Method Article

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

DOI:

10.3791/53296

⸱

November 12th, 2015

 , 
1Centro de Investigación en Dinámica Celular, Instituto de Investigación en Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, 2Instituto de Biotecnologìa, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan hücrelerinin adenovirüs (Ad) tarafından enfekte edilmesi sırasında, konak hücre çekirdeği dramatik bir şekilde yeniden düzenlenir ve viral ve hücresel proteinlerin viral genom tarafından işgal edilen bölgelere alınması yoluyla nükleer mikro ortamların oluşumuna yol açar. Replikasyon kompartmanları (RC) olarak adlandırılan bu bölgeler, viral genomun lokalize olduğu ve replikasyon, transkripsiyon ve transkripsiyon sonrası işlemeye katılan viral ve hücresel proteinlerin işe alındığı viral kaynaklı nükleer alanlar olarak kabul edilebilir. Ayrıca, tümör baskılayıcı proteinler, DNA hasar yanıtı (DDR) bileşenleri ve doğuştan gelen immün yanıt faktörleri gibi antiviral yanıtta yer alan hücresel proteinler de RC ile birlikte seçilir. RC, verimli ve üretken bir çoğaltma döngüsünü teşvik etmek için çok önemli bir rol oynuyor gibi görünse de, bileşimlerinin ve ilişkili etkinliklerinin ayrıntılı bir analizi yapılmamıştır. Adenoviral RC'nin ve potansiyel olarak hücre çekirdeğinde çoğalan diğer DNA virüslerinin çalışmasını kolaylaştırmak için, Ad RC'yi izole etmek için hız gradyanlarına dayalı basit bir prosedür benimsedik ve bu virüsün neden olduğu subnükleer yapıların morfolojik, fonksiyonel ve bileşimsel çalışmalarını yürütmek ve bunların konakçı-hücre etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek için uygun hücresiz bir sistem kurduk.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adenovirüsler, enfekte hücre çekirdeğinde replike olan bir çift sarmallı DNA genomunu içerir. Viral DNA çekirdeği girdiğinde, PML nükleer organları 1 bitişik lokalize. Viral erken gen ifadesinin ardından, nükleer mimarisi dramatik olarak adlandırılan viral mikroçevrelerde oluşumunu uyaran, yeniden düzenlenir viral çoğaltma Bölmeler (RC) 2. Adenovirüs (Ad) RC viral genomun replikasyonu ve viral geç genlerinin sentezlenmesi gerçekleşecek siteleri olduğundan, bu süreçlere katılmak için gerekli tüm viral ve hücresel faktörlerin alımı için bir ortam sağlar. İlginç bir şekilde, örneğin DNA hasar cevap olarak hücresel antiviral yanıt sorumlu olan hücre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HFF Hücre Kültürü ve Ad-enfeksiyon

  1. Daha önce tarif edildiği gibi, 8 HFF hücreleri üzerinde floresan oluşturucu birim (FFU) halinde HEK-293 hücrelerinden ve titre mono tabakaları Ad5 WT virüsü yayar.
  2. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde DMEM /% 10 fetal sığır 37 ° C'de steril kültür 100 mm'lik tabaklar içerisinde serum (FBS) ve% 5 CO2, 10 ml insan alın derisi fibroblastları (HFF) büyütün. Dört 16 kare setleri hücreleri sayılarak bir Neubauer odasına kullanarak hücre sayısını belirler. Ml başına hücre sayısı dört 16-kare setleri hücrelerin ortalama sayısını hesaplamak ve 10 4 ile bu sayı çarpımı ile....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral replikasyon bölme (RC), protein ve diğer nükleer etki benzer nükleik asitten oluşan çekirdek içi virüslerin neden olduğu yapılar olduğu için, bu biyokimyasal özelliklerine göre hız gradyanları ile izolasyon için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Fraksiyonlara protokol Kritik adımlar örnekleri farklı alt-hücresel fraksiyonların bütünlüğünü sağlamak için parlak bir alan mikroskobu ile izlenmesi gereken adım her birinde Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreler şişen Örneğin, hipotonik tampon maddesi içinde ink.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral enfeksiyon ile hücresel aktivitelerin düzenlenmesini yöneten moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, RC ile ilişkili bileşimi ve aktiviteleri anlamak faydalı olacaktır. Bu nedenle, RC'nin ayrıntılı bir analizini yapmak için, sakaroz yastıkları ile hız gradyanlarına dayanan basit bir prosedür kullanarak RC ile zenginleştirilmiş subnükleer fraksiyonları izole etmek için bu virüs kaynaklı yapıların boyutundan ve biyokimyasal bileşiminden yararlanan hücresiz bir sistem kurduk. Kullanılan hücre tipine bağlı olarak sta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma CONACyT-SEP tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir (SEEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) ve R.A.G. için Promep-SEP; P.H., CONACyT'den (447442) burs aldı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco12100-04637 &'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Fetal Sığır SerumuGibco12484-028
Sükroz, Ultra SafAraştırma Organikleri0928S2,55 M'lik bir stok solüsyonu hazırlayın ve 4 >m'de saklayın; C
Dounce homojenizatörKontess Glass Company884900-0000
Branson 1800 Ultrasonik BanyoBransonZ769533  SIGMA: Kullanmadan 15 dakika önce açın.
Keçi anti-Fare IgG1 İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488 eşlenikYaşam TeknolojileriA-21121Slaytlarında 1: 2.000 seyreltmede kullanın
SigmaS4651-72EALaminer akış kabininde açık
SuperSignal West Pico Kemilüminesan YüzeyPierce ThermoScientific34080
PBS Silan-Prep

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
  2. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-142....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Viral Replication CompartmentsAdenovirus infected CellsSub nuclear Fraction IsolationVelocity Gradient CentrifugationCell free SystemNuclear Lysate PreparationImmunofluorescence AnalysisE2A DNA Binding ProteinViral DNA EnrichmentHost cell Interactions

Related Articles