Yöntem makalesi

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

DOI:

10.3791/53245

⸱

4 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran proteinleri, hücrelerde besin taşınması, hareketlilik, sinyalleşme, hayatta kalma ve virülans gibi önemli işlevlere hizmet eder, ancak bilinen yapıların yalnızca ~%1'ini oluşturur. α sarmal ve β namlu olmak üzere iki tür zar proteini vardır. α sarmal zar proteinleri hemen hemen tüm hücre zarlarında bulunabilirken, β varil zar proteinleri yalnızca mitokondri, kloroplastlar ve Gram negatif bakterilerin dış zarlarında bulunabilir. Genel olarak zar proteinlerinin yapısal çalışmalarında yaygın bir darboğaz, analiz için yeterli saf numune almaktır. En sevdikleri β-namlulu dış zar proteininin (OMP) yapısını çözmekle ilgilenenlere yardımcı olma umuduyla, X-ışını kristalografisi ve / veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yararlı seviyelerde hedef β namlulu OMP'lerin üretimi için genel protokoller sunulmaktadır. Burada, hem doğal ifade hem de inklüzyon cisimlerine ifade için yapı tasarımını, bir afinite etiketi kullanarak saflaştırmayı ve deterjan eleme, bicelle ve lipidik kübik faz tekniklerini kullanarak kristalleştirmeyi özetliyoruz. Bu protokoller test edilmiş ve Gram-negatif bakterilerden elde edilen çoğu OMP için işe yaradığı bulunmuştur; Bununla birlikte, özellikle mitokondri ve kloroplastlar için, ekspresyon ve saflaştırma için başka yöntemler gerektirebilecek bazı hedefler vardır. Bu nedenle, buradaki yöntemler, Gram-negatif bakterilerden OMP'leri içeren çoğu proje için geçerli olmalıdır, ancak saflaştırılmış numunenin ifade seviyeleri ve miktarı, hedef OMP'ye bağlı olarak değişecektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-varil OMP sadece mitokondri, kloroplast dış zarlarında bulunan ve Gram-negatif bakteriler 1-3 edilebilir. bunlar α-helikal proteinleri olarak benzer rolleri hizmet ederken, her şerit içten iki komşu şeritlerin bağlı olmak üzere 8-26 adet anti-paralel β-ip kolları arasında değişen bir merkezi doku, gömülü β-barrel alanından oluşan çok farklı kıvrım (Şekil 1 ve 2). β-barrel alan ilk ve son şeritler daha sonra yakın ve çevresindeki membrandan β-barrel alan mühür (mitokondriyal SSVD hariç), bir anti-paralel bir şekilde hemen hemen tamamen birbiriyle etkileşime girer. Tüm β-barrel OMPlerdir Bu döngüler bazen Neisseria transferrin bulunan Pro bağlayıcı 75 kalıntı, kadar büyük olması ile, ligand etkileşimleri ve / veya protein-protein temasları önemli bir rol oynar farklı sekanslarda ve uzunluklarda hücre dışı ilmiklitein A (TbpA) 4. β-varil OMP da proteinin fonksiyonel bir amaç için ek etki hizmet N-terminal ya da C-terminal periplazmik uzantılarına sahip (örneğin, Bama 5-7, Fadl 10 8,9, FimD). Β-varil OMPlerin birçok çeşit 11 bulunmakla birlikte, daha yaygın türlerinden iki alanda, (1) TonB bağımlı nakliyeciler ve (2) autotransporters daha az aşina olanlar için örnekler olarak aşağıda açıklanmıştır.

TonB bağımlı taşıyıcılar (örneğin, FEPA, TbpA, BtuB, Cir, vs.) besin alma için gerekli olan ve bir C-ucu β- 22 bükümlü içinde sıkışmış bulunmuş ~ 150 kalıntısından oluşan bir N-terminal fiş alanı içermektedir varil alanı dış zar 12 (Şekil 3) içine gömülü. Bu fiş alanı serbest kovan alanı üzerinden geçen substratın engellerken, alt-tabaka bağlanma fiş etki th içinde yapısal bir değişikliği indüklerpotansiyel olarak (fiş düzenlenmesi veya fişin kısmi / tam fırlatma yoluyla) daha sonra periplazmaya dış zarından substrat taşımacılığının kolaylaştırılması için oluşumunu gözenek. TonB bağımlı taşıyıcıları örneğin insan konak proteinler 4,13,14 şirketinden demir gibi besin kaçırmak özel taşıyıcılar geliştiğini Neisseria meningitidis gibi gram-negatif bakterilere, bazı patojen soylarının hayatta kalmak için özellikle önemlidir.

