Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için

Mide-bağırsak sisteminin intestinal epitelyal bariyer Yetişkin bir insanda, 400 ^m2'de yaklaşık mukozal yüzey alanıdır. Sonuç olarak, sürekli mikrop, yutulan ilaç, besin ve bakteriyel toksinler karşı maruz kalmaktadır. ev sahibi sadece tolere ortakçı bakteri ve potansiyel patojenler arasında ayrım olmamalıdır, ama aynı zamanda besinlerin emilimini sağlarken, epitel bariyerini geçen bu türlerin ve salgılanan molekülleri engellemek gerekir. Bu nedenle, bağırsak epiteli rolü lümen içeriği ¹ için seçici bir bariyer olarak hareket etmektir. Bu kurucu ve uyarılabilir mekanizma ² oluşan bir yanıt biyolojik sistem yoluyla hareket mukozada doğuştan gelen epitel savunma sistemi tarafından, kısmen, elde edilir.

Epitelyal bariyer işlevinin kaybı gastrointestinal hastalıkların bir dizi özelliği olan bir patolojidir. In vivoepitelyal bariyer fonksiyonunun incelenmesi bir izleme molekülünün oral sonda ve sonraki serum analizi ³ ile değerlendirilebilir. Ancak, bu teknik bariyer disfonksiyonu siteye hiçbir gösterge sunar. In vitro ve Transwell sistemlerini ³ kullanılarak sırasıyla odaları ^4,5 Ussing transepitelyal direnci ex vivo değerlendirmede, yaygın epitelyal bariyer fonksiyonunun taşıyıcı belirteç olarak kullanılan, ancak hayvan modellerinde ⁶ katkıda hastalık fizyolojisini yoksundur. Bu protokolde düzeylerde bir dizi mukozal bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek bağırsak bütünlüğü ve doğrudan ve lokalize değerlendirmesini sağlayan bir ex vivo doku hazırlama modeli açıklanmaktadır. Önemli olarak, bu teknik, hastalığın hayvan modellerinde de uygulanabilir, veya farmakolojik olarak mukozal bariyer işlev bozukluğu derinliği sorgusunda izin vermek için manipüle edilebilir.

Bu protokol tüm hayvan çalışmaları prosedürleri onaylı Newcastle Hayvan Etik Kurulu Üniversitesi'ne sıkı sıkıya bağlı kalmanın ile yapılır.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

1. 37 önceden sıcak Ortam 199 (TC199) veya Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ortamı ° C. Ön oxygenate% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile köpüren ile orta. Orta 7.3 bir son pH değerine sahip olduğunu kontrol edin.
2. Her kese için iki adet 5 cm bölümleri keserek dikiş hazırlayın. Döngü kapatılmamış bir düğüme dikişler.

2. Diseksiyon ve gastrointestinal sistemde hazırlanması

1. Ötenazi önce katı gıda 12 saat çekin. İstenirse, bu süre içinde besin jel takviyeleri hayvanları yerleştirin.
2. sodyum pentobarbiton aşırı dozda fareler öldürülür ([200 mg / kg], karın içinden enjeksiyon) kurumsal etik proto uygun olarak servikal dislokasyoncols karın ve göğüs üzerine% 70 etanol sprey ve.
3. Bir makas kullanarak, karın ortasında yatay bir kesi yapmak ve periton maruz kalmaktadır.
4. ayırmak ve pilor sfinkter de mideden üst ince bağırsak kesme ve anal eşiğinde kalın bağırsak keserek gastrointestinal sistem kaldırmak için devam edin. yavaşça mezenterin kaldırmak için bir forseps kullanın. Önceden ısıtılmış, oksijenli bir ortam içinde bağırsak yerleştirin.
5. Bağırsak bölümünde tespit geçirgenlik (Şekil 1) için değerlendirilir ve bağırsak geri kalanından bilgilerini bu bölümü kesilecek.
   1. , Hayvanlar arasında tutarlılığı korumak mide duodenum ve jejunum göreli bölümleri ölçmek ve çekum kolon ve ileum göreli bölümleri ölçmek için.
   2. Doku bölümleri seçerken, örneğin Peyer yamaları olarak mukoza ile ilişkili lenfoid doku varlığı not edin. Bu küçük nod olarak tanımlanabilirlümenin serozal tarafında ules.
   3. 1 ml şırınga kullanarak, yavaşça önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) bir petri çanağı içine barsak segmenti luminal içeriği yıkayın. Bu dışkı içeriği atılan veya saklanabilir -80 istediğiniz gibi gelecek analizi için ° C.

