Yöntem makalesi

Glioblastoma'nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

16.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53287

⸱

15 Ocak 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Bu makalede

Özet

GL261 glioma hücreleri, glioblastomun yararlı bir immünokompetan hayvan modelini sağlar. Bu protokolün amaçları, in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak intrakraniyal tümör büyümesini izlemek için uygun teknikleri göstermek ve glioblastom tedavisi için tümör immünolojisi ve immünoterapötik yaklaşımları incelemek için lusiferaz ile modifiye edilmiş GL261 hücrelerinin faydasını doğrulamaktır.

Özet

Yaygın olarak bildirilen insan glioma ksenogreft hayvan modellerinin aksine, GL261 murin glioma ksenogreftleri, insan hastalığının neredeyse tüm ilgili klinik ve histopatolojik özelliklerini özetler. GL261 hücreleri, sinjeneik C57BL / 6 farelerine intrakraniyal olarak implante edildiğinde, model, sağlam bir bağışıklık mikro ortamını koruma avantajına sahiptir. GL261 hücrelerinde lusiferazın stabil ekspresyonu, intrakraniyal tümör büyümesinin non-invaziv uygun maliyetli biyolüminesans izlemesine izin verir. Yakın zamanda, GL261 hücrelerindeki lusiferaz ekspresyonunun tümör büyüme özelliklerini, tümör hücresi immünomodülatör sitokin ekspresyonunu, immün hücrelerin tümöre infiltrasyonunu veya intrakraniyal tümörü taşıyan hayvanların genel sağkalımını etkilemediğini gösterdik. Bu nedenle, GL261 lusiferaz glioma modelinin yeni kemoterapötik ve immünoterapötik modalitelerin çalışmasında yararlı olabileceği görülmektedir. Burada, GL261 hücrelerinde stabil lusiferaz ekspresyonu oluşturma tekniğini ve biyolüminesans görüntüleme ile tümör hücrelerinin in vitro ve in vivo büyümesinin nasıl çalışılacağını bildiriyoruz.

Giriş

Malign glioma, insan beyninin en sık görülen ve en ölümcül tümörüdür. Maksimal cerrahi rezeksiyon, radyoterapi ve kemoterapi ile tedavi edildiğinde bile, majör beyin tümörü sevk merkezlerinde medyan sağkalım 15-20 ay kalır1, 2, 3. Malign gliomun en agresif formu olan glioblastom, mitotik figürler, neovaskülarizasyon, komşu beyne invazyon ve psödopalizan nekroz ile karakterizedir. İnsan beyin tümörü hücrelerini kullanan ortotopik beyin tümörü ksenogreftleri, nöro-onkoloji araştırmalarında önemli bir işleve hizmet etmiş ve insan klinik çalışmalarına girmeden önce yeni ajanların test edilmesi için klinik öncesi çeviriyi kolaylaştırmıştır. İnsan ksenogreft modellerinin çoğu insan hastalığının birçok özelliğini özetlerken, tüm insan tabanlı ksenogreft model sistemlerinde temel bir sınırlama, immün yetmezliği olan hayvanların kullanımıdır4.

Sağlam bir konak yanıtının olmaması, hem tümör morfolojisi hem de aşılama etkinliği açısından tümör büyümesini açıkça değiştirir. Ksenogreftli modellerden elde edilen sonuçların yorumlanmasında belirli varsayımlar kabul edilebilir olsa da, terapötik değerlendirme alanında ilgili sonuçlara ulaşmak bir zorluktur. İmmün yetmezliği olan ve immün yetmezliği olan hayvanlarda bazı temel biyolojik özelliklerin benzer olması muhtemeldir, ancak tümörle ilişkili inflamasyon, doku invazyonu, yaralanmaya yanıt gibi diğerleri muhtemelen çok farklıdır. Buna karşılık, GL261, immünokompetan sinjeneik C57BL / 6 farelerinin5 beyinlerine implante edildiğinde gliomu doğru bir şekilde özetleyen, kimyasal olarak indüklenen bir murin glioma hücre hattıdır. İnsan hastalığına benzer şekilde, intrakraniyal tümör büyümesi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde nörolojik semptomlara ve hayvan ölümüne yol açar6-10.