Autotransporters olarak salgılanan veya sunulmuştur ya β-barrel alan (ESTA ve EspP gibi, tipik olarak 12-ip kolları) oluşmaktadır olan B-bloğu OMPlerdir ve bir yolcu alan Gram-negatif bakteri türü V salgılama sistemine ait olan olan hücre 15,16 (Şekil 3) yüzeyi. Bu β-barrel OMPlerdir genellikle hizmet yolcu etki hücre hayatta kalma ve virülans önemli roller hizmet ya proteaz adezin, ve / veya diğer EFfector bu patogenezi aracılık eder.

X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopi ve elektron mikroskobu (EM) bize sırayla onlar dış zarının içinde işlev tam olarak nasıl deşifre etmek için kullanılabilir atomik çözünürlükte OMPlerin modelleri belirlemek için izin olarak yapısal yöntemler. Bu paha biçilmez bilgiler daha sonra varsa ilaç ve aşı geliştirilmesi için kullanılabilir. Örneğin, transferin bağlanma proteini A (TbpA) Neisseria yüzeyi üzerinde bulunan ve doğrudan insan transferin bağlanır ve daha sonra özü ve kendi hayatta kalma demir alır, çünkü patogenezi için gereklidir. TbpA olmadan, Neisseria, insan ev sahibi demir temizlemek edemez ve patojenik olmayan bir hale getirilmektedir. TbpA 4 bağlı insan transferin kristal yapısı çözüldü sonra, iki protein ilişkili ne kadar net oldu TbpA ne bölgeleri etkileşimini aracılık, TbpA demir çıkarılması için önemli ne vardı artıkları venasıl bir TbpA hedefleyen Neisseria karşı ilaçlar geliştirebilmek olabilir. Bu nedenle, hayatta kalma ve patogenezinde Gram-negatif bakterilerde β-barrel OMPlerin önemi göz önüne alındığında, aynı zamanda mitokondri ve kloroplast fonksiyonu ve ek yapısal zar proteinlerinin bu eşsiz sınıfı hakkında bilgi ve bunların işlevi de sistemleri için ihtiyaç genel protokoller ifade ve yapısal yöntemlerle karakterizasyonu için yüksek seviyelerde hedef OMPS saflaştırılması genel amacı ile sunulmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonlama ve Ekspresyon

Not: Yapısal çalışmalar etkinleştirmek için, oldukça yüksek oranda saflaştırılmış proteinin yeterli miktarda hazırlanmış olmalıdır ve bu, genel olarak, E. hedef β namlu dış zar proteininin klonlanması ve fazla-ekspresyonu (OMP) ile başlar E. coli (Şekil 4). Bugüne kadar, mitokondriyal SSVD için olanlar dahil bütün β namlu OMP yapılar, bakteriyel olarak salgılanan protein 11 elde edilmiştir. Burada, genel protokoller, in vitro 17 yeniden katlama için kapanım bedenlerine klonlama ve bakteri membranların doğrudan (1) yerli ifadesi için β-varil OMPS ifade ve (2) ifadesi için sunulmuştur.

