Yöntem makalesi

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

DOI:

10.3791/53271

⸱

10 Ağustos 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Sprague Dawley sıçan böbreklerinin, deterjanların vaskülatür yoluyla antegrad perfüzyonu yoluyla hücreden arındırılmasını tanımlar ve insan böbrek epitel hücreleri ile yeniden popülasyon için şablon görevi gören aselüler renal hücre dışı matrisler üretir. Büyümeyi izlemek için resazurin perfüzyon testinin yeniden hücreselleştirilmesi ve kullanımı, özel olarak tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörleri içinde gerçekleştirilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol aselüler, organ ölçekli doku gelişimi için küçük ölçekli modeli yüzeyler olarak yararlıdır henüz Biyofonksiyonel, böbrek hücre dışı matriks (ECM) iskelelerinin üretimi göstermektedir. Sprague Dawley sıçan böbrek bozulmamış sağlam, tüm böbrek iskeleleri elde etmek için 26 saat boyunca renal arter içine bir kateter sokulmasıyla kanül vasıtasıyla sokuldu ve düşük konsantrasyonlu deterjan (Triton X-100 ve sodyum dodesil sülfat (SDS)), bir dizi ile perfüze edilmiştir perfusable damar, glomerüller ve böbrek tübülleri. Decellularization takiben renal skafold özel tasarlanmış bir perfüzyon biyoreaktör kap içine yerleştirilir, ve buraya kateter sokulur renal arter oluşan bir perfüzyon devresine bağlanır: bir peristaltik pompa; boru; pH, çözünmüş oksijen ve basınç için isteğe problar. Perasetik asit ve etanol ve pH (7.4) balans iskele sterilizasyon işleminden sonra, böbrek skafold larg içinde kültür ortamının perfüzyon yoluyla tohumlama için hazırlanırE kapasiteli kuluçka CO2 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5. Kırk milyon renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreler fizyolojik bir orana akışını azaltarak önce 15 dakika için yüksek akış altında iskele (25 ml / dakika) ve basınçta (~ 230 mmHg) arasında renal arter yoluyla enjekte edilir ve hızlı bir şekilde perfüze edilir (4 mL / dakika). RCTE hücreler öncelikle, renal korteks içinde tübüler ECM niş doldurmak çoğalırlar ve perfüzyon kültür yedi gün boyunca tübüler epitel yapıları oluşturmak. Kültür ortamı içinde bir 44 uM resazurin çözeltisi tubulogenesis esnasında hücre canlılığı ve proliferasyonu, bir florometrik, redoks-kaynaklı metabolik bir değerlendirme sağlamak için orta değişimleri sırasında 1 saat böbrek içinden perfüze edilmiştir. Böbrek perfüzyon biyoreaktör biyokimyasal değerlendirme için ortamın non-invaziv örnekleme izin verir ve birden fazla giriş portları renal ven ya da üreter yoluyla alternatif retrograd tohumlama izin verir. Bu protokoller, bir böbrek iskeleleri recellularize için kullanılabilirBu sistem içinde hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için, vasküler endotelyum, tübüler epitel, stromal fibroblastlar, de dahil olmak üzere hücre tiplerinin çeşitliliği.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son dönem böbrek yetmezliği olan hasta sayısı artmaya devam ettikçe, transplantasyon için uygun donör böbreklerin sayısında ciddi ve büyüyen sıkıntısı yoktur. adayların sürekli artan sayıda talebi karşılamak için yetersizlik böbrek nakli için bekleme listesine talep üzerine 1,2, implante böbrek greft özelleştirilmiş gelişmekte nihai hedefi ile böbrek, organ mühendisliği araştırma yol açtı. Bir hastanın kendi hücrelerinden işleyen böbrek dokusunu Bina, yaşam boyu immünosüpresyon ihtiyacını ortadan kaldırmak hastaların böbrek nakli için bekleyen diyaliz harcadıkları zamanı miktarını azaltmak ve kronik böbrek hastalığı olan hastalara daha fazla hayat kurtaran nakli genişletmek istiyorum.

Hasta türetilmiş hücreler kullanılarak böbrek dokusunu biyomühendislik doğru ilk adım böbrek parankimi için destekleyici substrat olarak hizmet veren bir iskele geliştirmektir (örneğin boru şeklindeki epitheLIAL), stroma fibroblast ve vasküler hücre büyümesi. Doğal bir organ, hücre dışı matrislerin (ECM) elde edilen biyomalzeme iskelelerde doğal biyolojik bileşim içeren doku mühendisliği, içinde kullanım için arzu edilir hale getiren çeşitli özelliklere sahiptir; Uygun makro ve mikro fizyolojik fonksiyonu bağışlamak için; ve hücresel biyouyumluluk, hücre yapışmasını, göç, ve 3 biçimlenme yapıcı doku teşvik. Renal doku rejenerasyonu için iskeleler üretmek için bir umut verici bir yöntem, böbrek ECM 4 kompleks doğal protein bileşiminin çok korumak organın doğal mimari karışıklık korumak ve fleklinden ile ilişkili zorluğun üstesinden allojenik veya ksenogeneik böbreklerin decellularization geçer iskele recellularization 5 sonra gelişen hücrelere vasküler kaynağı sağlayarak kalın cellularized dokuların mühendislik kadar.