Deri altı tümör büyümesi doğrudan ölçülebilir. İntrakraniyal tümör büyümesi sadece hayvan kurban etme veya pahalı görüntüleme çalışmaları ile ölçülebilir. Lusiferaz enziminin kararlı ekspresyonu, non-invaziv ve uygun maliyetli intrakraniyal biyolüminesans görüntülemeye izin verir11. Lusiferaz transfekte edilmiş GL261 hücrelerinin biyolüminesansı, intrakraniyal tümör büyümesi ile iyi korelasyon gösterir. Yakın zamanda GL261'i lusiferaz modifiye GL261 hücreleriyle doğrudan karşılaştırdık ve in vitro büyüme ve invazyon, immünolojik sitokin profili, C57BL / 6 fareleri taşıyan intrakraniyal tümörün in vivo sağkalımı veya immün hücre infiltrasyonu açısından hiçbir fark göstermedik. Bu teknik, tümör büyümesinin non-invaziv izlenmesini içeren glioblastoma preklinik çalışmalarına uygulanabilir.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi tarafından onaylanmış ve steril koşullar altında yapılmıştır oylandı.

Ateşböceği Lusiferaz ifade Reporter GL261 1. Hücre modifikasyonu

Not: HİV-1 tabanlı bir lentiviral vektörler dalak odaklama oluşturucu virüsü (SFFV) promoterinin kontrolü altında ateşböceği lusiferaz (Fluc) ifade etmektedir. Optik haberci gen vektör plasmidinin pHRSIN-CSGW-dlNotI içine klonlanmıştır.