  1. Bir tanım yapısı Tasarımı
    1. Elde veya kodon optimize hedef OMP geni satın alabilirsiniz.
    2. Satın alma veya T7 ekspresyon vektörü (i) periplazmik lokalizasyon sinyali dizisini ihtiva eden elde, bir N-terminal 6 x-Histidin etiketive membran ya da (ii) 'in vitro tekrar katlanma için dahil organlarına ekspresyonu için bir periplazmik lokalizasyon sinyali dizisi olmadan in vivo ifadesi için bir TEV proteaz Alanı 4,18,19.
      Not: Bir N-terminal proteaz klivaj 6x veya 10x-histidin etiketi saflaştırma için kolay bir yöntem sağlayacaktır. Çözünür proteinler gibi, daha sonra etiketi çıkarılması için afinite etiketi (histidin, Strep, GST, vs.), afinite etiketinin pozisyonunda ve bir proteaz bölgesi dahil (TEV, enterokinaz, trombin, vs.) seçimi değişir .
    3. PCR ifade vektörü içine uygun primerler ve alt klon ile bir hedef diziyi çoğaltmak. Ligasyon bağımsız klonlama (KDK) alt klonlama için 20,21 veya geleneksel klonlama teknikleri (restriksiyon enzimleri / ligasyonu) kullanın. Ancak, LIC paralel klonlanmış üzere çeşitli yapıların (kesikler, etiketlerin çeşitli yararlanıcı, çeşitli) büyük bir sayı sağlayan yüksek verim kolaylaştırabilir dahakolayca.
  2. Vivo Membran-hedeflı dışa
    1. Bir sinyal sekansı ile hedef OMP aşağı klonlanmış β-varil ve çerçeve içinde doğrulamak için sıralama analizi kullanın (örneğin, pelB, OmpA) ifade yapısında.
      Not: sinyal sekansı dış membran içine periplazma ve sonraki meclise salgılanması için Sec translokon için doğmakta zinciri yönlendirir.
    2. BL21 (DE3) 'e kimyasal yetkin hücre 50 ul halinde plazmid 1.0 ul pipetleme ekspresyon için bakterilerin bir ekspresyon suşu içine inşa dönüştürme ve aşağı yukarı pipetleme yavaşça karıştırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    3. 30 sn su banyosu kullanılarak ve daha sonra 1 dakika boyunca geri buz üzerinde yer için 42 ° C'de ısı darbe.
    4. önceden ısıtılmış SOC ortamı 1 ml ilave edilir ve bir tezgah üstü çalkalamalı bir inkübatör kullanılarak 1000 rpm'de 1 saat süre ile 37 ° C 'de çalkalanır.
    5. Uygun bir Antibiot içeren LB agar plakaları üzerine hücreleri plaka 100 ulic gece boyunca 37 ºC ters inkübe ve.
    6. tek bir koloni ile 5 ml LB + antibiyotik kültürünü aşılayarak küçük ölçekli ifadesi testleri gerçekleştirin. 5-10 koloniler için tekrarlayın.
      Not: Çünkü β-varil OMP potansiyel toksisitesi ve bazal ifade düzeyleri üzerine güven, koloni-to-kolonisi değişkenlik bazen görülmektedir. Bu nedenle, birden koloniler tarama her yapı denenmektedir için tavsiye edilir. Erlenmeyer şişelerine bölmeli 125 ml, 25 ml, kültür üretmek küçük ölçekli ekspresyon testleri yerine, geleneksel 5 mi kültürleri için önerilmektedir. Bu durumlar genellikle daha iyi bir büyük ölçekli büyüme ne olacağını yansıtmaktadır. Buna ek olarak, çeşitli başarı seviyeleri, hedef proteine ​​bağlı olarak rapor edilmiştir, çünkü kültür ortamı (TB, LB, 2xYT, M9, vs.) çeşitli türleri de taranması için iyi bir fikirdir.
      1. 0.6 ~ bir OD 600 çalkalanarak 37 ºC'de büyütün.
      2. reklamın hedef OMP ekspresyonunu indüklerDing her kültür tüpüne 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 5 ul ve ek 1-2 saat büyümeye olanak sağlar.
      3. Bir mikro santrifüj kullanılarak 15,000 xg'de 1 dakika boyunca, her kültür, 1 ml (~ 0.6 OD 600) santrifüj tüm koloniler için ekspresyon düzeyleri karşılaştır.