Perfüzyon decellularization bir işlem olupki deterjanlar, enzim ya da diğer hücre bozucu çözeltiler homojen organı 6 vasküler ağ üzerinden teslim edilir. Bu strateji atılan insan böbrekler 9'dan asellüler böbrek şablonlar gelişimi ile kanıtlandığı gibi, tüm organ mühendisliği 6-8 biyolojik şablonlar, (3D) üç boyutlu olarak asellüler organa tabanlı ECM ​​iskeleleri türetmek için verimli bir süreç olarak kurulmuştur ve büyük hayvan (örneğin, domuz 10, keçi 11) ve kemirgen kaynakları 12 elde ksenogeneik böbrekler. Özellikle, kemirgenler gibi küçük hayvan modellerin kullanımı daha az hücreleri ve kök hücre türevli dokuları ile olduğu gibi, hücre sayısı genellikle sınırlı olan organ Recellularization çalışmalar için özellikle yararlı olan kültür ortamı, gerektirir. tarif edilen decellularization protokolünün amacı, böbrek structur rejenerasyonu için 3 boyutlu bir iskele sistemi olarak kullanılan bir hücresel olmayan böbrek ECM üretmektirİnsan renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreleri ile mevcut örnekte yeniden doldurulur nefron tübüller dahil es. Daha önce daha hızlı olan bir optimum, deterjan bazlı sıçan böbrek decellularization protokolü 7, daha önce bildirilen diğer yöntemlere göre (yaklaşık bir gün) titiz değerlendirme tarif edildiği gibi (Ross ve ark .- 5 gün 12, Song ve ark .- 4.5 gün 13), ve daha önceki raporlarda 12-15 daha decellularization sırasında denatüran sodyum dodesil sülfat (SDS) oldukça düşük bir konsantrasyonda (% 0.1) organın ortaya koyar.

Bazı çalışmalar, sınırlı sayıda hücre yeniden popüle için 3 boyutlu bir iskele olarak decellularization ve daha sonraki kullanım için, kemirgen böbrek kullanımını tarif etmişlerdir 12-16 (başka yerde 1 incelenmiştir). Bu protokol, biz aselüler böbrek iskeleleri üretmek için bizim daha önce kurulmuş, optimum decellularization stratejisinin ayrıntılı bir açıklamasınıSprague Dawley sıçan böbreklerinde 7 den. Çift ekim ve bakım perfüzyon kültürünün 17 yetenekli özel tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörler kullanarak, sürekli bu decellularized matrislerdeki boru şeklindeki bileşeni yeniden doldurmanız çoğalırlar ve bir hafta boyunca perfüzyon kültüründe hayatta insan RCTE hücreleri ile asellüler böbrek iskeleleri recellularize. 17 çalışmaları önceden sitotoksisite için kullanılan ucuz, non-sitotoksik ve non-invaziv metabolik değerlendirilmesi - - zaman 7'nin üzerinde recellularized böbrekler içinde hücre canlılığı ve çoğalması bir gösterge sağlamak için Biz daha resazurin perfüzyon testinin bizim kullanımını göstermek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ETİK TABLOSU: hayvanlarla ilgili tüm işlemler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan kurallarına göre yapılmıştır.