  1. 95 ihtiva eden nemli bir atmosferde 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş RPMI ortamında% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve GL261 hücreleri ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 293-T hücrelerini korumak % hava ve% 5 karbon dioksit (CO2).
  2. 293-T hücre kültürü, bir T-75 balon içinde% 80 konfluent ulaştığında, pH ile bir kez yıkama hücreleriosphate tamponlu salin Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın (PBS), bir şişe, hafif eğik tutarak, 5 ml pipet ile 5 dakika, öğüterek 37 ° C'de tripsin (% 0.05) ve 3 ml hücreleri inkübe ve hücreleri toplamak şişenin tabanından. 15 ml konik bir tüp içine tripsinize hücre süspansiyonu 3 ml transferi ve eti RPMI ortamı (hücre süspansiyonu, 10 ml toplam), 7 ilave edin.
  3. 5 ml'lik bir pipetten iyi bir hücre süspansiyonu karıştırın. Tüp hücre süspansiyonu 100 ul alın ve hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Bunu yapmak için, tripan mavisi çözeltisi 300 ul hücre süspansiyonu 100 ul karıştırın ve bir hemositometrede karışımın içine 2 ul yerleştirin. Mikroskop altında dört ayrı görünümler mavi lekelenme olmadan hücrelerin sayısını. Bu sayı 10 4 hücre / ml temsil gibi her görünümden hücre sayısını ortalama.
  4. Bu arada, 30 ° C'de bir hücre süspansiyonu ihtiva eden tüp santrifüj7 dakika için 0 xg. Ortamı aspire ve 1.0 x 10 6 / ml yoğunlukta GL261 hücre süspansiyonu yapmak için taze RPMI ortam maddesi ile hücre pelletleri tekrar süspansiyon. 27,5 ml DMEM (gün 1), bir T-175 şişesi içine RPMI ortamı 2,5 ml tohum 2.5 x 10 6 GL261 hücreleri.
  5. 24 saat sonra, 20 ml taze DMEM (gün 2) ile orta değiştirin.
  6. , Lentiviral vektör üretmek 5 dakika boyunca 2 ml serum serbest DMEM ile 54 ul transfeksiyon ayıracı karıştırmak için. Transfeksiyon reaktifi ile DMEM içinde Fluc (pSIN-Fluc) 3 gag-pol ug, veziküler stomatit virüsü G zarf (VSV-G) 3 ug ve 4.5 ug ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. 293-T şişeye (T-175), içine tüm bir DNA karışımı damla ve 48 saat (Gün 2)% 95 hava ve% 5 CO2 içeren nemli bir oda içinde 37 ° C'de inkübe edin.
  7. (3 gün) (yaklaşık 30 ml olmalıdır 293-T hücre kültür ortamında toplam hacmine) transfeksiyon sonrası 24 saat sonra, taze DMEM 10 ml ekleyin.
  8. Bir içine GL261 hücreleri bölmek için24-çukurlu plaka, hafif eğik bir balon tutarak, 5 ml pipet ile 5 dakika, öğüterek 37 ° C'de tripsin (% 0.05) ve 5 ml hücreleri inkübe Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın PBS ile bir kez yıkama hücreleri , şişenin dibine kadar tüm hücreleri toplamak ve adım 1.2 gibi hemasitometre yoluyla hücreleri saymak. Bu arada, 7 dakika boyunca 300 xg'de tüp santrifüj. Ortamı aspire ve 2.5 x 10 4 / ml yoğunlukta GL261 hücre süspansiyonu yapmak için taze RPMI ortam maddesi ile hücre pelletleri tekrar süspansiyon. Tohum 24 oyuklu bir plaka içerisinde RPMI ortam 1 ​​ml (3 gün) 2.5 x 10 4 GL261 hücreleri.
  9. 48 saat aşağıdaki transfeksiyonu 293-T şişesi (T-175) 10 ml pipet ile lentiviral süpernatant 30 ml toplayın ve 50 ml konik tüp içine süpernatant aktarın. Aspire 30 ml lentiviral 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek 50 ml şırınga ile yüzer madde, ve 1 ml alikotları (gün 4), viral supernatant kısım.
  10. R 1 ml değiştirinLentiviral süpernatan 1 ml ile GL261 hücre plakasına (24-çukurlu) PMI ortamı nemli bir bölmede (gün 4), 37 ° C'de inkübe edin.
  11. Lentiviral enfeksiyonun 48 saat sonra, taze, RPMI 1 ml (gün 6) ile orta değiştirin.
  12. 24 saat sonra, GL261 hücreleri (gün 7) lentiviral enfeksiyonu tekrarlanır.
  13. Lentiviral enfeksiyonun 2. 48 saat sonra, taze, RPMI 1 ml (gün 9) ile orta değiştirin.
  14. (GL261.luc hücreleri olarak ifade edilecek olan), lusiferaz değiştirilmiş GL261 hücrelerin büyümesine ve T-75 balonuna hücre kültürü genişletmek için devam edin.
  15. GL261.luc hücre kültürü, bir T-75 balon içinde% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, tripsinizasyon ile hücreler hasat ve adım 1.2 olarak hemositometre ile sayılır. Mezun yoğunluklarda bir 24-yuvalı plaka içine GL261.luc hücre plakası (1.0 x 10 6 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 hücre / çukur) ve Bir humidi 37 ° C'de inkübe3 saat boyunca bir% 95 hava ve% 5 CO2 içeren ğı odası.
  16. Hücresel lusiferaz aktiviteye ölçün biyolüminesans görüntüleme (Şekil 1) kullanılarak, U-87 MG (U87.luc) hücreler modifiye edilmiş lusiferaz için.
    1. Görüntü yazılımı başlatın (masaüstünde simgesini tıklatın) ve görüntüleme sistemi başlatmak (tıklayın lütfen "Başlatma"). Başlatma otomatik olarak başlayacak ve sistem check-up ve -90 ° C'ye kadar soğumasını kamera için birkaç dakika sürebilir.
    2. Her kuyuya 25 ul luciferase (D-Lusiferin, potasyum tuzu, 150 mg / kg) ekleyin.
    3. 10 sn için plaka, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca luciferase ve görüntü kuluçkaya bırakılır. Görüntüleme sistemi kurmak için, "Lüminesans", "10 sn" maruz kalma süresi ve "Orta" binning seçin. Görüntüleme istasyonunda 24-plaka koyun ve görüntüyü başlatmak için "Acquire" düğmesini tıklayın.
    4. Görüntü başarıyla elde edildikten sonra, bir görüntü penceresi ve takım pa göreceksinizEkranda lette. "ROI (ilgilenilen bölgeleri) Araçlar" ı tıklayın ve yarık simgesinden 6 x 4 seçeneğini belirleyin. 24 plaka görüntü üzerinde sinyal alanı kapsayacak ve ölçümler sekmesini (kalem simgesi) tıklayın 6 x 4 yırtmaçlı oluşturun. Cm kare (fotonlar / sn / / sr cm2) başına steradyan'dır saniyede fotonların birimi olarak ROI ölçümleri bir tablo ile bir pencere gözlemleyin.
    5. Kullanım U87.luc hücreleri, daha önce kalıt GL261.luc hücrelerde lusiferaz aktivitesinin değerlendirilmesi için bir kontrol olarak, GL261 modifikasyonu 11 burada kullanılan aynı lentivirüs ile değiştiirlmiştir.

