Yöntem makalesi

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

13.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53268

⸱

13 Kasım 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, floresan işaretli nanopartiküllerin doğrudan canlı hücrelerde endositozundan sonra hücre içi gen ekspresyonunun saptanmasına izin veren yeni bir tekniği tanımlamaktadır. Yöntem, hücrelerin manipülasyonunu gerektirmez ve hedef gen veya türe göre sınırlı değildir.

Özet

Somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPS) yeniden programlanması, fare, sıçan, insan, domuz ve diğerleri dahil olmak üzere farklı memeli türlerinde başarıyla gerçekleştirilmiştir. iPS klonlarının doğrulanması, esas olarak farklı pluripotent genlerin endojen ekspresyonunun saptanmasına dayanır. Bu genler çoğunlukla hücre çekirdeğinde bulunan transkripsiyon faktörlerini temsil eder. Geleneksel olarak, endojen ekspresyonlarının kanıtı, hücrelerin fiksasyonundan sonra immünohistokimyasal boyama ile sağlanır. Bu yaklaşım, daha sonraki deneyler için doğrulanmış klonları korumak için bu erken aşamada her klonun çoğaltılmış kültürlerini gerektirir. Mevcut protokol, hücre içi gen ekspresyonunun doğrudan canlı hücrelerde floresan ile değerlendirilmesine izin veren gene özgü nanopartiküllerle bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Nanopartiküller, hedef mRNA'yı tamamlayan bir diziyi taşıyan bir yakalama zincirine bağlı merkezi bir altın parçacığının yanı sıra söndürülmüş bir raportör zincirinden oluşur. Bu nanopartiküller aktif olarak endositoza uğrar ve hedef mRNA, daha sonra floresan oluşmaya başlayan raportör ipliğin yerini alır. Bu nedenle, spesifik hedef gen ekspresyonu doğrudan mikroskop altında tespit edilebilir. Ek olarak, yayılan floresan, akış sitometrisi ile belirli bir geni eksprese eden hücrelerin tanımlanmasına, izolasyonuna ve zenginleştirilmesine izin verir. Bu yöntem, hedef hücrelerde herhangi bir manipülasyon yapılmadan doğrudan kültürdeki canlı hücrelere uygulanabilir.

Giriş

2006 yılında, yeni bir yaklaşım pluripotent haline somatik hücre yeniden programlamak için tarif edilmiştir. Potansiyel yeniden programlama bir dizinin prescreening sonra murin fibroblast başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücreler (IPS) Retroviral transdüksiyonun dört transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile sözde dönüştürülmüş olabilir faktörleri (Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc) 1. Daha sonra, bu teknik, etkili bir şekilde, insanlarda 2, maymunlar 3, sıçan 4, köpeklerde 5, koyun ve domuz 6 7 de dahil olmak üzere, farklı memeli türlerinin somatik hücreler kullanılarak yeniden. Buna ek olarak, protokoller atlayarak ya MYC 8, 9 yayınlanmış c- potansiyel onkojenik transkripsiyon faktörünü yerine güncellenmiştir.

Ne olursa olsun, ilk yeniden programlama büyüyen kolonilerin gerçek pluripotency, zahmetli ve zaman alıcı bir görev onaylanmalıdır yaklaşım. Önemli bir dezavantajıBu analizlerin büyük bir çoğunluğunun canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilemez olmasıdır. Örneğin Oct4, Sox2 NANOG ya Rex1 olarak kurulan pluripotense faktörleri çekirdeğinde bulunan transkripsiyon faktörlerini temsil eder ve algılama RT-PCR analizi için 10 immünohistokimya veya hücre parçalama öncesinde hücrelerin tespit gerektirir -. 12 Bundan sonra, bu hücreler, gelecekte kaybolur Her koloninin çoğaltmak kültürleri gerektiren deneyler.

Bu nedenle, canlı hücreler üzerinde pluripotensini analiz etmek için bir teknoloji arzu edilmektedir. Çeşitli yaklaşımlar gerçekten de membran bazlı antijenlere karşı antikorlar kullanılarak canlı hücreler üzerinde doğrudan ifa edilebilir (örn., TRA-1-60, SSEA4) 12, floresan özellikle embriyonik kök etiket alkalin fosfataz 13 ya da küçük moleküllerin tespit boyalar bildirilmiştir (ES) ve iPS hücreleri 14. Ancak, antikorlar yine olumsuz hücreleri ve her meth etkileyebilirod tek pluripotense işaretleyici ile sınırlıdır. Son olarak, floresan molekül işaretleri, hücrelerin canlı boyama sağlar hairpin yapılar, çift-antisens oligonükleotidler, 15 tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, çok sayıda genin tatbik edilebilir olmasına rağmen, teknik, artan iPS koloniler için geçerli değildir, tek bir hücre süspansiyonu, nucleofection gerektirir.