      4. Süpernatantı ve 1 x SDS-PAGE yükleme tampon maddesinin 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısı ve sonra santrifüj tekrar 5 dakika boyunca 15.000 xg'de.
      5. % 10 jel her oyuğuna 20 ul pipetleme SDS-PAGE kullanarak örnekleri analiz edin. Sabit 200 V'de 35 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı
        Not: protein hedefi uygun bir şekilde katlanmış ya da altında olduğunu tespit edebilmek için, bu noktada yararlı olacaktır. Bu, genellikle küçük çaplı saflaştırma yaparak ya da ısı Değiştirilebilirlik için tahlil ile gerçekleştirilebilir.
    7. En iyi ifadesini gösteren koloni seçin ve orta 12-24 L kullanılarak büyük ölçekli ifadesini gerçekleştirmek.
      Not: geleneksel yöntemler, tipik olarak, 0.6 ~ bir OD 600 çalkalanarak 37 ° C'de kültürlerin büyümesini ve daha sonra, uygun bir uyarıcı ile teşvik (örneğin, 0.1-1 IPTG için mM veya p arabinoz% 0.2) ilave bir 2-4 saat boyunca . Arzu edildiği takdirde, indüksiyon öncesinde, düşük ila 20 ° olarak C sıcaklığını düşürmek ve indüksiyon süresi uzatılabilir.
      1. sızan sentezleme yöntemi için, 25 ml'lik bir 37 ° bir kültürü inoküle büyümeye ° C LB ortamında OD 600 ~ 0.6 ulaşana kadar, uygun bir antibiyotik (ler) ihtiva etmektedir. Daha sonra, TBC ortamı artı antibiyotik (ler) in on 1 L şişelere inoküle 1 ml ilave edilir ve (3 gün ~) Satürasyon 20 ° C'de büyütülmüştür.
    8. 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri.
    9. saflaştırma adımı Bölüm 2.1 geçin veya -80 ° C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak.
  3. İn Vitro REFOL için katma kütlelerinin Expressionding
    1. bir sinyal sekansı içermeyen sentezleme konstruktunu doğrulamak için sıralama analizi kullanın. Bir sinyal dizisinin olmaması inklüzyon gövdeleri olarak sitoplazmada birikmesine hedef proteini yönlendirir.
    2. İfade için bakteri bir ifade suşu içine ifade yapısı Transform. Cisimcik ifadesi için, mümkün zehirlenme etkileri en aza indirmek için indüksiyon (örneğin IPTG, arabinoz, vs.) ile ifadesini kontrol etmek için uygundur.
    3. Levha 100, uygun bir antibiyotik içeren LB agar plakaları üzerine dönüştürülmüş hücrelerin ul ° C, ters bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. tek bir koloni ile 5 ml LB + antibiyotik kültürünü aşılayarak küçük ölçekli ifadesi testleri gerçekleştirin.
    5. 2-4 ek koloniler için yineleyin 1.3.4.
    6. 0.6 ~ bir OD 600 çalkalanarak 37 ºC'de büyütün.
    7. 1-2 saat süreyle uygun bir uyarıcı ile neden olur.
    8. Tüm T ekspresyon seviyelerini karşılaştırO SDS-PAGE kullanılarak analizi ile kolonilerinin (Adım 1.2.6 bakınız). En iyi ifadesini gösteren koloni seçin ve orta 12-24 L kullanılarak büyük ölçekli ifadesini gerçekleştirin.
      1. 0.6-0.8 OD 600-37 ° C 'de hücrelerin büyümesine ve 3-5 saat boyunca 37 ° C' de neden olur. inklüzyon gövdelerinin sentezleme Bütün protein sentezleme deneylerinde olduğu gibi, diğer ifade türlerine göre daha güçlü olmasına rağmen, sentezleme büyüme ortamını, indüksiyon süresi, indüksiyon sıcaklığı ve verici ajan konsantrasyonunun değiştirilmesiyle iyileştirilebilir.
    9. 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri.
    10. saflaştırma adımı Bölüm 2.2 geçin veya -80 ° C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak.