In Vitro Proliferasyon Tahlili 2.

  1. GL261 ve GL261.luc hücre kültürleri, bir T-75 balon içinde% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, tripsinizasyon ile hücre çizgileri, her iki hasat ve aşama 1.2'de olarak kabul ve 1500 hücre yoğunluğunda bir 96-çukurlu plaka içinde plaka hücreleri iyi zaman ve pipetleme hataları en aza indirmek için çok kanallı pipet kullanarak başına RPMI ortamında 80 ul. Seed 20 kuyu toplam içine her bir hücre çizgisi. Hücreler tarafından doldurulan kuyularda buharlaşma sınırlamak için taze RPMI ortamında 100 ul ile boş kuyu doldurun.
  2. Kolorimetrik hücre çoğalma analizi kullanılarak hücre çoğalmasını değerlendirin. Burada MTS hücre proliferasyon deneyi kullanmaktadır. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hücreleri içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, MTS reaktifi 20 ul ekle.
  3. 3 saat boyunca bir% 95 hava ve% 5 CO2 içeren nemli bir oda içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin. Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 490 nm'de absorbansı ölçülür. Bu kaplama sonrası, 7 gün 1, 2, 4 tekrarlanan, ve. Absorbans değerlerini normalize etmek için, her gün değerleri günde 1 (Şekil 2) elde edilen karşılık gelen okumaları ile bölünür.

3. Tümör Hücre İmplantasyonu

Not: Tüm ekipman Otoklav. Bir dezenfektan (% 2 klorheksidin solüsyonu) püskürtülerek cerrahi alan hazırlayın ve absorben ile kapakt perdeler. Steril koşullar korumak ameliyat sırasında steril cerrahi eldiven giyin ve renk bantla iki bölüme cerrahi alan bölmek için. Alan 1 "Temiz" etiketli ve sterilize malzemeleri içerir; Alan 2 "Kirli" etiketli ve malzemeler kullanılır içerir.