Bir kaç yıl önce gen spesifik nanoparçacıklarının SKBR3 meme kanseri hücreleri 16 survivin ekspresyonunu analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu el yazması altın nanoparçacık konjugatlarında kullanımı yoluyla canlı ES ve iPS hücreleri pluripotency işaretçileri tespit için yeni bir yenilikçi bir yaklaşım anlatılmaktadır. Bu nanopartiküller tamamlayıcı RNA dizisi ve bir Cy3 etiketli muhabiri teli taşıyan bir birleştiğinde yakalama sarmalı ile merkezi altın parçacık oluşur. Raportör telinin flüoresan sinyal merkez altın parçacığı ile söndürülür. Buna ek olarak, uygun birnanopartiküller olarak negatif ve pozitif kontroller, sırasıyla (Şekil 1) hizmet vermektedir. (Şekil 3) bir uygulama için, nanopartiküller, sadece kültür ortamı (Şekil 2) ilave edilir ve endositoz vasıtasıyla hücrelere girmek. Hedef RNA ifade edilirse o zaman bir floresan sinyal yayan muhabiri strand değiştirir. Bu yöntem, hedef hücre, hedef genin ifade manipülasyon canlı hücreler direkt olarak bir floresan mikroskobu altında optik olarak izlenebilir gerektirmez. Bundan başka, teknik iPS hücrelerinin durumunda türler arasında arzu edilen herhangi bir hedef gene uygulanabilir ve böylece birçok farklı alanlarda, kullanılabilir. Son olarak, akım sitometri Cy3 pozitif hücrelerin belirlenmesi ve zenginleştirme izin analizleri.

Protokol

Ortam, Reaktifler ve hücre kültürü koşullarının hazırlanması 1.

  1. İnsan HEK 293 embriyonik böbrek hücreleri
    1. DMEM / Ham F-12 ortamı içinde kültür HEK 293 hücreleri (CRL-1573, ATCC),% 5 FCS, L-glutamin (2 mM), penisilin (100 U / ml) / streptomisin (100 ug / ml) ile takviye edilmiştir.
    2. Hücrelerin geçişi için, bir kez PBS ile yıkama hücreleri% 0.05 tripsin / EDTA ilave ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin. 15 ml'lik bir tüp içine hücreleri aktarın, 1200 rpm'de (300 x g) ve 5 dakika boyunca santrifüj yeni bir T25 kültür şişelerinde içine yaklaşık 5x10 5 hücreleri transferi.
  2. Murin embriyonik fibroblastlar (MEF'ler)
    1. Tek tek 6-çukurlu bir% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 1 saat süre ile oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. Oda sıcaklığında sıvı aspire ve mağaza kullanıma kadar.
    2. DMEM kültür MEF'ler% 10 FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukoz (4.5 g / l), sodyum piruvat (1 mM), penisilin (100 U ile takviye /jelatin kaplı 6-yuvalı plakalar üzerinde ml) / streptomisin (100 ug / ml).
    3. 6-iyi tabak içine MEFS dağıtın ve onları izdiham kadar büyümesine izin verin. 2.5 saat hücreleri yakalama için mitomisin (5 ug / ml) eklenir. Orta aspire tam MEF orta ile iki kez hücreleri yıkayın ve her 6-kuyu için 3 ml MEF orta ekleyin. Bu hücreler sıçangil ve domuz iPS hücrelerinin için bir besleyici tabaka olarak görev yapar.
  3. Fare ES ve iPS hücrelerinin kültürü
    1. % 15 FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukoz (4.5 g / l), MEM gerekli olmayan amino asitler (1X), β-merkaptoetanol (0.1 mM) içeren DMEM ortamı takviyesi, fare ES kültür ortamı hazırlamak ve lösemi önleyici faktörü (1,000 U / mL).
    2. Serumsuz DMEM ile bir kez büyümesi durdurulmuş MEF'ler 6-kuyu durulayın 2 ml fare ES orta ve murin iPS hücreleri (konfluent çanak hücrelerin% 20) ekleyin. Her gün yıkama hücreleri, bir sefer serumsuz DMEM ile 2 ml taze fare ES ortamı ilave edin.
    3. Hücreler geçit için iyi serum serbest DMEM ile bir kez her yıkayın, 0 ekleyin0,25% tripsin / EDTA ile yıkandı ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin. 1200 rpm'de 5 dakika boyunca 15 ml tüp, santrifüje Aktarım hücreleri (300 x g) tekrar süspansiyon 500 ul fare ES ortam içinde hücreler ve bir yeni bir 6-2 ml fare ES ortamına süspansiyon 100 ul MEF besleyici katmanlı.
  4. Domuz Kültür hücreleri iPS
    1. Domuz iPS ortamı hazırlamak için, ek DMEM / Ham F-12 ortamı içinde% 20 nakavt serumu, L-glutamin (2 mM), MEM gerekli olmayan amino asitler (1X), β-merkaptoetanol (0.1 mM), penisilin (100 ile U / ml) / streptomisin (ug / ml 100 ug). 2 ila 3 hafta boyunca 4 ° C 'de, 0.22 uM filtre ve mağaza üzerinden filtre. İlk kullanımda, bFGF (10 ng / ml son konsantrasyon) ilave edin.
    2. Serumsuz DMEM / Ham F-12 ve 1.5 ml ilave pik iPS orta ve domuz iPS hücrelerinin (konfluent çanak hücreleri 10%) ile bir kez büyümesi durdurulmuş MEF'ler 6-kuyu durulayın. Serumsuz DMEM ile bir kez her gün yıkama hücre / Ham F-12 ve eklemek 1.5 ml taze domuz iPS ortamı.
    3. Ayrışma tamponu% 2.5 tripsin, kollajenaz IV (10 mg / ml), Ca2 + içermeyen PBS nakavt serumu (20%) ve CaCl2 (1 mM) ekleyin hazırlamak. PBS ile iki kez yıkanır ve hücreler 37 ° C'de 5 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 ayrışma tamponu ile inkübe edin. 1200 rpm'de (300 x g) 5 dakika boyunca 15 ml tüp, santrifüje hücreleri aktarın.
    4. 500 ul taze domuz iPS ortamında domuz iPS hücrelerini yeniden süspanse ve MEF besleyici tabaka ile taze 6 kuyuda 1.5 ml domuz iPS ortamına süspansiyon 50 ul ekleyin. Her gün yıkama hücreleri bir kez serum serbest DMEM / Ham F-12 ve ekleme 1.5 ml taze domuz iPS orta.
  5. İnsan iPS hücrelerinin besleyici içermeyen kültür
    1. 4 ° C 'de bazal membran preparatı ihtiva eden orjinal şişe çözülme ve sonraki kullanıma kadar -20 ° C' de buz soğukluğunda serumsuz DMEM / Ham F-12-8 mg / ml, kısım ve mağaza seyreltin.
    2. Bazın bir kısım Çözülmemembranda 4 ° C'de hazırlanması ve buz soğukluğunda serumsuz DMEM / Ham F12 (90 ug / ml) ile seyreltilir. Pipet 1 3 cm'lik kültür tabakları içine bu solüsyonu ve tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olmak için hafifçe karıştırılır. En fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de parafilm ve mağaza ile yemekleri Seal. Hücre kültürü için kullanımdan önce bazal membran preparasyonu polimerizasyonunu sağlamak için 37 ° C sıcaklıkta 30 dk ya da oda sıcaklığında 3 saat boyunca yemekler inkübe edin.
    3. Tabaklardan aspire ortamı bazal membran ile kaplanmış ve serum içermeyen DMEM / Ham F-12 ile iki kez yıkanır. Kültür çanağı ve insan iPS hücrelerinin (konfluent çanak hücrelerin% 10) 1.5 mi E8 orta ekleyin. Her gün yıkama hücreleri, bir sefer serumsuz DMEM / Ham F-12 ve 1,5 ml ilave taze ortam ile E8.
    4. Hücrelerin geçişi için, iki kez PBS ile yıkayın ve yemekleri 1 ml PBS / 0.5 mM EDTA ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yemekler inkübe edin. Bir mikroskop altında hücrelerin izleyin. Not: koloniler ve appe kadar yuvarlak başladığınızdaar onlar transferi için hazır delikler var.
    5. , Sıvı aspire hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri 1.5 ml E8 orta ekleyin ve ayırmak. 15 ml'lik bir tüpe transfer hücreleri, 1200 rpm'de (300 x g) 5 dakika boyunca santrifüj 500 ul ortam içinde tekrar süspansiyon E8 ve bazal membran preparasyonu ile kaplanmış bir taze kültür tabağına 1.5 mi E8 ortamına süspansiyon 50 ul .