1. Böbrek Decellularization

  1. Decellularization çözümleri hazırlayın. Her böbrek için ayıraç aşağıdaki hacimleri hazırlayın decellularized, artı bir ilave hacim için (örneğin, 4 böbrekler için, adım 1.1.3 için 5.000 ml Triton X-100 hazırlar.):
    1. 500 osmoz su (ROH 2 O) ters ml hazırlayın. Not: Alternatif olarak, iyondan arındırılmış su, ROH 2 O gösterilir adımda kullanılabilmektedir.
    2. ROH 2 O 1.000 ml Triton X-100,% 1 (h / h) hazırlanması Yavaş yavaş 10 ml Triton X-100, bir karıştırıcı plaka üzerinde hızlı bir şekilde karıştırılarak altında büyük bir beher içinde, su mi 990. Reaktif tamamen erimesi kullanımdan önce (en az 10 dakika) izin verir.
    3. 1000 ml Triton X-100,% 1 hazırlanması (h / h) ROH 2 O (Eylülarate hacmi).
    4. 1000 ml sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.1 (h / h) ROH 2 O. hazırlayın Yavaş yavaş bir karıştırma plakası üzerinde hızlı karıştırma altında büyük bir çanak içinde 995 ml suya, 5 ml SDS (% 20 stok çözeltisi) ekleyin. Reaktif kullanımı (en az 10 dakika) önce üniform karıştırmak için izin verin.
    5. 500 ml ROH 2 O (ayrı cilt) hazırlayın.
  2. Decellularization için böbreklerin hazırlayın.
    1. Daha önce 7 açıklandığı gibi bir erkek Sprague Dawley sıçan (250-300 gr) bir böbrek kurtarın.
      1. Pentobarbital intraperitonal enjeksiyonu (50 mg / kg vücut ağırlığı) sıçan anestezisi. Sıkça ameliyat sırasında solunum fonksiyon, kalp hızı ve ayak tutam tepkisini izleyerek anestezi derinliği (her 10-15 dakika) inceleyin. Hayvan yükseltilmiş solunum hızını veya pozitif pedal refleks varsa, pentobarbital (başlangıç ​​dozunun 1/4 1/3) bir ek dozunu.
      2. Uzunlamasına bir orta hat ABDOMİNAL gerçekleştirmel kesi böbrekler, abdominal aorta ve inferior vena kava ortaya çıkarmak.
      3. 2.000 USP Heparin Birimleri / penil ven içine kg vücut ağırlığı enjekte edilir.
      4. Nazik diseksiyonu hem böbrekleri Seferber. Sağlam böbreği çevreleyen böbrek kapsülü tutarken dikkatli, perirenal yağ böbreği ayırın. Infra, renal abdominal aort boyunca soğuk tuzlu su (10 mi) ile böbrekler serpmek.
    2. Sıkı arter kateteri ligate ve yavaşça, 10 ml soğuk fosfat-tamponlu salin (PBS) ile kan tamamen berrak organına sahip böbrek serpmek (bir şırınga kullanılarak) renal arter içine, 24 birimlik bir sonda yerleştirin.
    3. Yavaş yavaş decellularization kadar depolama için (böylece hücre parçalama indükleyici) organı dondurmak için -20 ° C derin dondurucuda bir Petri kabı ve mekân içinde 25 ml PBS içinde böbrek daldırın.
      Not: istenirse thi tarif olmasa da, üreter ve / veya renal ven de, retrograd tohumlama için kanül olabilirs protokolü.
    4. Tamamen (oda sıcaklığında (RT) dengelemek) donmuş böbrek çözülme ve yavaşça sızdırmazlığını bağlanan renal arter kontrol etmek için 10 ml PBS ile serpmek. Sızıntı veya önemli direnç gözlenirse, renal arter yeniden kateterize.
  3. Decellularization için ekipman hazırlayın. Şekil 1B 'de gösterildiği üzere decellularization perfüzyon sistemine monte edin.
    1. 1/16 "iç çapı (ID) silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, h)" (önerilir> 36), iki yeterli uzunlukta peristaltik pompa boru uzunluğu (Şekil 1D, f) "Bir 8 bağlayın. Luer boru kesimleri (Şekil 1D, j) katılmak için dişi Luer adaptörü x tek kadın katıldı 1/8 "dikenli adaptörleri iki erkek Luer kilidi kullanın. "Dikenli adaptörü 1/8 ek erkek Luer kilidi takın (Şekil 1D, c) böbrek eki için perfüzyon hattının aşağı ucunaarter kateteri.
    2. Büyük pompa kartuş kullanılarak 4-silindir pompa kafası her peristaltik pompa hortumu segmenti bağlayın.
    3. Birinci çözüm haznesinde (ROH 2 O) silikon kauçuk tüp memba ucunu yerleştirdikten sonra, çözüm ile tamamen başbakan her perfüzyon devresi "Başbakan" düğmesini basılı tutun. Kritik: kabarcıklar tüpün içinde sıkışıp kalması emin olun ve yukarıdaki ucu Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, reaktif rezervuarın sıvı-hava ara-yüzünün altına sabitlenir silikon kauçuk borudan (sol açık sıvı çekmek için) göstermektedir.
  4. RT 7 de decellularization protokolü gerçekleştirin.
    1. Hava kabarcığı kateter içinde sıkışıp kalan sağlamakla, pompadan aşağı perfüzyon devre tüpün sonuna kadar her çözülmüş böbrekte renal arter kateteri bağlayın. Böbrek boş 5 L'lik bir kap (perfüzat toplama haznesi iç duvarı boyunca süspansiyon haline izin ver, bakınız Şekilure 1B), böylece renal arter bükülmüş veya sarılır değildir.
    2. 5 ml / dak pompa sürücü ayarlayın ve "Başlat" düğmesine basın. Her böbrek organ altından çözümleri damla gözlemleyerek perfüze doğrulayın.
    3. Şekil 1A'da tarif edildiği gibi, aşağıdaki tepkin maddeler ile her bir böbrek serpmek
      1. 1 saat, 40 dakika / 5 ml, 500 ml ROH 2 O dakika serpmek.
      2. 3 saat, 20 dakika / 5 ml'de 1000 mi,% 1 Triton X-100 ile birlikte dakika serpmek.
      3. 16 saat, 40 dakika / 1 ml'de 1000 mi,% 1 Triton X-100 ile birlikte dakika serpmek.
      4. 3 saat, 20 dakika / 5 ml'de 1000 mi,% 0.1 SDS ile dk serpmek.
      5. 1 saat, 40 dakika / 5 ml, 500 ml ROH 2 O dakika serpmek.
        Not: her hücresizleştirilmiş böbrek kullanımdan önce iki haftalık bir süre için 4 ° C'de 50 ml konik bir tüp içinde (katkı maddeleri olmadan) PBS içinde depolanabilir.