  1. Hayvan Ameliyat öncesinde, intrakranyal enjeksiyon için bir hücre süspansiyonu hazırlamak. % 70 birbirine bağlı T-75 şişe tripsinizasyon ile ve adım 1.2 olarak hemasitometre ile hücre sayımı ve Ca2 + olmadan Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi içinde 1.0 x 10 5 hücre / ul bir yoğunlukta bir hücrelik bir süspansiyon hazırlamak ve Hasat hücreleri Mg + 2 (HBSS).
  2. % 0.9 salin içinde ksilazin ketamin 100 mg / kg ve 10 mg / kg ihtiva eden 200 ul karışımın peritoneal içi enjekte olan fareler anestezi. Uygun anesthetization onaylamak için, farenin ayak tutam. Fare tamamen anestezi altında, fare uyarıcıya cevap olmamalıdır.
  3. 0.1 m yönetmederi altı enjeksiyon yoluyla g / kg buprenorfın post-operatif ağrı gidermek için.
  4. % 2 klorheksidin solüsyonu batırılmış bir pamuk uçlu aplikatör ile makası ve temiz kullanan hayvanların başının üst Tıraş. Ameliyat sırasında yeterli yağlama sağlamak için göz merhemi sürün.
  5. Steril bir neşter kullanılarak parieto-oksipital kemiğin üzerinde yaklaşık 1 cm uzunluğunda sagittal bir kesi yapılmalıdır. Bregma görselleştirmek için,% 3 hidrojen peroksit çözeltisi batırılmış bir pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi silin.
  6. Bregma sağ ve sadece koronal sütür arkasında küçük bir delik 3 mm yapmak için steril 25-G iğne ile kafatası delin.
  7. Intrakranial enjeksiyon sahası kafatası 3 mm'lik bir derinliğe kadar olduğundan emin olmak için, makas kullanılarak 20 ul pipet ucu sivri ucunda 3 mm kesilmiş ve pipet bir şırınga içine yerleştirin.
  8. Önceden oluşturulan deliğe dik şırınga takın ve yavaşça tümör hücresi enjekte sus1 dakikalık bir süre boyunca 3 ul HBSS 3.0 x 10 5 hücreleri içeren emeklilik. Bir dakika yerinde iğne bırakın ve sonra yavaşça iğneyi çekin.
  9. % 3 hidrojen peroksit batırılmış pamuk uçlu aplikatörü ve% 2 klorheksidin çözeltisi ile kafatası bez. Pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi kurulayın. Boyutunda 3 yaklaşık 3 mm steril kemik mum kesip ve pamuk uçlu aplikatörü uç tarafındaki kemik mumu takın. Pamuk uçlu aplikatör ile deliği örtmek için kemik mumu uygulayın.
  10. Forseps kullanarak kafatası üzerinde birlikte kafa derisinde her tarafını çizin ve zımba yarayı kapatmak için. % 2 klorheksidin solüsyonu batırılmış bir pamuk uçlu yara temizleyin.
  11. Onlar ayakta hale gelene kadar ameliyat sonrası tüm fareleri Monitör ve normal aktiviteye saklayın. Tipik olarak, iyileşme süresi yaklaşık 30 dakikadır. Tam anestezi kurtarıldı kadar diğer hayvanlarla birlikte kafes fareler iade etmeyin.

4. GL261 Tümör Büyüme Biyoparlaklık Görüntüleme

  1. Temiz bir kağıt havlu üzerine dezenfektan bol miktarda (% 0.05 dimetil amonyum klorür çözeltisi) püskürtün. İyice hayvanlar cihaz ile temas halinde olacak görüntüleme odasının içine siyah levha, burun konileri ve bölücü silmek için dezenfektan batırılmış kağıt havlu kullanın. İyice temiz, kuru bir kağıt havlu ile tüm yüzeyleri silin. Bu kez daha tekrarlayın ve 5 dakika bekleyin.
  2. Adım 1.14.1 gibi görüntüleme istasyonu başlatılamıyor.
  3. Intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin / ksilazin 200 ul ve 100 ul luciferase (D-Lusiferin, potasyum tuzu, 150 mg / kg) ihtiva eden bir 300 ul karışımı ile fare anestezisi.
  4. Enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin ve fareler kuyruk kısma anestezi altında tamamen onaylamak. Görüntüleme sistemi kurmak için, "Lüminesans", "Otomatik" maruz kalma süresi ve "Orta" binning seçin. Görüntüleme stati fareler yerleştirinve görüntüyü başlatmak için "Acquire" düğmesini tıklayın. Enjeksiyondan sonra zaman her görüntüleme oturumu ile tutarlı olduğundan emin olun.
  5. Görüntü başarıyla elde edildikten sonra, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünmelidir. "ROI Araçlar" tıklayın ve daire simgesinden "auto" seçeneğini seçin. İB'leri tanımlamak için resmin üzerine sinyal alan kuşatmak ve daha sonra sr fotonlar / sn / / cm 2 birimi olarak ROI ölçümleri almak.
  6. Görüntüleme odasının dışına fareler alın ve onlar ayakta olana kadar fareler izlemek ve normal aktiviteye saklayın. Genellikle iyileşme süresi yaklaşık 15 dakikadır. Tam anestezi kurtarıldı kadar diğer hayvanlarla birlikte kafes fareler iade etmeyin.
  7. Hayvanlar, aşağıdaki semptomlar ile kadar haftada iki kez biyolüminesans görüntüleme tümör büyümesini izlemek: kilo kaybı (emplantasyondan önce ağırlık% 20'den fazla göreli kaybı), iştahsızlık (24 saat süre ile tam bir anoreksi) ve sürekli purposefu eksikliğionlar ötenazi gerektiğini hangi zaman nazik uyaranlara (kalkmak zayıf girişimi), l tepki. Servikal dislokasyon bir CO2 odası kullanılarak, bu belirtileri olan hayvanlar öldürülür.
    1. Yer ötenazi odasına fareler (kalabalık odasına yapmak) ve girişi 5-6 dakika CO 2 sıkıştırılmış. Tüm hayvanlar bilinçsizlik ve sonra yaklaşık 5 dakika nefes olmadığını gözlemleyin.
    2. Odasından dışarı fareler alın. Kalp Başparmak ve işaret parmağı arasında göğüs hissederek yenerek olmadığından emin olun ve hiçbir göz kırpma refleksi olup olmadığını kontrol edin.
    3. Düz bir yüzeye yüzükoyun pozisyonda fare kısıtlamaktadır ve baş parmağınız ve diğer yandan ilk parmağı ile kuyruk tek elle kafatası tabanındaki ensesini ve taban kavramak.
    4. Kafa dizginlemek ve hızlı bir şekilde geriye kuyruk çekin. Bu kafatası başparmağınızı ve ilk parmak kullanarak ilk servikal omur ayrılır olun.
  8. Normadım 2.3 (Şekil 3A) olarak biyolüminesans görüntüleme ilk gününde elde edilen karşılık gelen okumaları karşı her gün için alize lüminesans değerleri.
  9. İstatistiksel analiz için Kaplan-Meier tahmincisi 12 kullanılarak sağkalım eğrileri oluşturmak ve bir log-rank testi 13 kullanılarak sağkalım eğrileri arasındaki farklılıkları karşılaştırmak.