2. Arıtma

  1. Membran fraksiyonlarından izole
    Not: çözünebilir proteinlerin aksine, yekpare zar proteinleri, lipid ikili katmanı içine gömülü ve dolayısıyladaha fazla arıtılmadan ve analiz (Şekil 5) bunları çıkarmak için deterjan gerektirir. ifade eden bir β-barrel OMP Saflaştırmadaki birinci aşama, zar fraksiyonu elde edilen ekstrelerdir.
    1. 5 mL / g hücre pastası bir oranda lisiz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 50 ug / ml AEBSF'in, 5 ug / ml DNase I) içinde süspanse hücreleri.
    2. Lyse bir Fransız basını veya hücre homojenleştirici kullanılarak hücreler. Lizinlerle parçalanmayan hücreler ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 xg'de lize hücreleri dönerler.
    3. 4 ° C'de 1 saat boyunca yüksek hızda (200,000 x g) yeniden temiz bir tüpe ve santrifüj süpernatant aktarın. Elde edilen pelet, ilgili proteini içeren membran fraksiyonu olup.
    4. Membran fraksiyonu, ilk membranlar aktarılması, bir Dounce homojenleştirici tekrar süspansiyon kullanılarak ve daha sonra çözücü tampon (50 mM KH 2 PO 4 pH 7.5, 200 mM NaCl eklenerek, 20 mM imidazol, PH 8.0) içinde (deterjansız 2x konsantrasyonda 20 g hücre başına 50 mi).
    5. Deterjan (yani, N-dodesil-β-D-maltozit (DCM), laurildimetilamin-N-oksit (LDAO), n-oktil-β-D-glukopiranosid, Triton (KK), küçük bir cam bardak içine yeniden süspansiyona alınan zarlar dökün ve ekleme yavaş 10x kritik misel konsantrasyonu (CMC) ~ bir son konsantrasyona kadar X-100, vb.)
    6. 1x çözücü tampon nihai bir konsantrasyona kadar su ile doldurun. hedef protein membran elde edilir ne kadar kolay bağlı olarak 4 ° C 'de 0.5-16 saat karıştırın.
      Not: Deterjan yavaş hedef protein elde etmek için membranlar çözünür kullanılır. İyonik (SDS, deoksikolik asit), iyonik olmayan (Elugent, ara, Triton X-100, RG, DCM) ve zitteriyonik (LDAO, CHAPS): burada kullanılabilir deterjan 3 tipi vardır. saflaştırma aşaması esnasında sabit ve tek dağılımlı olan bir protein bir deterjan kompleksi büyük zar proteini krista başarısı yardımcı olacakiyon. deterjanlar, bunların özellikleri, CMC bilgi ve membran proteinleri ve diğer uygulamaların saflaştırılması bunların kullanımı hakkında daha fazla bilgi ticari tedarikçisi web sitelerinde bulunabilir.
    7. 4 ° C'de 1 saat 300.000 xg'de çözünmüş örnek santrifüj. Süpernatan artık deterjan çözündürülmüş hedef β-barrel OMP içerir.
    8. aşağıda belirtilen Bölüm 2.3 ile devam edin.
  2. Katma kütlelerinin arasından refolding
    Not: In vitro refolding için, hedef β-varil OMP cisimcikler doğrudan ifade edilir. Burada bir avantajı, bu proteinlerin yüksek düzeyde elde edilebilir olmasıdır. Ancak dezavantajı, tekrar katlama, genellikle verimsiz ve sonraki bir yeniden katlama deney değişmesidir. Yine de, başarılı bir yapısal çalışmalar için refolded olan proteinlerin birçok örnek vardır. cisimcikler içine ifadesini takiben, bir anda deneyi yeniden katlanması için inklüzyon cisimcikleri izole gerekirs.
    1. Her liziz tamponunda yeniden süspanse hücreleri (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I, 4 mM 2-merkaptoetanol (BME)) (5 mi g hücre macunu). Lyse bir Fransız basını, sonication veya hücre homojenleştirici kullanarak.
    2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de düşük hızlı bir dönüş ile inklüzyonlar Pelet.
    3. bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 1.0 M üre, 25 ml içinde yeniden süspanse edilerek Dahil etme gövdelerini yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de düşük hızlı bir dönüş tekrar pelet.
    4. Adımı tekrarlayın gerekli 2.2.3.
    5. 10 mg nihai bir konsantrasyona kadar yıkanmış inklüzyon gövdeleri yeniden süspanse / ml 8.0 M üre ihtiva eden bir tampon (veya 6.0 M guanidinyum hidroklorür (GdCl)) 2x CMC ya da daha yüksek bir artı deterjan (yani, DCM veya LDAO).
      Not: Histidin etiketi içeren zar proteini hedefler için, arzu edilirse, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) saflaştırma denatüre CO kullanılarak gerçekleştirilebilirBölüm 2.3 aşağıda açıklanana benzer bir ilk adım olarak (8.0 M üre ya da 6.0 M GdCl olarak) şulları.
    6. denatüre eksik tamponunda diyaliz ile denatüre çıkarmadan yavaş yavaş (gece) tarafından refolding reaksiyonu gerçekleştirin.
      Not: Bunu gerçekleştirmek için diyaliz tampon çeşitli değişiklikler alabilir. cisimcikler önce bir IMAC kolona bağlı olup olmadığını hala yavaş denatüre kaldırmak için tamponlar alışverişinde sütuna bağlı iken Alternatif olarak, bir yeniden katlama reaksiyonu yapabilirsiniz. Her iki durumda da, bu nedenle, deterjan hedef stabilize mevcut olması gerekir, bir zar proteini olduğunu hatırlayın. Kullanılan deterjan diyaliz ise de, bu da diyaliz tampon maddesi (ler) e ilave edilmesi gerekmektedir.
    7. 4 ° C'de 1 saat 200.000 xg'de tekrar katlanmış örnekleri Spin. Süpernatan yeniden katlanmış deterjan çözündürülmüş hedef β-barrel OMP içerir.
    8. aşağıda belirtilen Bölüm 2.3 ile devam edin.