Türler Sınır Ötesi Hedef-dizilerin 2. Tasarım

  1. Seç referans insan, fare ve hedef genlerin (GAPDH, Nanog, GdF3) ve domuz cDNA dizileri ve CLUSTAL çok sekans hizalama analizi gerçekleştirmek.
    Not: Bu türler arasında homolog dizileri gösterecektir.
    1. Aşağıdaki çoklu uyum için ayarları kullanın: (sabit) boşluk cezası 10, boşluk cezası (değişen) 5, geçiş ağırlıklandırma 0, boşluk ayırma cezası aralığı 8, gecikme 40% özdeşlik, yineleme sayısı 3 gerçekleştirmek için.
  2. Prob tasarımı ve imalatı üreticiler (Malzeme Tabloya bakınız) istenen hedef dizileri gönderin.
    Not: Üretici, sonra teknoloji ile istenen dizinin uyumluluğunu teyit edecektir. İstenilen dizi uyumlu değilse, imalatçı alternatif dizileri önerecektir.
    1. Potansiyel yakalama büküm dizileri 27 bp'lik bir uzunluğa sahip olarak kullanılabileceğini homolog bölgeleri sağlanması.
      Not: Sadece gerçek hücresel deneme bireysel dizisinin işlevselliği kesin bir kanıt verecek şekilde seçilmiş bir hedef genin farklı yakalama ipliklerini ile birkaç nanopartiküller sipariş tavsiye edilir. Üç farklı nanopartiküller Nanog ekspresyonunu değerlendirmek için test edildi iken Bu nedenle, GAPDH ve Gdf3 için iki farklı sekanslar değerlendirildi. Onların konumu ve tam dizileri yerde 17 yayınlanmıştır. Üretici ticari nanop üretmektediristenen dizileri ile eşyalar ve liyofilize biçimde sağlamaktadır.

