Bu protokol, eksize edilmiş bağırsak dokusu preparatlarının veya "bağırsak keselerinin" bağırsak bariyer fonksiyonunun ex vivo modeli olarak kullanımını tanımlar. Bu model, sindirim hastalığının hayvan modellerinde belirli bağırsak bölgelerinde hem epitel bariyerinin hem de mukoza jel tabakasının bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için
Bu makalede
Özet
Özet
epitelyal bariyer gastrointestinal sistemin ilk doğal savunma ve seçici küçük epitel boyunca moleküller ve neredeyse tamamen epitel makromoleküler taşıma yasaklayan taşınmasını kısıtlayan, altta yatan doku bölmelerine lümenin ulaşım düzenler. Bu seçicilik, lipofilik moleküller ve hem apikal reseptörleri ve epitelyumun dar kavşak protein kompleksleri taşıma sınırlar mukoza jel tabakası ile tespit edilir. Epitel in vitro hücre kültürü modelleri uygun olmakla birlikte, bir model olarak, bu eksikliği Mikrobiyota, mukoza-jel, epitel ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı. Öte yandan, alana özgü hiçbir gösterge ile bağırsak emilim veya geçirgenlik in vivo değerlendirilmesi gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyler, genel olarak mide-bağırsak absorpsiyonu ölçülür. Ex vivo geçirgenlik deneyleri "intestinal kesesi" kullanılarak; Bağırsak sitesi özgüllük avantajıyla genel bağırsak bütünlüğü veya belirli bir molekülün karşılaştırmalı taşınmasını ya ölçme hızlı ve hassas bir yöntemdir. Burada geçirgenlik çalışmaları için bağırsak keseleri hazırlanması ve belirgin geçirgenlik (P app) hesaplanmasını tarif intestinal bariyer boyunca bir molekülün. Bu teknik değerlendirme ilaç emiliminin bir yöntem olarak kullanılabilir, ya da gastrointestinal hastalıkların hayvan modellerinde bölge epitelyal bariyer yetmezliği incelemek.
Giriş
Mide-bağırsak sisteminin intestinal epitelyal bariyer Yetişkin bir insanda, 400 m2'de yaklaşık mukozal yüzey alanıdır. Sonuç olarak, sürekli mikrop, yutulan ilaç, besin ve bakteriyel toksinler karşı maruz kalmaktadır. ev sahibi sadece tolere ortakçı bakteri ve potansiyel patojenler arasında ayrım olmamalıdır, ama aynı zamanda besinlerin emilimini sağlarken, epitel bariyerini geçen bu türlerin ve salgılanan molekülleri engellemek gerekir. Bu nedenle, bağırsak epiteli rolü lümen içeriği 1 için seçici bir bariyer olarak hareket etmektir. Bu kurucu ve uyarılabilir mekanizma 2 oluşan bir yanıt biyolojik sistem yoluyla hareket mukozada doğuştan gelen epitel savunma sistemi tarafından, kısmen, elde edilir.
Epitelyal bariyer işlevinin kaybı gastrointestinal hastalıkların bir dizi özelliği olan bir patolojidir. In vivoepitelyal bariyer fonksiyonunun incelenmesi bir izleme molekülünün oral sonda ve sonraki serum analizi 3 ile değerlendirilebilir. Ancak, bu teknik bariyer disfonksiyonu siteye hiçbir gösterge sunar. In vitro ve Transwell sistemlerini 3 kullanılarak sırasıyla odaları 4,5 Ussing transepitelyal direnci ex vivo değerlendirmede, yaygın epitelyal bariyer fonksiyonunun taşıyıcı belirteç olarak kullanılan, ancak hayvan modellerinde 6 katkıda hastalık fizyolojisini yoksundur. Bu protokolde düzeylerde bir dizi mukozal bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek bağırsak bütünlüğü ve doğrudan ve lokalize değerlendirmesini sağlayan bir ex vivo doku hazırlama modeli açıklanmaktadır. Önemli olarak, bu teknik, hastalığın hayvan modellerinde de uygulanabilir, veya farmakolojik olarak mukozal bariyer işlev bozukluğu derinliği sorgusunda izin vermek için manipüle edilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol tüm hayvan çalışmaları prosedürleri onaylı Newcastle Hayvan Etik Kurulu Üniversitesi'ne sıkı sıkıya bağlı kalmanın ile yapılır.
Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık
- 37 önceden sıcak Ortam 199 (TC199) veya Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ortamı ° C. Ön oxygenate% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile köpüren ile orta. Orta 7.3 bir son pH değerine sahip olduğunu kontrol edin.
- Her kese için iki adet 5 cm bölümleri keserek dikiş hazırlayın. Döngü kapatılmamış bir düğüme dikişler.
2. Diseksiyon ve gastrointestinal sistemde hazırlanması
- Ötenazi önce katı gıda 12 saat çekin. İstenirse, bu süre içinde besin jel takviyeleri hayvanları yerleştirin.
- sodyum pentobarbiton aşırı dozda fareler öldürülür ([200 mg / kg], karın içinden enjeksiyon) kurumsal etik proto uygun olarak servikal dislokasyoncols karın ve göğüs üzerine% 70 etanol sprey ve.
- Bir makas kullanarak, karın ortasında yatay bir kesi yapmak ve periton maruz kalmaktadır.
- ayırmak ve pilor sfinkter de mideden üst ince bağırsak kesme ve anal eşiğinde kalın bağırsak keserek gastrointestinal sistem kaldırmak için devam edin. yavaşça mezenterin kaldırmak için bir forseps kullanın. Önceden ısıtılmış, oksijenli bir ortam içinde bağırsak yerleştirin.
- Bağırsak bölümünde tespit geçirgenlik (Şekil 1) için değerlendirilir ve bağırsak geri kalanından bilgilerini bu bölümü kesilecek.
- , Hayvanlar arasında tutarlılığı korumak mide duodenum ve jejunum göreli bölümleri ölçmek ve çekum kolon ve ileum göreli bölümleri ölçmek için.
- Doku bölümleri seçerken, örneğin Peyer yamaları olarak mukoza ile ilişkili lenfoid doku varlığı not edin. Bu küçük nod olarak tanımlanabilirlümenin serozal tarafında ules.
- 1 ml şırınga kullanarak, yavaşça önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) bir petri çanağı içine barsak segmenti luminal içeriği yıkayın. Bu dışkı içeriği atılan veya saklanabilir -80 istediğiniz gibi gelecek analizi için ° C.
Bağırsak Sacs 3. hazırlanması
- test bileşiği veya molekül bir 300 ul hacim ile 1 ml şırınga hazırlayın. mukoza bütünlüğü, FITC Dekstran M.Wt. bir 1 mg / ml solüsyon için 4.400 kullanılabilir. 4,400-70,000 Da büyüklüğü arasında değişen Probes artan hassasiyet için kullanılabilmektedir. Güvenli şırınga üzerine küçük bir hayvan damar kateteri uygun.
- barsak segmentinin açılması 5 cm ölçün ve segmenti kravat güvenli bu noktada bir dikiş-döngü ile kapattı. Yavaşça bağırsak açılışında etrafında önceden bağlı dikiş-döngü yerleştirin ve küntleşmiş kateter yerleştirin. bağırsak segmenti güvenli şekilde kapalı kement çekinve tüm çözüm enjekte edilir sağlamak, bağırsak içine şırınga 300 ul hacmi bırakın.
- Aynı anda bağırsak kesenin kapanmasını sağlamak için dikiş ilmeği çekerken yavaşça kateter kaldırın. bağırsak gevşek bağırsak kese kesin ve 37 ısıtılmış oksijenli ortam, 20 ml ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içine yerleştirmek ° C.