  3. I kullanılarak yapılan saflaştırma işlemiMAC, İyon Değişim ve Jel Filtrasyon
    Not: doğal olarak, in vitro yöntemler kullanılarak açık veya tekrar katlanmış olup protein varsayarak, bir histidin etiketi ile işlenmiş olan, daha sonra, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) Deterjan tutulmalıdır hariç Histidin çözünür etiketli proteinlerin çoğu için gibi saflaştırma için gerçekleştirilir Tüm takip eden tampon çözülmüş ve sabit hedef β-barrel OMP tutmak.
    1. 1-5 ml IMAC sütunu hazırlayın ya da bir prepacked sütununu kullanın. 4 ° C'de sonraki kromatografi adımları uygulayın. suyla yıkayın koruyucu herhangi izlerini kaldırmak için. otomatik bir arıtma sistemi kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak sütun gerekmektedir.
    2. IMAC Tampon A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl,% 0.1 DCM) ve IMAC Tampon B 250 ml (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl,% 0.1 500 ml hazırlanması DCM, ve 1.0 M imidazol).
      Not: Kullanılabilecek diğer deterjanlardışmda şimal-6 (% 0.05), Triton X-100 (% 0,03) ve LDAO (% 0.05).
    3. IMAC A tamponu 10 kolon hacmi ile IMAC sütunu dengeye
    4. 25 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar bir protein örnek imidazol ilave et ve karıştır. 2 mL / dakika dengelenen IMAC kolonu üzerine örnek yükleyin. akışı toplayın.
    5. 5 kolon hacmi tampon B ile imidazol artan konsantrasyonlarının her biri IMAC sütunu yıkayın (örneğin, 25 mM, 50 mM, 100 mM). 2 ml fraksiyonlar halinde yıkama toplayın.
    6. 5 kolon hacmi 250 mM'lik bir son konsantrasyon elde numune yıkayın. 2 ml'lik fraksiyonlar içinde elüt örnek toplamak.
    7. akışı analiz yıkama fraksiyonları ve SDS-PAGE analizi kullanılarak elüsyon fraksiyonları 280 nm'de absorbans göre (Adım 1.2.6 bakınız). SDS-PAGE analizi ile belirlenmiş hedef β-varil OMP ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın.
    8. Havuza alınan numuneye TEV proteaz ekleyerek 6x-Histidin etiketi kaldırmak (göreüreticinin protokolü) ve hafif hafif sallanarak 4 ° C'de gece boyunca kuluçka için.
    9. bölünmüş etiketleri ve herhangi bir bölünmemiş örnekten (akmasına) hedef β-varil OMP ayırmak için tekrar bir IMAC kolona örnek / proteaz çözüm yükleyin. Akış yoluyla etiketi eksik bölünmüş numuneyi içerecek.
      Not: Bu aynı zamanda gibi herhangi bir proteaz kaldırmak TEV-His, aynı zamanda bir parçalanamayan 6x-Histidin etiketi kendisi vardır. Aksi takdirde, diğer yöntemler sindirimden sonra proteazı kaldırmak için gerekli olacaktır.
    10. İsteğe bağlı olarak, daha da örnek saflaştırmak için iyon değişimi kromatografisi gerçekleştirin. Sütun kullanılmak üzere tüm tamponlarda deterjan içerdiğinden emin olarak, üreticinin talimatlarına uyun.
    11. Kristalizasyon için hazırlık deterjan ihtiva eden bir tampon maddesi içinde bir jel filtrasyon kolonu üzerine örnek yüklemek için, kristalleştirme için kullanılan, örneğin 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI,% 1 RG olarak.
    12. 1 ml'lik kesirler toplayın ve USI analizng, SDS-PAGE analizi (bkz Adım 1.2.6) 280 nm'de kendi absorbans dayalı. 280 nm'de absorbans ile Havuz fraksiyonları, hedef protein içerir olarak. ~ 10 mg / ml için konsantre edilir.
      Not: İstenirse, uygun bir bölme, aşağıda belirtildiği gibi, bir ısı değiştirilebilirliğini analizi kullanılarak değerlendirilebilir.
  4. Isı Değiştirilebilirlik Deneyi
    Not: Bir yöntem OMPlerdir yarı ana SDS-PAGE 22 kullanan ısı değiştirilebilirliğini testleri gerçekleştirmek için, saflaştırılmış β-varil doğru katlanmasına izlemek için. Burada, düzgün katlanmış olan ısıtılmayan numuneler genellikle farklı ısı denatüre olanlar göç edecektir. Bu özellik OMPS-varil ß benzersiz ve geniş membran proteinlerinin bu aileye incelemek için kullanılır.
    1. Önceki örnekleri hazırlamak için, jel aparat monte edin. Başlamak için, bir buz kovası içine tampon tankı yerleştirin ve buz ile tamamen kuşatır. tutucunun içine bir in-house döküm veya ticari yerli degrade jel yerleştirin ve tanka yerleştirin. t doldurunÇalışma buffer soğuk 1 x MES tamamen o tankı (50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA,% 0.1 SDS, pH 7.3).
    2. Pipet, iki bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine örnek (10 mg / ml), 0.25 ul. 'Haşlanmış' ve 'RT' gibi diğer olarak bir etiketleyin.
    3. Her numune tamponu 9.75 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın. Her iki numune için, 2 x SDS yükleme tamponu (100 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 2 SDS,% 0.2 mavi bromofenol ve% 20 gliserol) 10 ul ekle ve pipetleme hafifçe karıştırın.
    4. Oda sıcaklığında 'RT' örnek çıkarken 5 dakika boyunca 95 ° C'de 'Haşlanmış' örnek kaynatın. 'Haşlanmış' örnek kısaca Spin.
    5. Yük önceden birleştirilmiş yerli jeli üzerinde her iki numune de 20 ul. sabit 150 V 60 dakika çalıştırın jel çıkarın ve sonuçları görselleştirmek için boyama çözeltisi içinde ıslatın.