3. Nanopartiküller Sulandırma ve Hücre Kültürleri ile eklenmesi

  1. Karanlıkta 4 ° C'da aldıktan sonra liyofilize nano partikülleri saklayın.
  2. 100 nM'lik bir son konsantrasyon verir 50 ul iki kez damıtılmış su eklenmesi ile nano-tanecikleri sulandırın. Bir kez karanlıkta oda sıcaklığında saklayın nanopartiküller yeniden. Not: Bu koşullar altında, en az bir yıl stabildir. 4 ° C'de yeniden örneklerin depolama olumsuz yönde stabilitesini etkileyebilir.
  3. Uygulama günde 2 (HEK 293 hücreleri) ya da 8 nM (iPS ES hücreleri) bir konsantrasyona PBS ile nanopartikül stok solüsyonu önceden seyreltin. Not: Bu konsantrasyon kültür kaplarına nihai konsantrasyon daha yüksek 20-kat fazladır. ES hücreleri ve iPS hücreleri, nanopartiküller 400 pM mikroskop altında kolayca algılanabilir bir flüoresan sinyal neden olmuştur. HEK 293 hücreleri için, AC100 pM bağlı yoğunlaşma yeterlidir.
  4. Bir 24-yuvalı içeren 237,5 ul tam hücre kültür ortamına önceden seyreltilmiş nanopartiküller pipetleyin 12,5 ul. Farklı boyutlarda kuyuları, buna göre hacimleri ayarlayın. Nanopartiküllerin eşit dağılımını sağlamak için dikkatlice plaka girdap. Nemli bir atmosferde CO 2 37 ° C'de gece boyunca (O / N) hücreler inkübe ve% 5.
  5. Flöresanlı bir mikroskop altında - Bir sonraki gün 546 nm'de (640 nm emisyon 575) bir eksitasyon dalga boyu ile gen spesifik Cy3 floresan için hücre kültürleri analiz eder. Not: hücre tipine ve hedef gen bağlıdır yeterince güçlü bir floresan elde etmek için gerekli süreyi. Bu deneylerde, bu sonda uygulamasından sonra 16 ve 20 saat arasında görülmüştür.

Akış Sitometrisi ile 4. Kimlik Cy3 Olumlu Hücre popülasyonları

  1. HEK 293 veya bölüm 1.1 veya 1.3 belirtilen koşullar kullanılarak fare ES hücreleri, r büyütünespectively. Öncesinde, FACS analizi için bir günlük ES hücrelerinin murin 293 hücreleri (Şekil 6A) ve 400 uM'de Hek için farklı konsantrasyonlarda GAPDH-spesifik nano partikülleri ekleyin. Nemli bir atmosferde CO2, 37 ° C'de hücreler O / N inkübe ve% 5.
  2. Flöresanlı bir mikroskop altında gen spesifik Cy3-kaynaklı floresan için hücre kültürleri analiz edin.
  3. Nokta 1.1.2 altında belirtilen HEK 293 hücreleri ayırın. Santrifüj, 200 ul buz gibi soğuk PBS /% 0.5 BSA / 2 mM EDTA (FACS tamponu) içinde bir 1.5 ml tüp ve tekrar süspansiyon haline aktarın. Akım sitometri analizi kadar buz üzerinde koyu hücreleri tutun.
  4. Nokta 1.3.3 altında belirtilen fare ES hücreleri ayırmak. Santrifüj, 200 ul buz gibi soğuk PBS /% 0.5 BSA / 2 mM EDTA, 1.5 ml tüp ve tekrar süspansiyon haline aktarın. Akım sitometri analizi kadar buz üzerinde koyu hücreleri tutun.
  5. Propidyum iyodür hücresi toplanmasını önlemek ve eklemek için bir 30 uM filtre boyunca hücrelerin basın (2 ug / ml nihai konsantrasyon) 2 dakikaFACS analizi öncesinde ölü hücreleri hariç.
  6. İlk FSC-A / SSC-A alt kümesi üzerinde hiyerarşik kapılarını set Cy3-pozitif hücrelerini analiz etmek, FSC-H / FSC-W-alt kümesi ve SSC-H / SSC-W alt kümesi. Hücre enkaz ve dağınık olmayan hücreleri hariç ileri ve yan dağılım kullanın. PE-Texas Kırmızı karşısında PE görüntüleyen kendi propidium iyodür boyama ile ölü hücreleri hariç. Cy3-PE pozitif hücreler üzerinde nihai sıralama kapısı gerçekleştirin (Şekil 4).