Geçirgenlik 4. Ölçümü
- ısıtılmış su banyosunda bağırsak keseleri içeren yer konik tüpler 37 ayarlanır ° C. 0, 30, 60, 90 ve 120 dk zaman noktalarında, her bir durumda taze ortam 100 ul hacim değiştirerek, 96 oyuklu bir plaka, konik tüp ve transfer 100 ul numune alın.
- son örnek alındıktan sonra, mukozal yüzeyi açığa sütür noktasında ve segmentin uzunluğu aşağı açık keselerini kesti.
- Her bağırsak parçasının uzunluğunu ve genişliğini ölçün. desi isekırmızı, çıtçıt -80 ° C'de kesimleri ve mağaza dondurmak Moleküler Yöntemler RNA stabilizasyonu çözelti içinde protein veya biyokimyasal analizler, ya da seçenek olarak, deposu için ° C.
- 1 ilâ 1 x 10 -6 kadar FITC etiketli moleküller için log dilüsyonlarda bir standart eğri oluşturmak.
- Bir floresan plaka okuyucu üzerinde FITC için numuneleri ölçün ve standartlar, FITC uyarma / emisyon: / 519 nm 495 nm.
Her Bireysel Bağırsak Sac için görünen geçirgenliği 5. Hesaplama
- sn zaman birimlerini dönüştürün.
- Her bir zaman noktası için, kümülatif konsantrasyon, S hesaplanması
Q t = (C t * V r) + (Q t toplamı * V ler), Nerede:
Q t = t zamanındaki kümülatif konsantrasyon
C t = t zamanındaki Konsantrasyon
Alıcı tarafında V r = Hacim
Önceki tüm Q t Q t toplamı = Sum
V s =Cilt örneklenmiş - Arsa süresi (T) karşı Q ve eğimi hesaplamak: δQ / ¨t
- Belirgin geçirgenliği hesaplayın (P uygulaması)
P app = (δQ / ¨ t) / (A * Co), Nerede:
bir doku = Konum
Cı 0 = Başlangıç konsantrasyonu
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, mide-bağırsak hastalığının hayvan modellerinde intestinal bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler incelemek için kullanılabilir. Gastrointestinal sistemin 7 değişen alanlarında mukozal yüzeyi boyunca paraselüler prob akışı ölçülerek, epitelyal sıkı bütünlüğü değerlendirilebilir. Buna ek olarak, boyut (Şekil 2) ya da hidrofob (Şekil 3), epitelyal pertürbasyon derecesi ya da mukoza jel tabakasının bütünlüğünün paraselüler prob doğ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, mukozal bariyer fonksiyonunu ex vivo değerlendirmek için izolasyon ve bağırsak keselerinin hazırlanmasını ayrıntılı var. Bağırsak kese hazırlıkları öncelikle bağırsak boyunca aday ilaçların emilimini inceleyerek, ilaç araştırma faydalanılmıştır. Bununla birlikte, bu deney, eşit ölçüde iyi barsak hastalığı çalışma için uygundur. bölge ve geçirgenlik sahaya özgü değerlendirilmesi ile büyük ölçüde değişebilir bağırsak geçirgenliği sindirim hastalıklarında mukozal bütünlüğün bölgesel öneminin daha iyi anlaş...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Projesi Hibe APP1021582 ve Sparke Helmore/NBN Triatlonu ve merhum Leslie Kenneth McFarlane'in Malikanesi'nin sponsorluğunda bir Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü hibesi tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dekantel Emilmeyen İpek sütür | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Yaşam Teknolojileri | 11043-023 | Floresan ile etkileşime girdiği için fenol kırmızısı yok |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Yaşam Teknolojileri | 21063-045 | Floresan |
| N-asetilsistein | Sigma Aldrich | Ortamda 10 mM'de kullanım | |
| Küçük hayvan vasküler kateter: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dekstran 4.400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dekstran 20.000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dekstran 70.000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
Kaynaklar
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272(2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