2. OrtalamaRecellularization için füzyon Biyoreaktör Meclisi, Böbrek Sterilizasyon ve Hazırlık

  1. Biyoreaktör gemileri hazırlayın.
    1. Bulaşık deterjanı çözümleri (örn. Musluk suyunda% 1 bulaşık deterjanı çözelti) sulandırmak, sıcak cam biyoreaktör rezervuarları (vücut bileşeni) ve biyoreaktör başlarını yıkayın ve sonra musluk suyu ve ROH 2 O. ile iyice durulayın Bileşenleri tamamen kurumasını bekleyin.
    2. Her bir haznenin dibine reaktif silikonlama küçük bir hacmi (~ 5 mL) uygulanır. Daha sonra fazla sıvıyı boşaltmak, birkaç saniye, tüm alt yüzeyi ıslatır bu reaktif emin olun.
    3. Rezervuar RT O / N bir davlumbaz içinde kurumasını bekleyin. Seçenek olarak ise, rezervuar kurutma hızlandırmak ve cam biyoreaktör haznenin dibine hücrelerin bağlanmasını önlemek için kaplamanın, dayanıklılığını geliştirmek için, 30 dakika boyunca 100 ° C'de bir fırın içinde kurutulabilir.
  2. Sterilizasyon için perfüzyon devre elemanlarını hazırlayın (Şekil1D).
    1. (Her biri Bioreaktör olarak) boru aşağıdaki uzunlukları kesme:
      1. Kimlik silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, h) iki 25 "1/16 uzunlukları" kes.
      2. Peristaltik pompa hortumunun biri 8 "uzunluğunu kesin (Şekil 1D, f).
      3. Kimlik silikon kauçuk tüp, bir 4.25 "1/16 uzunluğunu" Kes.
      4. Kimlik silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, g) iki adet 1 "kalın duvarlı 1/16 uzunlukları" Kes.
      5. 1/4 'kimliği x 0,5' dış çap (OD) silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, e) biri 2 "uzunluğunu kesin.
    2. (Her bir biyoreaktör için) Aşağıdaki Luer adaptörü hazırlanması:
      1. 1/8 'dikenli adaptörleri 10 erkek Luer kilidi hazırlayın (Şekil 1D, c)
      2. 2 erkek Luer fişler hazırlayın (Şekil 1D, a)
      3. 2 dişi Luer kapaklar hazırlayın (Şekil 1D, b)
      4. 5 kadın Luer hazırlayınx dişi Luer adaptörleri (x5 Şekil 1D, d)
    3. Sıcak olan tüm boru ve Luer adaptörleri yıkayın bulaşık deterjanı çözümleri sulandırmak, musluk suyunda iyice durulayın ve ardından ROH 2 O ve kurumaya bırakın.
  3. Perfüzyon devrelerini birleştirin.
    1. Kayma 1 "biyoreaktör kafasına bağlı giriş Luer alıcısı üzerinde kalın duvarlı 1/16 'ID silikon kauçuk tüp uzunluğu. Hortumun açık ucunu 1/8 "ID diken adaptörü erkek Luer kilidi yerleştirin. Diğer giriş Luer alıcısı için tekrarlayın ve port (Bu protokol açıklanmayan üreter veya venöz tohumlama teknikleri yönelik) kapatmak için bir dişi Luer kapağı takın.
    2. 1/8 'Kimlik Diken ve dişi Luer x dişi Luer adaptörleri (Şekil 1D, j) erkek Luer kilidini kullanarak peristaltik pompa boru 8 "segmentine ID silikon kauçuk tüp her 25" 1/16 segmentinde "bağlayın.
    3. Silikon kauçuk Tubin bir açık ucunuBiyoreaktör kafasının dış ortam perfüzyon çıkışına örn. Biyoreaktör kafasının içindeki medya Perfüzat çıkışının karşısında (iç) tarafına kimliği boru 4.25 "1/16 uzunluğunu" bağlayın.
    4. Perfüzyon devre boru kalan açık ucuna 1/8 'kimliği dikenli adaptörü erkek Luer kilidi takın. Bir dişi Luer erkek Luer kilit dişi Luer adaptörü x bağlayın. Dişi Luer biyoreaktör üzerinde giriş Luer alıcısı giden açık erkek Luer kilit dişi Luer adaptörü x bağlayın. Bu Kateterize renal arter doğrudan önde gelen medya Perfüzat girişi olarak görev yapacak.
    5. Biyoreaktör kapağının üzerinde hiçbir bağlantı noktası açık bırakılır veya maruz emin olun. Sıkıca biyoreaktör vücut üzerinde vakum vanasını kapatın.
    6. Her bir bileşeni astar özdeş oluklar arasında sıkıştırılmış bir O-ring ile, rezervuar vücutta biyoreaktör kafasını takınız. Birlikte iki bileşeni tutmak için arayüzü üzerinden bir metalik kelepçe yerleştirin.
    7. 1/4 'kimliği x 0,5' OD silikon kauçuk tüp (Şekil 1D, e) 2 "uzunluğu kullanarak iki bileşen bağlayan, 0.2 mikronluk havalandırma filtresi ile biyoreaktör kafasına havalandırma portu takın. Boşaltma valfini açın.
    8. Biraz biyoreaktör kafasına kırmızı vidalı kapağını gevşetin.
    9. Bir otoklav kese ve mühür kalan Luer adaptörleri ve 6 "tırtıklı numune forseps yerleştirin.