Sonuçlar

Nano-tanecikleri kullanılarak canlı hücrelerde spesifik gen ekspresyonunun hücre içi algılama kontrol ve kurmak için bir birinci girişimde insan HEK 293 hücreleri bir yapıcı şekilde tanımlanmış bir ev tutma gen (GAPDH) kullanılarak pilot deneyler yapmaya karar verdik. Bu deneylerde kullanılan nano-taneciklerinin konsantrasyonu imalatçının tavsiyelerine göre seçildi. O / N inkübasyon (Şekil 5A) sonra, flöresanlı bir mikroskop altında görünür Bu hücrelerde net bir Cy3-floresan kaynaklı 100 uM nihai konsantrasyonda kültür ortamına bir GAPDH spesifik sonda eklenmesi. İki kontrol sonucu kanıtlamak için bu deneylere dahil edilmiştir. Bir kontrol raportör şerit, memeli ya da ökaryotik hücrelerde eşleşen bir sekansa sahip olmayan bir sözde "karıştıran" nanoparçacık içerir. "Kapış" nanoparçacık spesifik plan flüoresan belirlerolası prob bozulma veya floresan eksik soğutmadan dolayı ce. Karıştıran probu ilavesi ihmal edilebilir bir marjinal flüoresan sinyal (Şekil 5B) gösterdi. Bir sürekli fluoresan "uptake" kontrol farklı hücre tipleri arasında değişebilir endositoz ile nano-tanecikleri dahil hücre yeteneğini belirlemek için yardımcı olur. Bu pozitif kontrol parçacıklar HEK 293 hücreleri (Şekil 5C), parlak bir flüoresan sinyal üretti. Bu nedenle, ihmal edilebilir bir arka plan sinyali ile bir hücre içi genin özel bir flüoresan sinyal kaydetmek için teknolojinin fizibilitesi doğrulandı. Bu arka plan sinyali ve belirli bir floresan arasındaki fark, zaman içinde azalır belirtmek gerekir. Belirli floresan yavaş yavaş (Şekil 5D) soluyor ise bozulmasına ya da eksik söndürme soruşturma nedeniyle arka plan artar. Aynı GAPDH -spesifik nanopartiküller varfaregiller, domuz ve koyun kökenli 17 primer fibroblast kültürlerinde test edilmiştir. Hedefe özel flüoresan muhtemelen bu kültürlerin nispeten düşük çoğalma kapasitesi, oldukça zayıf ise, bu hücreler, HEK 293 hücreleri daha çok daha yüksek bir arka plan sinyalinin üretilmesi.

Bu pilot deneyler, farklı türlerden elde edilen iPS olarak pluripotency gen ifadesinin tespiti için bu teknolojiyi kullanmak için bize istenir. Bu amaçla, Nanog ve Gdf3 pluripotent hücreler 18 ifade edilebilir olduğu bilinmektedir, her ikisi de incelenmiştir. Bir Nkx2.5 kalp güçlendirici transgenik fare hattı 19 kuyruk ucu fibroblastlardan alınan ilk iPS hücrelerinin de incelenmiştir. Güçlü bir flüoresan sinyal elde edildi her iki gen (Şekil 6A) ve karıştırmak kontrol ihmal edilebilir bir Cy3-floresans için (veriler gösterilmemiştir). Benzer sonuçlar, insan ve domuz iPS hücreleri (Şekil 6 elde edilmiştirB ve C). Önemlisi, floresan sinyali iPS kolonilerine sınırlı idi ve fare ve domuz iPS (Şekil 6A ve C okları bakınız) bir besleyici bir tabaka olarak kullanılan fibroblastlar etiket vermedi. Nanog gen ifadesinin analiz de silico tahmin değil, her dizi nihayet fonksiyonel "iyi" olarak ortaya koymuştur. Benzer bir sonuç insan ve domuz kaynaklı iPS hücrelerinin elde edildi sıçangil iPS hücrelerinin bir 100% sekans takımı (Şekil 6D). Rağmen, karıştırmak kontrolünkine benzer hemen hemen hiçbir fluoresan sinyali indüklenen Nanog-spesifik nanopartiküllerin üç tasarımlardan biri de Bu prob ile (veriler gösterilmemiştir). Bu durumda, nanotanecikler, her bir dizayn sondanın işlevsellik daha önce değerlendirilmesi gereken süre türler sınırlar arasında pluripotense gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilir.