Sonuçlar

GL261 hücreleri 1. In vitro biyoışıldama görüntüleme insan glioblastoma hücre çizgisi U87.luc pozitif kontrol seviyelere benzer güçlü bir lusiferaz ekspresyonu (Şekil 1) gösterilmiştir adımda yukarıda tarif edildiği gibi lusiferaz lentivirüs ihtiva ile enfekte edilmiştir. Beklendiği gibi, enfekte olmamış GL261 hücreler arka plan lusiferaz ifadesini göstermektedir. Bu adım henüz önce kararlı lusiferaz ifadesini teyit etmek için enfekte hücre hattı kullanarak ileri çalışmalar gerçekleştirmek için kritik basittir.

Intrakranial implantasyondan sonra lüsiferaz ifadesi.

Intrakranial implantasyon önce, GL261 hücreleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında GL261.luc in vitro büyüme hızında herhangi bir fark gösterdi. Intrakranial büyüme ve hayatta kalma analizi için, hücreler, br enjekte edilmiştirGL261.luc tümörleri taşıyan farelerde 3. adımda Tümör büyümesi protokole uygun olarak, C57BL / 6 farelerinin ains seri protokolünü adım 4 kullanılarak biyoışıldama görüntüleme için analiz edilmiş ve tümör büyümesi tespit (Şekil 3A) gösterilmiştir. Hızlı ve sürekli olarak GL261.luc tümörleri taşıyan fareler, Can çekişme durumuna gelen ve kurban edilmiştir. Önemlisi, GL261.luc ve hayvanları taşıyan GL261 tümör (Şekil 3B) arasındaki genel sağkalım açısından fark yoktur. In vivo biyoparlaklık görüntüleme nedenle deneysel glioblastoma tedavilere yanıtı izlemek için de kullanılabilir. Hızlı, güvenilir tümör büyümesi ve kısa genel sağkalım süresi nispeten kısa bir miktarda büyük miktarda veri sağlayabilir.

