir. Enzimler terapötik etkileri için biyomedikal cihazların yüzeylerine immobilizasyon doğru daha uygundurlar Aksine, katalitik çekirdek giderici enzimlerin kullanılması biyolojik sorunu aşmak olabilir.

Burada, kristal viyole boyama ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, Geobacillus kaustophilus (GKL) bakteriyel biyofilm oluşumu üzerinde 13'ten mühendislik nisap-söndürme lactonases etkilerinin bir değerlendirmesini açıklar. Bu çalışma klinik olarak anlamlı A. biyofilm bozulması ilk başarılı gösteri nisap giderici enzimler kullanılarak baumannii S1 süzün. Yöntem tarifBu çalışmada, patojenik Gram-negatif bakterilere karşı sonraki terapötik geliştirme çabaları diğer çekirdek giderici enzimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. Biyofilm Oluşumunun 1. Kristal Violet Kantifikasyonu baumannii S1

  1. A. 5 ml'lik bir kültür büyütün lizojeni suyu içinde baumannii S1 (LB) 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C'de (tripton 10 g / L, bira mayası özütü 5 g / L).
  2. A. kültürünü ayarlayın istenen OD 0.8 600 baumannii S1. Bir 96-yuvalı plaka kullanarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 10 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacim 100 ul olduğunu.
  3. Hem de bir kontrol kültürü hazırlayın; Bu herhangi bir enzim içermez. Çoğaltır istenen sayıda elde etmek için benzer koşullar tekrarlayın.
  4. Bir kapak ile plaka örtün ve sızdırmaz şekilde kapalı bir 10 litrelik plastik bir kap içine koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C 'de plaka inkübe edin.
  5. Oyuk taze LB ortamı bir 100 ul ilave edin ve 30 ° C'de 21 saat boyunca inkübe plaka.
  6. Inkübasyon ikinci döneminden sonra, yavaşça tüm ortamı çıkarın. 200 ul steril su ile planktonik bakteri hücresini yıkayın. Yıkama sırasında hücrelere sadece minimal rahatsızlık olduğundan emin olun.
  7. Her çukuruna% 1 kristal viyole çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 200 ul steril su ile kuyusunu yıkayarak kristal viyole çözüm çıkarın. Iki kez yıkama tekrarlayın.
  8. Her çukuruna% 33 asetik asit, 100 ul eklenir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilir; Bu boya eriyecektir.
  9. 600 nm 'de kristal viyole absorbansı ölçülerek oluşan biyofilm miktarının belirlenmesi. Kristal viyole miktarı oluşturulmuş, biyofilm miktarı ile orantılıdır.

A. 2. konfokal lazer tarama mikroskobu baumannii S1 Biyofilm

  1. A. 5 ml'lik bir kültür büyütün 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C'de LB baumannii S1.
  2. ReklamA. sadece kültür istenen OD 0.8 600 baumannii S1. 35 mm bir cam tabanlı μ-çanağı kullanılarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 30 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacmi 1 ml olmuştur.
  3. Kapaklı μ-Dish Kapak ve mühürlü 10 litrelik plastik kaba koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C 'de μ-Bulaşık inkübe edin. 1 ml 'lik bir toplam hacme getiren saflaştırılmıştır GKL enzim ve taze ortam 30 ul ekle. 30 ° C'de bir 21 saat daha inkübe edilir.
  4. Adımı yineleyin 2.3 ve 30 ° C sıcaklıkta bir 24 saat μ-Dish kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, yavaşça ortamı çıkarın.
  5. Μ-çanağı Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde eritildi 5 ug / ml Alex Fluo 488-konjuge Buğday tohumu aglutinini (WGA) 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; Bu oluşan biyofilm leke olacaktır. T boyama çözüm çıkarın ve yıkayınO u-Dish HBSS 2 ml. Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
  6. % 3.7 formaldehit HBSS içinde çözüldü ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe 500 ul ilave et; Bu μ-Dish üzerine biyofilm çözecektir. HBSS 2 ml ile bir kez μ-bulaşık yıkama ve daha sonra tamamen uzaklaştırın. Μ-Bulaşık biyofilm sabit önceden CLSM görüntüleme 4 ° C de karanlıkta tutulmuşlardır edilebilir.
  7. CLSM görüntüleme ve analiz için yığının başına 0.21 mikron arayla görüntü başına 97 yığınlarının oluşturmak için 63 kat büyütme kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal tipte GKL ve geliştirilmiş GKL çift mutant (E101G / R230C) kristal viyole niceleme deneyde, iki çekirdek giderici enzimler biyofilm oluşumunu kesintiye uygulanabilirliğini göstermek için kullanılmıştır. Her iki enzim karşı lactonase etkinliğini göstermek için gösterilmiştir 3-hidroksi-dekanoyil-L-homoserin lakton (3-OH-Cı 10 -HSL), A. kullandığı başlıca çekirdek molekülün baumannii S1 14. Biyofilm bozulma geçerli bir değerlendirme için, (daha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney iki seti olarak, A. baumannii S1 bakteriler 15 tarafından oluşturulan biyofilm miktarını azaltabilir yüksek tuz konsantrasyonu olarak NaCl'siz LB ortamında kültive edilmiştir. Bu tür eserin varlığı oluşturduğu biyofilm miktarını, hem de farklı tedavi koşulları arasında nisabı-söndürme enzimlerin etkisini hafife olabilir. Katalitik inaktif enzim kullanımı enzim sekestrasyonun olası etkilerini ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak önemlidir. Inaktif enzimler, çekirdek mol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Milli Eğitim Bakanlığı Akademik Araştırma Fonu ve Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi ve Singapur Ulusal Araştırma Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tripton BD211705
Maya ÖzüBD212750
96 oyuklu plakaCostar3596
Kristal MenekşeSigma-AldrichC6158
Asetik Asit LaboratuvarTaramasıPLA00654XDikkat: Yanıcı
&-ÇanakIbidi80136
Alex Fluo 488-konjuge WGAInvitrogenW11261
Çile' S Dengeli Tuz Çözeltisi Invitrogen141475095
FormaldehitSigma-AldrichF8775Dikkat: Aşındırıcı 
Synergy HT Mikroplaka OkuyucuBioTek
1X-81 Ters Floresan MikroskobuOlympus

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
  3. LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
  4. Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  5. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
  6. Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
  7. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  8. Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
  9. Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
  10. Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
  11. Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
  12. Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
  13. Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
  14. Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
  15. Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Korum s n mleyici LaktonazBiyofilm BozulmasA baumannii S1Kristal Viyole BoyamaKonfokal Lazer Tarama MikroskopisiEnzim TedavisiBakteriyel BiyofilmAnti vir lans StratejisiLaktonaz AktivitesiBiyofilm Kantifikasyonu

İlgili makaleler