In situ umut verici sonuçlarHücre kültür tabaklarında canlı hücre markalama akış sitometrisi ile niceliksel olarak gen ekspresyonunu analiz etmek için istenir. Bu amaçla, GAPDH-spesifik nanopartiküller, hedef hücre popülasyonu içinde etiketleme etkinliğini karşılaştırmak amacıyla 293 tek tabakaları Hek için kademeli konsantrasyonlarda ilave edildi. Flüoresans mikroskopisi ile değerlendirilen zamanda gelişmiş bir Cy3-indüklemeli fluoresans nanopartikülleri almadı hücreleri ile karşılaştırıldığında en düşük konsantrasyon ile görüldü. Nanopartiküllerin artan konsantrasyonları in situ (Şekil 7A) 'de HEK 293 hücreleri, bir açık, konsantrasyona bağımlı floresans neden olmuştur. Bir akış sitometrik analizi bu hücrelerin tabi tutulması, konsantrasyona bağımlı etiketleme etkinliğini teyit etmiştir. Nanopartiküllerin en yüksek konsantrasyon (Şekil 7B) uygulandığında, Cy3 pozitif hücrelerin sayısı anlamlı (yedi kat daha daha fazla) artmıştır. Nkx2.5 kalp ile ilgili başka deneylerde ES hücrelerigüçlendirici transgenik fare hattı 19 akış sitometrisi ile pluripotense genlerin ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. Pozitif alımı kontrol 400 pM ile pilot deneyleri mikroskop altında açıkça Cy3 pozitif canlı ES koloniler vermiştir ve sitometri Cy3 pozitif hücrelerin (Şekil 7C) neredeyse% 40 tespit akış. Buna karşılık, tedavi edilmemiş hücrelere benzer karıştırmak lekeli pozitifliği ile işlenmiş hücrelerin yaklaşık% 0.1 (veriler gösterilmemiştir). Benzer şekilde, GAPDH, Nanog ve Gdf3 özel nanopartiküllerin ilave işlemi, hücre kültür kaplarına ayrı ayrı koloniler belirgin bir floresan sinyalini bağlı. Akış sitometrisi ile belirlendiği gibi GAPDH Cy3 pozitif hücrelerin frekansı, her iki pluripotense geninin (Şekil 7C) oldukça benzer olmuştur. Nanog ve Gdf3, aynı zamanda, pluripotent ES hücrelerinde yapısal olarak ifade olduğu düşünülmektedir Bu sonuç, beklenebilir. Bu nedenle, bu veriler, indiBelirli bir geni ifade eden hücreler, akış sitometrik tarafından tespit edilebilir ka nitelik ve bunların nispi miktarı ile analiz eder.

figure-results-1
Şekil 1: Nanopartiküller Yapısı şematik gösterimi. Bir gen spesifik nanopartikül (A) yapısı. (B) Sinyal Değiştirme nanopartikül (negatif kontrol). (C) Alım nanopartikül (pozitif kontrol). Wiley izniyle, Lahm ve ark., 17 uyarlanmıştır.

figure-results-2
Şekil 2: Nanopartiküller Uygulama Kültürler Cell nanopartiküller Düzgün seyreltilmiş solüsyon sadece kültür ortamına pipetlenir.. O sonra / N kuluçka gene özel floresan hücreler af altında görülebilen luorescent mikroskop.

figure-results-3
Şekil 3:. Endositoz yoluyla Hücrelerinin Nanopartiküller Aktif Alım (A) Hücreler aktif endositoz ile nanopartiküller yutmak (B) Hedef mRNA yakalama sarmalına bağlanır ve floresanlama muhabir değiştirir..

figure-results-4
Şekil 4: Akım Sitometrisi için Yolluk Stratejisi. (A) Strateji fare ES hücreleri için HEK 293 hücrelerinden. (B) Strateji için. Veriler fare ES hücreleri için HEK 293 hücreleri veya aygıt 2 için cihaz 1 kullanılarak elde edildi ve daha sonra, bir yazılım aracı (Malzeme Tablo) ile analiz edilmiştir.

/53268fig5.jpg "/>
Şekil 5:., HEK 293 hücrelerinde GAPDH -Anlatım analizi bir GAPDH-spesifik nanopartikül 100 pM (son konsantrasyon) hücrelere ilave edildi ve floresan O / N kuluçkalamadan sonra kaydedilmiştir (A) GAPDH-spesifik nanopartikül (B.. ) Sinyal Değiştirme (negatif kontrol). (C) Alım (pozitif kontrol). (D) karıştırmak ve içeri alma kontrol kinetiği. Floresans GAPDH-spesifik nanopartiküllerin ilave edildikten sonra belirtilen zaman noktalarında belirlendi. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir.

figure-results-5
Şekil 6:. Farklı Türlerin 400 uM'de hücrelere ilave edildi NANOG ya Gdf3 için Nanopartiküller Belirli iPS Hücrelerinde pluripotensin Gen İfade Analizi (nihai concentration) ve floresan O / N kuluçkalamadan sonra kaydedilmiştir. (A) murin iPS hücrelerini. (B) İnsan iPS hücrelerini. (C) domuz iPS hücreleri. (A) ve (C) 'de oklar etiketlenmemiş fibroblast besleyici katmanlı hücreler işaret etmektedir. Murin iPS hücrelerinin (D) Floresan Nanog-tasarım SF3 nanopartikül eklenmesinden sonra. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir.

figure-results-6
Şekil 7: Nanopartikül Etiketli Canlı Hücreler Sitometrisi ile Belirlenen edilebilir. Akış sitometrisi ile tespit Cy3 pozitif hücrelerin (A) 293 hücreleri nanopartiküller farklı konsantrasyonlarda ilave edildikten sonra Cy3 pozitif HEK mikroskopik görünüşüdür. (B) Frekans. (C) fare ES hücre kolonilerinin canlı boyanması ve Cy3 pozitif frekansının belirlenmesi Hücreler. Nanopartiküller ilave edildi400 pM'lik bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Ölçek çubukları 50 uM temsil etmektedir.