figure-results-1
GL261.luc hücrelerinde Şekil 1. Lusiferaz aktivitesi. U87.luc, GL261.luc ve GL261 (negatif kontrol) hücreleri yoğunluklarda kaplandıX 10 6 1.0, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 hücre / çukur soldan sağa doğru. Işıma (foton / sn / / sr cm2) lumina görüntüleme istasyonu tarafından ölçüldü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Lusiferaz ekspresyonu GL261 hücre çoğalmasını etkilemez. GL261.luc hücreleri neden olmayan çoğalmasında farkı MTS hücre proliferasyon deneyinde gösterildiği gibi. Ortalama absorbans değerinin karşılaştırılmasıyla belirlenen şekilde grafik gün 1 'e göre kat artış gösterir (gün 1 ortalama değere thespecified zaman noktasında karşılaştırmalar için t-testi değerleri (ortalama ± SEM)her bir hücre hattı arasında: P = 0,7796) 14. Hata çubukları ortalama değerler her gün dörtlü örneklerinden (ortalama ± SEM) temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3. Lusiferaz tanımı, in vivo tümör büyümesinin ve hayvan hayatta kalma etkilemez doz. (A) Biyoparlaklık izleme C57BL / 6 farelerde intrakranial GL261.luc tümörünün büyümesini ilerici gösterir. (B) Kaplan-Meier sağkalım analizi ya GL261 (düz çizgi) veya GL261.luc hücreleri ile intrakranial yerleştirilmiş farelerin genel sağkalım açısından fark gösterir (kesik çizgi).Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Singeneik, immunokompetan C57BL / 6 farelerine intrakranial yerleştirilmiş olduğunda, GL261, murin glioma hücreleri, İnsan gliyom ksenograft hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında pek çok avantaja sahiptir. Ksenogreflenmiş tümörlerin çoğu doğru invaziv insan hastalığı özetlemek yok kapsüllü lezyonlar olarak büyür. Buna karşılık, GL261 tümör sadece komşu beyin içine işgali gösteriyor, ama aynı zamanda neovaskülarizasyon, mitoz ve derin nekroz 7. En önemlisi, tümör immünolojisini veya immünoterapötik stratejiler 15, 16, C57BL / 6 fare, bozulmamış bir bağışıklık sistemi 8 korur incelenirken. Daha önceki çalışmalar, immün baskılayıcı sitokin TGF-p sağlam ekspresyonunu göstermiştir ve intrakranyal tümörler İnsan glioblastoma 9, 10 benzer bir bağışıklık bastırıcı T-düzenleyici hücreler içerir.

Burada tarif edilen basit bir teknik GL261 hücreleri tarafından lusiferaz stabil ekspresyonu sağlar. Son zamanlarda Simi'yi bildirmiştirin vitro ve in GL261 hücreleri ile karşılaştırıldığında GL261.luc hücrelerinin in vivo büyüme lar, içindeki tümör histolojik özellikleri ve bağışıklık hücresi ilave olarak 17 sızmaya. GL261.luc hücreleri stabil fotonların ve bu nedenle algılanabilir ışık kimyasal enerjiyi dönüştürerek substrat luciferase oksidasyonunu katalize lusiferazı ifade eder. Luciferase güvenli bir şekilde hayvanlara tatbik ve intraperitoneal ya da damar içine enjeksiyondan sonra kan beyin bariyerini geçer edilebilir. Fare gibi küçük araştırma hayvanlarda biyoluminesans invaziv olmayan bir şekilde 11 dışarıdan tespit edilebilir. Bu nedenle, tümör büyümesi seri hayvan kurban veya maliyetli MRI veya BT görüntüleme gerek kalmadan tespit edilebilir.

Protokolde kritik adımlar bir in vivo deney başlamadan önce in vitro olarak, lentiviral transdüksiyon, aynı zamanda lusiferaz kararlı ifade doğrulama sadece içerir. Transdüksiyon kaybı requi olabilirTekrar lentivirüs enfeksiyon yeniden. Sentezleme vektörü içine, bir antibiyotik direnç geninin Giriş, aynı zamanda lusiferaz ifadesi için seçmek için kullanılabilir. Titiz tekniği tekrarlanabilir, farklı tedavi gruplarının karşılaştırılması izin vermek için kesin bir anatomik bölgeye hücrelerin istikrarlı bir sayıda yer intrakranial implantasyon için gereklidir. Bu çalışmada ve lusiferaz sentezleyen GL261 hücrelerin çalışmalar arasında büyük bir fark, bir stereotaktik çerçeve 18 kullanımı ile karşılaştırıldığında hücrelerin ekilmesi için serbest el tekniği kullanılmasıdır. Biz daha önce serbest el tekniği 19 ile tutarlı implantasyon sonuçlar ortaya koymuştur. Serbest el tekniği avantajı farklı tedavi ajanlarının yüksek kapasiteli analizleri yapmak için yeteneğidir. Bizim ellerde, biz 1 saat yaklaşık 60 hayvan implante edilebilir.