Bağırsak Sacs 3. hazırlanması

1. test bileşiği veya molekül bir 300 ul hacim ile 1 ml şırınga hazırlayın. mukoza bütünlüğü, FITC Dekstran M.Wt. bir 1 mg / ml solüsyon için 4.400 kullanılabilir. 4,400-70,000 Da büyüklüğü arasında değişen Probes artan hassasiyet için kullanılabilmektedir. Güvenli şırınga üzerine küçük bir hayvan damar kateteri uygun.
2. barsak segmentinin açılması 5 cm ölçün ve segmenti kravat güvenli bu noktada bir dikiş-döngü ile kapattı. Yavaşça bağırsak açılışında etrafında önceden bağlı dikiş-döngü yerleştirin ve küntleşmiş kateter yerleştirin. bağırsak segmenti güvenli şekilde kapalı kement çekinve tüm çözüm enjekte edilir sağlamak, bağırsak içine şırınga 300 ul hacmi bırakın.
3. Aynı anda bağırsak kesenin kapanmasını sağlamak için dikiş ilmeği çekerken yavaşça kateter kaldırın. bağırsak gevşek bağırsak kese kesin ve 37 ısıtılmış oksijenli ortam, 20 ml ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içine yerleştirmek ° C.

Geçirgenlik 4. Ölçümü

1. ısıtılmış su banyosunda bağırsak keseleri içeren yer konik tüpler 37 ayarlanır ° C. 0, 30, 60, 90 ve 120 dk zaman noktalarında, her bir durumda taze ortam 100 ul hacim değiştirerek, 96 oyuklu bir plaka, konik tüp ve transfer 100 ul numune alın.
2. son örnek alındıktan sonra, mukozal yüzeyi açığa sütür noktasında ve segmentin uzunluğu aşağı açık keselerini kesti.
3. Her bağırsak parçasının uzunluğunu ve genişliğini ölçün. desi isekırmızı, çıtçıt -80 ° C'de kesimleri ve mağaza dondurmak Moleküler Yöntemler RNA stabilizasyonu çözelti içinde protein veya biyokimyasal analizler, ya da seçenek olarak, deposu için ° C.
4. 1 ilâ 1 x 10 ^-6 kadar FITC etiketli moleküller için log dilüsyonlarda bir standart eğri oluşturmak.
5. Bir floresan plaka okuyucu üzerinde FITC için numuneleri ölçün ve standartlar, FITC uyarma / emisyon: / 519 nm 495 nm.

Her Bireysel Bağırsak Sac için görünen geçirgenliği 5. Hesaplama

1. sn zaman birimlerini dönüştürün.
2. Her bir zaman noktası için, kümülatif konsantrasyon, S hesaplanması
   
   Q _{t =} (C _t * V _r) + (Q _{t toplamı} * V _ler), Nerede:
   
   Q _{t =} t zamanındaki kümülatif konsantrasyon
   C _{t =} t zamanındaki Konsantrasyon
   Alıcı tarafında V _{r =} Hacim
   Önceki tüm Q _t Q _{t toplamı} = Sum
   V _{s =}Cilt örneklenmiş
   
3. Arsa süresi (T) karşı Q ve eğimi hesaplamak: δQ / ¨t
4. Belirgin geçirgenliği hesaplayın (P _uygulaması)
   
   P _{app =} (δQ / ¨ t) / (A * Co), Nerede:
   