3. Kristalizasyon

Not: her iki kristalizasyon içinÇözünür ve zar proteini hedefler, bu örnek saflığı ve stabilite (örneğin, iyi bir deterjan, ligandlar, kofaktörler, vb) üst düzeye çıkarmak için, standart bir protokoldür. (1) deterjan (2) bicelle, ve (3) lipit kübik faz (LCP) (Şekil 6) 23: Genel olarak membran protein hedeflerini kristalize etmek için halihazırda kullanılan yöntemlere iki tabakalı gömülmüş proteinlerin amfifilik gereksinimlerini karşılamak başlıca üç yol kapsamaktadır. Bir nanoliter kristalleşme robot kullanılması önemle tavsiye edilir mümkün yapı tayini (Şekil 7) yardım etmek amaçlı araçlar belirli bir örnek hacmi için elenebilir koşulları sayısını yanı sıra, kullanan son gelişmeleri artırmak amacıyla.

  1. Kristalizasyon kullanılarak deterjanlar
    1. ~ 10 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir. İsteğe bağlı olarak, deterg azaltmak için% 3'lük bir son konsantrasyon elde örnek doğrudan ilave 1,2,3-dimerkapto eklemeent misel boyutu.
    2. parçacık ve yağış kaldırmak için 0.22 mikron santrifüj filtre kullanarak örnek Filtre.
    3. Bir kristalleşme robot kullanarak, her iki asılı tarafından ticari olarak mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak veya ~ 200 nl protein örnek ve ~ 200 nl kristalleşme tampon oluşan damla damla buharlaşma yöntemi oturan tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
    4. ~ 21 ° C 'de kristalleşme inkübe edin. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
    5. sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
  2. Bicelles kullanarak kristalleştirme
    Not: bicelle tekniklerin daha ayrıntılı bir ispatı Ujwal ve Abramson 24 tarafından tarif edilmiştir.
    1. Hazırlayın veya 3 satınCHAPSO 2.8 bir oranda: yayınlanmış protokollere 25 1 'e göre DMPC oluşan% 5 bicelle karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Diğer konsantrasyonları tahlil, hem de, diğer lipitler ve deterjanlar, gerektiğinde edilebilir.
    2. ~ 10 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir.
    3. 1 h / h 4: bir başlangıç ​​oranında, buz üzerinde, bicelle karışımı ekleyin (protein: bicelle) (örneğin, protein 40 ul bicelle karışımı 10 ul ve pipetleme hızla karıştırıldı).
    4. Buz 30-60 dk inkübe edin.
      Not: Protein: bicelle çözümü çoğunlukla açık kalmalıdır ancak genellikle hafif opak açabilirsiniz. Protein, ancak: bicelle Çözelti süt beyazı gösteren çökelmesini döner, daha sonra diğer değişkenler (örn, bir deterjan, tampon, vs.) test edilmelidir. yeni örneklerin yapıyor küçük ölçekli testler (8 ul protein ve 2 ul bicelles) için önce gereksiz örnek kaybını önlemek için ölçeklendirme istikrar doğrulamak için tavsiye edilir.
    5. Bir kristalleşme robot kullanarak, her iki asılı tarafından ticari olarak mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak veya ~ 200 nl protein örnek ve ~ 200 nl kristalleşme tampon oluşan damla damla buharlaşma yöntemi oturan tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
    6. ~ 21 ° C 'de kristalleşme inkübe edin. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
    7. sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
  3. Lipidik Kübik Faz kullanma kristalleşme (LCP)
    Not: LCP tekniklerin daha ayrıntılı bir gösterim önce Liu ve Cherezov 26,27 tarafından tarif edilmiştir.
    1. ~ 20 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir.
    2. Pre-sıcak monoolein için ~ 40 ° C. Yük60 ul bir gaz geçirmez 100 ul şırınga ve başka içine 40 ul protein örnek içine monoolein.
    3. Bir karıştırma coupler kullanarak, hava tanıtmak için dikkatli olmak, şırıngalar bağlayın.
    4. Numune saydam ve homojen hale tamamen kadar diğer bir şırınga karışımı iterek şırınga pistonları üzerinde alternatif basınç uygulayarak hafifçe karıştırın.