Tartışma

Bu çalışma, doğrudan bir floresan mikroskobu altında çeşitli histogenetik kökenli farklı memeli türünden canlı hücrelerde hücre içi gen ekspresyonunun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlar floresans etiketli nanopartiküller kullanımını tarif eder. Bu yaklaşım, diğer yayınlanmış yöntemlere kıyasla avantajları bir çift vardır. Tüm araştırmacı ilk hedef gen ya da hücre tipi, ya ayn sınırlı değildir. Tüm antikor bazlı algılama yöntemleri, tek bir epitop ile sınırlıdır. Floresan moleküler işaretçileri de genlerin geniş spektrumunun için tasarlanmış olsa da, bu yöntem, hücrelerin ve daha sonra nucleofection 15 ayrılmasını gerektirir. Bunun aksine, gene özgü nanoparçacıkların uygulaması etkin endositoz ile nano-tanecikleri engulfs hedef hücrenin herhangi bir şekilde değiştirilmesine gerek yoktur. Daha sonra Pasajlanması sırasında altın parçacıkları yavaş yavaş hücreleri ayrılıp kültür downstrea kullanılabilirm deneyleri.

Bununla birlikte, teknoloji de hala bazı sınırlamalar vardır. Bazı belirteçler sayesinde böyle SSEA-1 veya TRA-1-81 20 olarak karbonhidrat doğaya açıkça tespit edilebilir değildir. Şu anda, nanopartiküllerin büyük bir dizi ticari olarak temin edilebilir. Bu parçacıklar, hücresel deneylerde işlevleri açısından test edilmiş olan. Mevcut çalışmanın amacı türlerinin sınırların ötesine kullanılabilecek özel problar tasarım oldu. Yeni bir hedef gen biri için bir prob tasarlarken böyle bir yaklaşımı takip ya da ne zaman silico bir işlevselliği probu iyice in vitro değerlendirilmesi gereken tahmin farkında olmak zorundadır. Nanog-SF1 tek sıçangil eşleşmeyen tabanı ve domuz dizisi ile güzel bir floresan sinyal üretti ise dizi homoloji% 100 homoloji göstermiştir Nanog-SF3 sonda hiç işe yaramadı. Başka bir soru nanopartiküller verimli alımı anlamına gelir. Parçacıklar girmekendositoz nanopartiküller 21 büyüklüğüne etkilenir bir proses ile hücrelerin, hücre tipi ve farklılaşma durumu 22 ve hücresel kabiliyeti phago- gerçekleştirmek ve 23 makropinositoz etmek. Tatmin edici bir floresan sinyalini elde etmek üzere optimum konsantrasyonu, her bir uygulama ya da bir hücre hattı için test edilmesi gerekir. Bu amaçla, ilk deney, her zaman hedef spesifik gen ifade algılama geçmeden önce hücre tipleri ve kültür koşulları içindeki sondaların uyumluluğunu değerlendirmek için alım kontrolü uygulama olmalıdır.

Yeni bir hücre kuşağına bu protokolü uygulanır veya hücre popülasyonunun uygun kontroller dahil olduğunda, kritik bir nokta güvenilir sonuçlar elde edilmiştir. Şimdiye kadar floresanlama alım kontrolü nanopartiküller konsantrasyonları, hedef hücre popülasyonunun yeterli bir floresan sinyali uyardığı bir ipucu sağlayacaktır. Floresan değerlendirilmesi gerekird sinyali olarak ertesi gün süre ile 17 kaybolacak. Aynı zamanda, aynı konsantrasyonda uygulanmıştır ökaryotik genomunda benzeri yok karıştırmak kontrol ihmal edilebilir bir arka plan sinyalini neden olmalıdır. Üçüncü bir kontrol olarak, bir bir ev bakıcısı geni için spesifik nanoparçacık (örneğin, GAPDH, β-aktin) kullanımı tavsiye edilmektedir. Bu yaklaşım, nanopartiküller seçilen bir hedef hücre popülasyonuna spesifik gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilecek bir pozitif kontrol olarak hizmet etmektedir. Bu kontroller açarsanız tatmin edici bir başka hedef genlerin özel nanopartiküller kullanılarak güvenilir özgü flüoresan sinyalleri elde etmek için bekleyebilirsiniz. Bu hedef sekans 24 aşağı regüle ettiği gösterilmiştir olarak tatbik nano-taneciklerinin konsantrasyonu kritik olabilir. Bununla birlikte bu etki burada (400 pM) sunulan deneylerde kullanılan konsantrasyonlarda çok daha yüksek konsantrasyonlarda (5 nM) gerektirir. Bu konsantrasyonda nanofla Atres hedef genin mRNA ya da protein seviyelerinin ve HEK293 ve sıçangil ES hücreleri 17 proliferasyonunu bozmaması 2 nM kadar yüksek konsantrasyonlarda etkilemez. Buna ek olarak, bir tüm genom ekspresyon analizi, gen ekspresyonu 25 herhangi bir önemli değişiklik göstermemiştir. Bu nedenle, 1 nM kadar olan konsantrasyonlarda nanoflares hiçbir önemli yan etkiler sergileyen olmamalıdır.