  4. Monte biyoreaktörler ve erkek Luer fişleri otoklavlayın.
  5. (Hacimleri Decellularized böbrek başına listelenmiştir) ekim önce iskele sterilizasyon ve orta perfüzyon için aşağıdaki reaktifler hazırlayın:
    1. Bir çeker ocak içinde, bir 1 L şişe içinde ~ 957 mi ROH 2 O 2.56 mi perasetik asit çözeltisi (% 39 hazır konsantrasyon) ve 40 mL 200 derece etanol ekleyerek 50 mi% 0.1 perasetik asit,% 4 etanol solüsyon hazırlanır. Defalarca tersini şişe iyice karıştırın ve biyolojik güvenlik kabini yerleştirin.
    2. HazırlamakPBS çözeltisi 1 x 150 mi, otoklav ile önceden sterilize edilmiştir.
    3. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 50 ml DMEM / F12 ortamı ve% 1 penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda hazırlayın.
  6. Perfüzyon biyoreaktör montajı için kalan öğeleri toplayın. Biyolojik güvenlik kabini tüm öğeleri yerleştirin. KRİTİK: biyolojik güvenlik kabini, dijital pompa sürücü güç elektrik prizleri çalışma ile donatılmış olduğundan emin olun. Alternatif olarak, kabine dışında dış prizlere pompa sürücü bağlamak için bir uzatma kablosu kullanın.
    1. Decellularized böbrekler toplayın.
    2. Ekli perfüzyon devreleri ile Otoklavlanmış biyoreaktörler toplayın.
    3. Luer adaptörleri ve forseps içeren otoklavlanmış kese toplayın.
    4. Ekli 4-silindir kafası ile dijital pompa sürücü ve büyük pompa kartuşları (perfüzyon devresi başına 1) toplayın.
  7. Steril c Şekil 1C'de tarif edildiği gibi perfüzyon devresini tamamlamakbiyolojik güvenlik kabini içinde şartlarından.
    1. 1/8 'Medya Perfüzat girişinin yakınına kimlik tırnaklı adaptörü ve dişi Luer x dişi Luer adaptörü erkek Luer kilit arasındaki 3-yollu stopcock (Şekil 1D, i) bağlayın. Musluk açıkken üzerindeki her üç portları bırakın.
    2. Biyoreaktör baş ve pipet% 0.1 perasetik asit 50 mi, açıklık yoluyla orta rezervuar içine% 4 etanol çözeltisi kırmızı vidalı kapağı çıkarın.
    3. Büyük pompa kartuşu kullanarak pompa kafasına peristaltik pompa hortumu segmenti bağlayın. 5 ml / dk basın "Başlat" akış hızını ayarlayın ve başbakan için devre izin verir.
      1. Sıvı perfüzyon hattı doldurur ve üç yollu kalan açık liman ulaştığında, bir erkek Luer (Şekil 1D a) fiş kullanarak noktasını takın.
      2. Hava perfüzyon devresi tüp ya da giriş Luer alıcısı iç gözlenen kadar devre tamamen asal izin verin. Eğer necessary, perfüzyon hattından kabarcıklarını çıkarmak için geçici olarak akış hızını artırır. Tamamen astarlı, pompa sürücü dur.
    4. Dikkatle sterilize 6 "forseps kullanarak biyoreaktör kafasının iç yüzeyinde erkek giriş Luer alıcısı içine renal arter kateteri dişi Luer ucunu. Emin bağlantı sıkı ve hava kateter bırakılır emin olun. Renal arter bükmek veya kink kalmaması böbrek nazikçe, renal arter kateteri asmak için izin verin.
    5. Biyoreaktör rezervuar sıkıca kapatılmış böylece biyoreaktör kafası ve vücudu bir arada tutan metalik kelepçesini sıkın. Biyoreaktör kafasına kırmızı vidalı kapağını kapatın.
  8. 5 ml / dakika, 50 ml PBS ile oda sıcaklığında, 1 saat süre ile / 5 ml% 0.1, perasetik,% 4 etanol çözeltisi ile perfüzyon ile daha sonra üç sıralı 1 saatlik perfüzyonunu dakika oda sıcaklığında böbrekler sterilize edin.
    1. Çözüm değiştirme:
      1. 1 saat sonra, pompayı durdurun ve kırmızı vidalı kapağını açın. Bir ste kullanmarile (otoklav) Pasteur pipeti dikkatlice biyoreaktör hazneden çözümün tüm aspire. Tamamen astarlı perfüzyon devresini bırakın.
      2. Pipet biyoreaktör rezervuar içine taze bir çözelti, 50 ml vida kapağı kapatın ve pompayı çalıştırın.
  9. % 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile takviye edilmiş 50 ml DMEM / F12 ortamı içinde hazne ve pipet nihai PBS durulama, PBS aspire sonra. Vidalı kapağı kapatın ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde muhafaza eden geniş bir kapasiteli bir inkübatör bağlı perfüzyon devresi ile biyoreaktör aktarın.
  10. Gerekirse, inkübatör pompa sürücü aktarın. Pompaya biyoreaktör perfüzyon devresini bağlayın ve önceden tohumlama için en az 1 saat süreyle / dk 4 ml böbrekleri serpmek.