   bir doku = Konum
   Cı ₀ = Başlangıç ​​konsantrasyonu

Bu protokol, mide-bağırsak hastalığının hayvan modellerinde intestinal bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler incelemek için kullanılabilir. Gastrointestinal sistemin 7 değişen alanlarında mukozal yüzeyi boyunca paraselüler prob akışı ölçülerek, epitelyal sıkı bütünlüğü değerlendirilebilir. Buna ek olarak, boyut (Şekil 2) ya da hidrofob (Şekil 3), epitelyal pertürbasyon derecesi ya da mukoza jel tabakasının bütünlüğünün paraselüler prob doğasını değiştirmek suretiyle de ölçülebilir. Daha büyük molekül ağırlıklı işaretleyiciler uygulayan bu transepitelyal elektrik direnci (TEER) halinde elektrofizyolojik ölçümlerle anlaşılacaktır olmayabilir gizli değişiklikleri tespit edilmesi, mukoza paraselüler geçirgenliğinin daha hassas bir sorgulama için sağlar, fakat paraselüler taşıma izin vermek için yeterli olacaktır (Şekil 2). Mucosal inflamasyon normalde örter ve epitel arayüzü koruyan koruyucu mukus jel bir goblet hücrelerinin kaybı ve azalmasına yol açabilir. Hidrofobik problar kullanılarak, bağırsak mukus jel tabakası bütünlüğü de (Şekil 3) incelenebilir. Buna ek olarak, bölgesel bariyer bütünlüğü farklı bağırsak alanlardan bağırsak keseleri özel hazırlık yoluyla incelenebilir. Bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler, hastalığın farklı hayvan modellerinde içinde değişebilir ve sondaların oral gavaj ve daha sonra, serum tahlile göre, böylece, bağırsak keselerinin kullanımı, intestinal bariyer fonksiyonunun bir lokalize değerlendirmesi (Şekil 4) sağlar.

Murin gastrointestinal Şekil 1. diyagramı. Bir C57BL / 6 faresinin mide bağırsak yolunun şematik bir mide tO anüs. ince bağırsak kavşaklar kolayca makroskopik ayırt edilemez ve tutarlı örnekleme fare varyasyon için fareyi aza indirmeye yardımcı olur. Bağırsak keseleri oluşturmak amacıyla, pilorik sfinkterin bir 5 cm kademeli bir uzak duodenum içerecektir. çekum proksimal uzanan 10 cm uzunluğunda ileum içerecek. Kalan ince bağırsak doku jejunum temsil eder. Rektum kolon 8 temsil çekum uzanan, kalan kalın bağırsak ile anüs 2 cm proksimalinde yer almaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2.   FITC Dextran'ın moleküllerin büyüklüğü bağımlı parasellüler taşıma kontrol ve DSS kolit anima epitel mukozasında rağmenLS. Bağırsak keseler 10 gün hastalığın seyri DSS farelerin kolon hazırlanmıştır. Keseler 120 dakika boyunca ölçülmüştür FITC Dekstran geçirgenliği marker 1 mg / FD-4 (MW 4,400 Da) ml çözelti, FD-20 (MW 20.000 Da) ya da FD-70 (70,000 Da) ve akı ile yüklendi. Sağlıklı hayvanlar uyumlu Yaş kontroller olarak kullanılmıştır. N = 5, N. başına 2 teknik çoğaltır ** p <0.01, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3 :. Hidrofobik bileşiklerin bariyer bütünlüğünü mukoza-jel tabakasının etkisi. Bağırsak keseler 10 gün hastalığın seyri DSS farelerin kolon hazırlanmıştır. Sağlıklı hayvanlar uyumlu Yaş kontroller olarak kullanılmıştır. Negatif mukus jel kontrolü için, bağırsaklar10 mM N-asetil sistein (NAC) (bağırsak 5 cm başına 300 ul hacim) ile yüklendi ve 37 ° C'de inkübe edildi 15 dakika boyunca C ° ve keseler hazırlandı önce taze ortam ile temizlendi. Keseler 120 dakika boyunca ölçülen 1 mg / ml FD-4 çözeltisi (MW 4.400 Da) ve akı ile yüklendi. N = 3, N. * p <0.05 başına 2 teknik çoğaltır, ** p <0.01, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. bağırsak iltihabı murin modellerinde FD-4 bağırsak bölge geçirgenliği. Bağırsak keseleri sağlıklı hayvanlarda DSS hayvan veya antibiyotik kaynaklı dysbiosis (AID) hayvan jejunum, ileum veya kolon hazırlanmıştır. Keseler 1 mg FD-4 / ml solüsyon ile yüklendi (MW 4.400 Da) ve flux 120 dakika boyunca ölçtü. N = 3, N. * p <0.05 başına 2 teknik çoğaltır, ** p <0.01, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.