Bu teknolojinin bir çok umut verici bir uygulama, belirli bir gen ile işaretlenmiş herhangi bir belirli hücre popülasyonu etiket olasılığıdır. Son zamanlarda, gen spesifik nanopartiküller başarılı seçici canlı ventriküler miyositleri 26, melanom hücrelerinin 27 subpopülasyonunun leke kullanılmıştır, 28 ve serebellar hücre kültürlerinin 29 monositler. Bu floresan işaretli hücre popülasyonları kriteri gibi canlı hücreler, akış sitometrisi ile saflaştırılabilir. Onkoloji alanında, hayvan modellerinde canlı metastatik tümör hücreleri izole etmek için akla gelebilecek olanCEA kendi ifadesi, genleri veya hedef yapıları teşvik potansiyel metastaz arama için en değerli dayalı. Son zamanlarda, gerçekten yeniden programlanması sıçangil iPS koloniler tespit floresan yoğunluğu 17 göre Nanog-spesifik nanopartiküller ile yerinde tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, gerçekten yeniden programlanması iPS kolonilerin tanımlanması en umut verici koloniler belirlemek için robot floresens toplama cihazları kullanmak yüksek kapasiteli platformlarda yapılabilir. Bu teknoloji spesifik hücresel alt popülasyonlar seçmek için birçok araştırma alanlarında uygun gibi görünmektedir ve yüksek kapasiteli platformlarda nanopartiküller uygulamak mümkün görünmektedir. Sonuç olarak, bu protokol, canlı hücreler, doğrudan hücre içi gen ifadesinin algılanmasını sağlar floresans etiketli nano-tanecikleri kullanılarak yeni bir yaklaşımı temsil etmektedir. Bu teknoloji, bir, arındırmak genişletmek için değerli bir araç ve daha fazla karakter olabilirBirçok araştırma alanlarında nadir hücresel subpopülasyonunun ize.

Açıklamalar

HL ücretsiz Merck Corporation nanopartiküller aldı. Diğer tüm yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Lynette Henkel'e akış sitometrik analizinin gerçekleştirilmesindeki mükemmel desteği için teşekkür ederiz. Dr. Don Weldon ve Dr. Victor Koong'a (Temecula, CA) makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları ve faydalı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı, KR-3770-7/1 ve KR-3770-9/1 (M. K.), Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Deutsche Stiftung für Herzforschung ve Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie'den Dr. Rusche Research Grant 2014 hibeleri ile desteklenmiştir. ve Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A ve DZHK B 14-013SE (M. K.).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Stabil glutamin içeren DMEM/Ham'ın F12 ortamıBiochrome GmbHFG4815
Fetal buzağı serumuLife TechnologiesSV30160.03
Penisilin / Streptomisin (100x)MilliporeA2213
Sodyum piruvat (100x)Life Technologies11360-039
Stabil glutamin Biochrome GmbH ile DMEM yüksek glikozFG0435
Mitomisin CRoche10 107 409 001MEF'lerin hücre bölünmesini önler
MEM esansiyel olmayan amino asitler (100x)Yaşam Teknolojileri11140-050
b-MerkaptoetanolSigmaM3148
Lösemi inhibitör faktör (107< / sup> U / ml)MurinES ve iPS hücreleri için milipore ESG1107 büyüme faktörü, farklılaşmayı önler
%0,25 Tripsin/EDTA (1x)Life Technologies25200-056yapışık hücre kültürlerini ayırır
Nakavt serumInvitrogen10828-028insan ve domuz iPS hücre kültürü için takviye
bFGFve domuz iPS hücreleri içinPeprotech100-18B
Kollajenaz IVWorthingtonLS004188domuz iPS hücrelerinin ayrışması
MatrigelCorning,el yazmasında bazal hazırlama membranı olarak adlandırılan insan iPS hücrelerinin besleyici içermeyen kültürü için etkili bir yüzey
354277 E8 ortamıKök Hücre Teknolojileri05940
SmartFlare Problarıüzerinde insan iPS hücrelerinin besleyici içermeyen kültürü için tanımlanmış ortamEMD Millipore Corporation, el yazmasında nanopartiküller olarak adlandırılan canlı hücrelerde hücre içi gen ekspresyonununözelleştirilmiş ürün
Floresan mikroskobuZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 İnkübatörThermo Scientific51026282
Jelatin (domuz derisinden)SigmaG6144, MEF'lerin bağlanmasını artırır yüzeye
Propidium iyodür (1 mg / ml)SigmaP4864akış sitometrik analizlerinde ölü hücreleri etiketler
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544Şekil 4'te cihaz 1 olarak anılır
NaviosBeckman Coulter775213Şekil 4'te cihaz 2 olarak anılır
FloJo vX 10.0.7r2Akış sitometrisi verilerinin analizi içinTreestar
İnsan büyüme faktörü, Matrigel EDTA 0.5 M Invitrogen 15575-038 tespiti, , yazılımı

Kaynaklar

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gen Ekspresyon TespitFloresan Nanopartik llerCanl H cre AnaliziAk SitometrisiFloresan MikroskobiNanopartik l SenteziHedef mRNA TespitiPluripotens Mark rleriH cre K lt r nk basyonuFloresan Kantifikasyonu

İlgili makaleler