Renal Kortikal Tübüler Epitel Hücreleri 3. Böbrek Recellularization

  1. DMEM / F12 Sıcak yeterli miktarlar ve C (% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile takviye edilmiş)ell 37 ° C hücre kaldırma için enzim ayrışan. Önerilen hacimleri aşağıda listelenmiştir:
    1. 10 ml hücre dissociating enzim ve kaldırma için 175 cm 2 kültür şişelerinde başına 10 ml DMEM / F12 hazırlayın.
    2. Böbrek başına 5-10 ml DMEM / F12 hazırlayın numaralı seribaşı olan.
  2. Arzu edilen tohumlama konsantrasyonu kültür şişeleri yeterli sayıda kazan (4 x 10 7, bu tohum stratejisi kullanılarak RCTE hücrelerin maksimum engraftment böbrek sonuçlarına göre 18 insan RCTE hücreler immortalize).
  3. Hücre ayrıştıracak enzim kullanılarak şişelerinden asansör hücreleri. Şişeden orta aspire, sonra balona 10 ml hücre ayrışan enzim pipetle. 37 ° C inkübatör Yeri balon ayrışmasını hızlandırmak için.
  4. Şişe yüzeyinden hücrelerinin tam çözülme gözlemlenene kadar bir faz kontrast mikroskop üzerine her 2 dakikada bir balon kontrol edin. Not: İnkübasyon süresi hücrelerinin izdiham seviyesine bağlı olarak değişir, ancak RCTE hücreleri r olacakequire yaklaşık 15 dakika tamamen ayırmak.
  5. Peletleme öncesinde sayım için ayrışmış hücre süspansiyonu bir örnek alın. 5 dakika boyunca 232 x g nispi santrifüj kuvveti (RCF) eşit bir önceden ısıtılmış DMEM / F12 ortamı hacmi ve santrifüj ile bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir.
  6. Santrifüj sırasında hücreleri saymak. Sayımı bir hemasitometre her ucuna eşit bir tripan mavisi hacmine ve pipet 10 ul elde edilen örnek seyreltilir. İstenen tohumlama konsantrasyonu (2 x 10 7 hücre / ml) elde etmek için gerekli pelet seyreltme hacmi hesaplanır.
  7. Santrifüj işleminden sonra, 2 x 10 7 hücre / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için kültür ortamına uygun bir hacmi ile pelet seyreltin. 5 ml steril bir şırınga içine tohum süspansiyonu 2 ml hazırlayın.
  8. Biyolojik güvenlik kabini perfüzyon biyoreaktör aktarın. Tohumlama noktasına akışını kapatmak için musluk vana çevirin. Dan erkek Luer kayma fişini çıkarınmusluklar ve ekim süspansiyon yüklü şırınga bağlayın.
  9. Hızla geri inkübatör perfüzyon devresini transferi ve pompa kafasına peristaltik pompa hortumu segmenti sabitlemek için büyük pompa kartuşu kullanın.
  10. Hücre tohumlama: Pompanın doğru bakacak musluk vana bağlantı noktasını kapatın. Yavaş yavaş tüm süspansiyon musluk ve perfüzyon hattına şırınga aktarılır sağlanması, böbrek içine hücre süspansiyonu enjekte. Şırınga akışını kapatmak ve 15 dakika süreyle 25 mL / dakika ile pompayı çalıştırmak için musluk vanası getirin.
  11. 15 dakika sonra, / dakika 4 ml pompa akış hızını düşürmektedir. Değişim ortamı (100 mi sonraki değişiklikler hacim), ertesi gün ve bundan sonra her iki günde.

Resazurin Perfüzyon Testi kullanarak 4. Hücre Canlılığı Değerlendirilmesi ve Çoğalma