Tekniği mastering sonra, tekniğin gelecekteki uygulamalar sınırsızdır. GL261 demonstr olarakAteş yüksek mitoz ve insan glioblastoma benzer hızlı tümör büyümesi, anti-proliferatif tedaviler değerlendirilebilir. GL261 tümörler, istilacı ve anjiyojenik olarak Benzer şekilde, anti-invasif ve anti-anjiyogenik terapiler kullanılabilir. İnsan hedeflere yönelik kemoterapötik maddelerin etkisini değerlendirmek Dikkat kullanılmalıdır. Lusiferazı 20 ifade insan glioblastoma xenografts kullanan önceki çalışmalara kıyasla bu modelimizin bir sınırlama olarak düşünülebilir. Aynı zamanda, tümör büyümesinin immünoterapötik stratejilerinin etkisi GL261 ksenogreflenmiş modelinde incelenebilir.

Açıklamalar

Açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Teknik yardım için Rajwant Kaur'a teşekkür ederiz. Lentivirüs hazırlama konusundaki yardımı için Maxwell Tom'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, UCSF'de Reza ve Georgianna Khatib Kafatası Tabanı Tümör Cerrahisi Kürsüsü ve Northwestern Üniversitesi'nde Michael J. Marchese Profesörü ve Kürsüsü tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
D-Luciferin, Potasyum TuzuAltın BiyoteknolojiLUCK-100Işıktan uzakta saklayın
Living Image YazılımıKumpas Yaşam BilimleriFiyat Teklifi İçin İletişime Geçinyok
Xenogen LuminaKumpas Yaşam BilimleriFiyat Teklifi İçin İletişime GeçinYok
24 kuyulu; Standart doku kültürü; düz tabanlıFalcon353047
CellTiter 96 AQueous Tek Çözeltili Hücre Proliferasyon Testi PromegaG3582yok
Synergy 2 Çok Modlu OkuyucuBioTekTeklif için İletişimyok
96 kuyu Tahlil Plakası, Siyah Plaka, Kapaklı şeffaf alt, Doku kültürü TretaedCoster3603yok
KetasetPfizerNDC 0856-2013-01Kontrol maddesi
XylazineSigma-Aldrich23076-35-9yok
28G İğne (şırınga ile) Balıkçı   22-004-270AKA İnsülin Şırıngası
%2 KlorheksidinFisherNC9756995AKA " Nolvasan"
% 3 Hidrojen Peroksit FisherH312P-4Işıktan uzakta saklayın
Oftalmik MerhemKardinal Sağlık1272830AKA " Akwa Gözyaşları"
25G 1 1/2 iğneBD Becton Dickinson305127yok
Tek Kullanımlık NeşterTüyü2975No. 21
GazlıBezFisher 22028563Kullanmadan önce otoklav
Isıtma YastığıDunlapHP950yok
Cilt Zımba, Zımba, SökücüÇalma59020yok
PDI Alkol Hazırlık PedleriFisher23-501-711yok
Refleks 7 mm Yara Klipsi 100'lü paketBrain Tree Scientific, INC203 1000Kullanmadan önce otoklav
Refleks 7 mm Yara KlipsiUygulayıcı Brain Tree Scientific, INC204 1000Kullanmadan önce otoklav
Refleks 7 mm Yara Klipsi SökücüBeyin Ağacı Bilimsel, INC205 1000yok
Ahşap saplı Tek Uçlu Yuvarlak Uçlu ÇubukQosmedix10107Kullanmadan önce otoklav
Hanks'in Ca2+ ve Mg2+ içermeyen Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Gibco14170-112yok
Hamilton ŞırıngaHamilton80300yok
FuGENE 6 Transfeksiyon ReaktifiPromegaE2961yok
Kemik BalmumuHarvard Aparatı599864yok

Kaynaklar

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403(2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

GL261 Gliom Modelimm nokompetan Farentrakraniyal T m rL siferaz EkspresyonuIn Vivo zlemeT m r Proliferasyon AnaliziStereotaktik Enjeksiyonlgi Alanmm noterapi al mas
Glioblastoma'nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.