    5. LCP yöntemleri için tasarlanmış bir kristalleşme robot kullanarak, 100 nl protein örnek ve 750 nl kristalleşme tampon oluşan damla sandviç tarzı kristalleşme plakaları (0.1 mm kuyu kalınlığı) ile piyasada mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
      Not: Gerekirse Bırak oranları ayarlanabilir. Ayrıca, katı kapaklar (yani, cam ya da kalın plastik) plakaları ele gibi damla hakkında da hareket etmesine izin eğilimindedir damla güzel ziyade ince filmler, destekleyen tavsiye edilir.
    6. kristalleşme p inkübelat'lar ~ 21 ° C de. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
    7. sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YiuR Yersinia pestis karşı olası bir aşı hedefi olan bir TonB bağımlı demir taşıyıcıdır. Bu orjinal mikro-dizi analizi kullanılarak belirlenmiştir. Burada, X-ışını kristalografisi kullanarak YiuR yapısını belirlemek için alınmıştır adımlar (Şekil 9) özetlenmiştir. Klonlama için YiuR DNA sekansı (eksi N-terminal sinyal sekansı) PCR genomik DNA'dan kuvvetlendirildi ve TEV proteaz sitesi ardından bir N-terminali pelB sinyal sekansı ve 10x-histidin afinite ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-varil OMP bakteri, mitokondri ve kloroplastların Gram-negatif temel rolleri hizmet ve bu ilgili organellerin dış zarlarında da temel moleküler mekanizmaları hakkında bilgi hazinesi sunan yapısal analiz için önemli hedeflerdir. Ancak, yapısal analiz için yeterli örnek üreten her zaman kolay değildir ve bu nedenle, genel bir boru hattı detaylı kristallerine yapılardan sürecini anlatan, yapı tayini için hedef β-varil OMPlerin yeterli miktarda üretimi için sunulmuştur. Bu protokoller, test edilmiş ve gram-negatif bakteril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UV görüntülerini sağladıkları için CNRS'den Herve Celia'ya ve SONICC görüntülerini sağladıkları için Purdue Üniversitesi Kimya Bölümü'nden Chris Dettmar ve Garth Simpson'a teşekkür ederiz. Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Intramural Araştırma Programı'ndan sağlanan fonları kabul etmek isteriz. Ek olarak, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (AMS ve CJ), Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (N.N. 1K22AI113078-01) ve Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden (N.N.) ek finansman sağlamak isteriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kristalizasyon RobotuTTP Labtech, Art Robbins-Any, LCP kristalizasyon
PCR termodöngüleyiciEppendorf, BioRad-Media
ShakerNew Brunswick, Infors HT-UV-vis
spektrometresiEppendorf-SDS-PAGE
cihazıBioRad1645050, 1658005dışında burada çalışmalıdır
SDS-PAGE ve doğal jellerBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-AkTA
PurifierGE Healthcare-Microcentrifuge
(düşük-orta hız)Beckman-Coulter-Ultracentrifuge
(yüksek hız)Beckman-Coulter-SS34
rotorSorvall-Type
45 Ti rotorBeckman-Coulter-Type
70 Ti rotorBeckman-Coulter-Dounce
homojenizatörFisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-Diyaliz
tüpüSigmaD9652
LCP araçlarıHamilton, TTPLabtech-VDX
24 kuyulu plakalarHampton ResearchHR3-172
Sandviç tabaklarHampton Research, Moleküler BoyutlarHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Kristalizasyonlevhaları Grace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR sütunuGE Sağlık17-1167-01
Q-Sefaroz sütunuGE Healthcare17-0510-01
Kristalizasyon ekranlarıHampton Research, Qiagen, MolekülerBoyutlar-Gaz
geçirmez şırınga (100 ml)Hamilton 
Eppendorf-Centrifuge

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383(2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000(2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377(2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510(2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beta barrel Outer Membrane ProteinsOMP Expression PurificationT7 Expression VectorBL21 DE3 TransformationIPTG InductionSDS PAGE AnalysisIMAC PurificationTEV Protease CleavageGel Filtration ChromatographyCrystallization Trials

İlgili makaleler