β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals
Bu makalede
Özet
Özet
Membran proteinleri, hücrelerde besin taşınması, hareketlilik, sinyalleşme, hayatta kalma ve virülans gibi önemli işlevlere hizmet eder, ancak bilinen yapıların yalnızca ~%1'ini oluşturur. α sarmal ve β namlu olmak üzere iki tür zar proteini vardır. α sarmal zar proteinleri hemen hemen tüm hücre zarlarında bulunabilirken, β varil zar proteinleri yalnızca mitokondri, kloroplastlar ve Gram negatif bakterilerin dış zarlarında bulunabilir. Genel olarak zar proteinlerinin yapısal çalışmalarında yaygın bir darboğaz, analiz için yeterli saf numune almaktır. En sevdikleri β-namlulu dış zar proteininin (OMP) yapısını çözmekle ilgilenenlere yardımcı olma umuduyla, X-ışını kristalografisi ve / veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yararlı seviyelerde hedef β namlulu OMP'lerin üretimi için genel protokoller sunulmaktadır. Burada, hem doğal ifade hem de inklüzyon cisimlerine ifade için yapı tasarımını, bir afinite etiketi kullanarak saflaştırmayı ve deterjan eleme, bicelle ve lipidik kübik faz tekniklerini kullanarak kristalleştirmeyi özetliyoruz. Bu protokoller test edilmiş ve Gram-negatif bakterilerden elde edilen çoğu OMP için işe yaradığı bulunmuştur; Bununla birlikte, özellikle mitokondri ve kloroplastlar için, ekspresyon ve saflaştırma için başka yöntemler gerektirebilecek bazı hedefler vardır. Bu nedenle, buradaki yöntemler, Gram-negatif bakterilerden OMP'leri içeren çoğu proje için geçerli olmalıdır, ancak saflaştırılmış numunenin ifade seviyeleri ve miktarı, hedef OMP'ye bağlı olarak değişecektir.
Giriş
β-varil OMP sadece mitokondri, kloroplast dış zarlarında bulunan ve Gram-negatif bakteriler 1-3 edilebilir. bunlar α-helikal proteinleri olarak benzer rolleri hizmet ederken, her şerit içten iki komşu şeritlerin bağlı olmak üzere 8-26 adet anti-paralel β-ip kolları arasında değişen bir merkezi doku, gömülü β-barrel alanından oluşan çok farklı kıvrım (Şekil 1 ve 2). β-barrel alan ilk ve son şeritler daha sonra yakın ve çevresindeki membrandan β-barrel alan mühür (mitokondriyal SSVD hariç), bir anti-paralel bir şekilde hemen hemen tamamen birbiriyle etkileşime girer. Tüm β-barrel OMPlerdir Bu döngüler bazen Neisseria transfe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Klonlama ve Ekspresyon
Not: Yapısal çalışmalar etkinleştirmek için, oldukça yüksek oranda saflaştırılmış proteinin yeterli miktarda hazırlanmış olmalıdır ve bu, genel olarak, E. hedef β namlu dış zar proteininin klonlanması ve fazla-ekspresyonu (OMP) ile başlar E. coli (Şekil 4). Bugüne kadar, mitokondriyal SSVD için olanlar dahil bütün β namlu OMP yapılar, bakteriyel olarak salgılanan protein 11 elde edilmiştir. Burada, genel protokoller, in vitro 17 yeniden katlama için kapanım bedenlerine klonlama ve bakteri membranların doğrudan (1) yerli ifadesi için β-varil OMPS ifad....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
YiuR Yersinia pestis karşı olası bir aşı hedefi olan bir TonB bağımlı demir taşıyıcıdır. Bu orjinal mikro-dizi analizi kullanılarak belirlenmiştir. Burada, X-ışını kristalografisi kullanarak YiuR yapısını belirlemek için alınmıştır adımlar (Şekil 9) özetlenmiştir. Klonlama için YiuR DNA sekansı (eksi N-terminal sinyal sekansı) PCR genomik DNA'dan kuvvetlendirildi ve TEV proteaz sitesi ardından bir N-terminali pelB sinyal sekansı ve 10x-histidin afin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
β-varil OMP bakteri, mitokondri ve kloroplastların Gram-negatif temel rolleri hizmet ve bu ilgili organellerin dış zarlarında da temel moleküler mekanizmaları hakkında bilgi hazinesi sunan yapısal analiz için önemli hedeflerdir. Ancak, yapısal analiz için yeterli örnek üreten her zaman kolay değildir ve bu nedenle, genel bir boru hattı detaylı kristallerine yapılardan sürecini anlatan, yapı tayini için hedef β-varil OMPlerin yeterli miktarda üretimi için sunulmuştur. Bu protokoller, test edilmiş ve gram-negatif bakteril.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
UV görüntülerini sağladıkları için CNRS'den Herve Celia'ya ve SONICC görüntülerini sağladıkları için Purdue Üniversitesi Kimya Bölümü'nden Chris Dettmar ve Garth Simpson'a teşekkür ederiz. Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Intramural Araştırma Programı'ndan sağlanan fonları kabul etmek isteriz. Ek olarak, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (AMS ve CJ), Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (N.N. 1K22AI113078-01) ve Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden (N.N.) ek finansman sağlamak isteriz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kristalizasyon Robotu | TTP Labtech, Art Robbins-Any | , LCP kristalizasyon | |
| PCR termodöngüleyici | Eppendorf, BioRad-Media | ||
| Shaker | New Brunswick, Infors HT-UV-vis | ||
| spektrometresi | Eppendorf-SDS-PAGE | ||
| cihazı | BioRad | 1645050, 1658005 | dışında burada çalışmalıdır |
| SDS-PAGE ve doğal jeller | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare-AkTA | ||
| Purifier | GE Healthcare-Microcentrifuge | ||
| (düşük-orta hız) | Beckman-Coulter-Ultracentrifuge | ||
| (yüksek hız) | Beckman-Coulter-SS34 | ||
| rotor | Sorvall-Type | ||
| 45 Ti rotor | Beckman-Coulter-Type | ||
| 70 Ti rotor | Beckman-Coulter-Dounce | ||
| homojenizatör | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin-Diyaliz | ||
| tüpü | Sigma | D9652 | |
| LCP araçları | Hamilton, TTP | Labtech-VDX | |
| 24 kuyulu plakalar | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandviç tabaklar | Hampton Research, Moleküler Boyutlar | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Kristalizasyon | levhaları Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR sütunu | GE Sağlık | 17-1167-01 | |
| Q-Sefaroz sütunu | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Kristalizasyon ekranları | Hampton Research, Qiagen, Moleküler | Boyutlar-Gaz | |
| geçirmez şırınga (100 ml) | Hamilton |
Kaynaklar
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