  1. Resazurin reaktifi hazırlayın. Karıştırma altında PBS, 100 ml 110.5 mg resazurin sodyum tuzu çözülür ve 5 ml ekleyerek 1:10 seyreltinTaze PBS 45 ml çözüm sonuçlanan 440 mcM resazurin stok çözümü oluşturmak için. (0.2 um şırınga filtresi kullanılarak) Filtre ile sterilize ve 4 ° C'de hafif bir korunan 50 ml konik bir tüp içinde stok çözeltisi saklayın.
  2. Resazurin-desteklenmiş medya kontrolleri hazırlayın. Kültür ortamı içinde resazurin reaktifi bir% 10 solüsyonu hazırlayın (örneğin. Stok çözeltisi + 45 ml kültür ortamı resazurin 5 mi) çalışma çözeltisi resazurin oluşturmak için kullanılır. Hafif bir korunan kapta resazurin çalışma çözeltisinin 10 ml'lik bir hacim otoklava. Not: Bu tamamen resorufine resazurin bileşik azaltacaktır ve yüzde resazurin azalma hesaplamak için bir pozitif kontrol olarak görev yapacak.
  3. Kısım 1 mi resazurin hazır çözelti (oksitlenmiş) her biri, ayrı ayrı 1.5 mi toplama tüpleri içine, tek başına (boşluk) çözeltisi (azaltılmış) ve kültür ortamını çalışma resazurin otoklavlanmıştır. Perfüzyon Biyoreaktörlerin aynı inkübatör açık tüpler yerleştirin.
  4. Böbrek perfüzyon aktarınbiyolojik güvenlik kabini için inkübatör devre. Pasteur pipeti kullanarak biyoreaktör hazneden biyoreaktör kafasından vidalı kapağı ve aspire kültür ortamı çıkarın.
  5. Pipet 10 rezervuar, yakın vidalı kapaklı içine çözümü çalışma resazurin ml ve geri inkübatör böbrek perfüzyon devresini aktarın.
  6. 4 mL / dakika Pompayı çalıştırın ve reaktif tam olarak 1 saat süre ile böbrekler yoluyla perfüze edilmesi için izin verir.
  7. 1 saat sonra, pompayı durdurun ve biyolojik güvenlik kabini için böbrek perfüzyon devresini aktarın.
  8. Klimalı (kısmen azaltılmış) resazurin çözümü toplayın ve biyoreaktör deposuna 100 ml kültür ortamı ekleyin. Aktarım perfüzyon devresi kuluçka ve (4 ml / dak) akışını devam ettirmek için.
  9. Pipet 100 ul (x 3 kopya), çalışma çözeltisi resazurin, çözelti resazurin durumunu çalışma çözeltisi otoklavlanmış ve kültür ortamı (opak) bir siyah içine boş bir 96 oyuklu bir deney plakası. (Excitat floresan yoğunluğu okuion: 540/35; emisyon: 590/20) bir spektrofotometre kullanılarak.
  10. Oksitlenmiş resazurin ortam tarafından üretilen floresan yoğunluğu (FI) ile normalleştirilmiş floresan yoğunlukları bir oranı olarak yüzde azalma hesaplayın (orm, ya da çözelti hücrelerine maruz kalmayan çalışma resazurin) veya orta resazurin indirgenmiş (RRM veya çalışma çözeltisi otoklav):% indirgeme = 100 x {[FI (klimalı resazurin çözümü) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Sonuçları normalleştirmek inkübasyon süresi (1 saat) ile hacmi (10 ml) ve bölme dolaştırarak% azalma çarpmak için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbrekler, sırasıyla deterjan çözeltileri, su ile perfüze edilmiş ve seyreltilmiş, önceden belirlenmiş optimal decellularization protokolüne göre (Şekil 1A, bkz B) 7 gibi, bir 26 saatlik bir süre içinde kademeli olarak daha şeffaf hale (Triton X-100,% 0.1 SDS,% 1) Şekil 2A'da gösterilmiştir. Elde edilen hücresiz böbrek skafold hücrelerinden yoksun ve perfüzyon protokolü takip hasarsız sağlam bir böbrek kapsülü tarafından desteklenen bir yapışkan böbrek ECM ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tarif edilen decellularization protokolü sürekli olarak vasküler endotel hücrelerinin 7,17 ilave olarak, (yakın ve uzak olan tübül-türetilmiş) insan renal kortikal tübüler epitel hücrelerin kültürü için 3 boyutlu bir şablon olarak hizmet veren bir tam hücresel olmayan böbrek ECM üretir. kanüle renal damar sistemi, böylece perfüzyon decellularization hücre ekim, uzun vadeli bir perfüzyon kültürü ve resazurin perfüzyon protokolleri sağlayan bir biyoreaktör kurulumu olan iskele boyunca reaktifler ve hücreler hom...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Zell Aile Vakfı'nın desteğine teşekkür eder. Northwestern Memorial Foundation Dixon Translasyonel Araştırma Hibeleri Girişimi, Amerikan Organ Nakli Derneği Cerrahı Fakülte Geliştirme Hibesi ve Illinois Ulusal Böbrek Vakfı'ndan Genç Araştırmacı için bir Araştırma Bursu'ndan destek alıyoruz. Robert R. McCormick Vakfı'nın desteğini kabul ediyoruz. Bu çalışma aynı zamanda NIDDK K08 tarafından JAW'ye DK10175 desteklenmiştir. Bu araştırma için kullanılan görüntüleme ve histoloji çekirdekleri, Fare Histolojisi ve Fenotipleme Laboratuvarı, Elektron Probu Enstrümantasyon Merkezi (EPIC) ve Northwestern Üniversitesi'ndeki Simpson Querrey Enstitüsü Ekipman Çekirdeği ve Kanser Merkezi Destek Hibesi (NCI CA060553) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, kemirgen böbrek alımları için Northwestern Üniversitesi Mikrocerrahi Çekirdeğine teşekkür etmek isterler. P30 CA118100 tarafından desteklenen Floresan Mikroskobu Ortak Kaynakta gerçekleştirilen reselülizasyon sonrası renal tübüler epitel morfolojisinin değerlendirilmesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler
TRITON X-100, Proteomik Sınıfı, AMRESCOVWRM143-4L
Sodyum dodesil sülfat çözeltisi, BioUltra, moleküler biyoloji için, H2O içinde %20Sigma-Aldrich05030
Perasetik asit çözeltisi, purum, asetik asit (RT) içinde ~ %39)Sigma-Aldrich77240Perasetik yanıcı ve aşındırıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (örn. eldiven, gözlük) kullanarak bir çeker ocak içinde hazırlanın.
200 geçirmez etanolVWRV1001TP
Sigmacote, cam ve diğer yüzeyler için silikonlaştırıcı reaktifSigma-AldrichSL2Biyoreaktör rezervuarlarının arıtılması için. Metinde silikonlaştırıcı reaktif olarak anılır.
DMEM / F12 medyaYaşam Teknolojileri11320-033
Corning cellgro Fetal Sığır Serumu Premium, MediatechCorning35-010-CV
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100X 10.000 IU Penisilin 10.000 ve mikro; g / mL StreptomisinCorning30-002-CI
TrypLE Express (1X), Fenol KırmızıYaşam Teknolojileri12605-028Metinde hücre ayrıştırıcı enzim olarak anılacaktır.
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Yaşam Teknolojileri15250-061
Resazurin sodyum tuzuSigma-AldrichR7017
Ekipman:
Masterflex L/S Dijital Sürücü, 600 RPM, 115/230 VACCole-ParmerEW-07522-20
Masterflex L/S 07519-05 ve -06 pompa kafaları için büyük kartuşlar.Cole-ParmerEW-07519-70Metinde büyük pompa kartuşu olarak anılacaktır.
Masterflex L/S 8 kanallı, 4 silindirli kartuşlu pompa kafası.Cole-ParmerEW-07519-06
Düz 6" numune forseps, tırtıklıVWR82027-438
*Böbrek perfüzyon biyoreaktörüWilMad Labglass*Özel tasarımlarBiyoreaktörler WilMad Labglass tarafından açıklandığı gibi üretilir. Tasarımlar daha önceki bir yayında derinlemesine açıklanmıştır.
Perfüzyon Devre Bileşenleri
24 G x 0.75 inç. BD Insyte Autoguard korumalı IV kateter (0,7 mm x 19 mm) BD Vialon biyomalzemeden yapılmıştır. Çentikli iğnesi vardır. (50/sp, 200/ca)BD Biosciences381412Metinde 24 gauge kateter olarak anılacaktır.
Masterflex PharMed BPT Borusu, L/S #14, 25'Cole-ParmerHV-06508-14Metinde peristaltik pompa borusu olarak anılacaktır.
Peroksitle Kürlenmiş Silikon Boru, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/paketCole-ParmerHV-06411-62Metinde 1/16" ID silikon kauçuk boru olarak anılacaktır.
Masterflex platinle kürlenmiş silikon boru, L/S 14, 25 ft.Cole-ParmerHV-96410-14Metinde kalın duvarlı 1/16" ID silikon kauçuk boru olarak anılacaktır.
VWR Silikon Boru, 1/4 "ID x 0.5" ODVWR89068-484
Acro 50 Havalandırma Filtreleri, Pall Life SciencesVWR28143-558Metinde 0.2 mikron havalandırma filtresi olarak anılacaktır.
Cole-Parmer Luer Adaptörleri, 1/8" ID'ye Erkek Luer Kilidi, Naylon, 25/pkCole-ParmerT-45505-11Metinde 1/8" dikenli adaptöre erkek Luer kilidi olarak anılır.
Cole-Parmer Luer Aksesuarı, Erkek Luer Fişi, Naylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-58
Dişi luer x dişi luer adaptörü, Naylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-22Metinde dişi Luer x dişi Luer adaptörü olarak anılacaktır.
Cole-Parmer Luer Aksesuarı, Dişi Luer Şapkası, Naylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-28
Smiths Medical Büyük Çaplı Hi-Flo Musluklar # MX4311L - Genişletilmiş Erkek Luer Kilitli 3 Hi-Flo Musluk, DEHP Olmayan Formülasyon, Lateks İçermez (LF), Lipid Dirençli, PVD Olmayan, 50/csCareforde Healthcare10254821Smiths Medical (satıcı) katalog numarası #MX4311L'dir.
Diğer Bileşenler
5 ml BD Luer-Lok tek kullanımlık şırınga, BD Luer-Lok & trade; uç.BD Biosciences309646
35 mm x 10 mm Kolay Kavramalı Kültür KabıBD Biosciences353001Hücre tohumlaması için hücre süspansiyonunu şırıngaya çekmek için kullanılır.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Etiketler

Renal H cre D MatriksDesel larizasyon ProtokolPerf zyon Biyoreakt rEpitelyal H cre EkimiKemirgen B brek skelesinsan Renal H creleriSterilizasyon S reciMetabolik De erlendirmeT b lojenez K lt rskele Resel larizasyonu

İlgili makaleler