Bu protokol, in utero elektroporasyon yoluyla C57BL/6 merkezi sinir sistemindeki farklı bölgelerin spesifik olarak nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Bu protokolde korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatuma dönüşen bölgelerin transfeksiyonları için ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü
Bu makalede
Özet
Özet
In utero elektroporasyon, kemirgen merkezi sinir sistemindeki çeşitli genlerin hızlı ve verimli uzay-zamansal manipülasyonu için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. İstenen genlerin aşırı ekspresyonu, shRNA aracılı fonksiyon kaybı çalışmaları kadar mümkündür. Bu nedenle geniş bir uygulama yelpazesi sunar. Belirli hücreleri farklı bir alanda hedeflemenin fizibilitesi, bu çok kullanışlı yöntemin potansiyel uygulama yelpazesini daha da arttırır. Belirli bölgeleri verimli bir şekilde hedeflemek için embriyonik aşama, uygulanacak voltaj ve en önemlisi elektrotların konumu gibi incelikler hakkında bilgi edinmek vazgeçilmezdir.
Burada, C57BL/6 fare merkezi sinir sisteminin çeşitli bölgelerinin utero elektroporasyonuna spesifik ve verimli bir şekilde izin veren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Özellikle, retrosplenial korteks, motor korteks, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, kornu ammonis 1-3, dentat girus, striatum, lateral septal çekirdek, talamus ve hipotalamusa gelişen bölgelerin nasıl transfekte edileceği gösterilmiştir. Uygun embriyonik aşama hakkında bu bilgi için, karşılık gelen embriyonik aşama için uygun voltaj sağlanır. En önemlisi, pozitif kutbun uygun konumunu gösteren bir açı haritası tasvir edilmiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, utero elektroporasyonda verimliliği kolaylaştırmaya yardımcı olur ve bu da hayvan sayısının azalmasına neden olabilir.
Giriş
Üç bağımsız gruplar 1-3 2001 yılında ilk açıklama beri i n utero elektroporasyon kemirgen, merkezi sinir sisteminde gen ifadesini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan standart bir araç haline gelmiştir. Sürekli gelişen teknikler, hala zaman ve para kolaylığından dolayı, rahimde elektroporasyon temyiz tüketen rağmen bir nakavt farelerin nesil ile karşılaştırıldığında. Yani, in utero elektroporasyon hızlı ve verimli gain- ve zarar-fonksiyon çalışmalarını 4 sağlar.
Serebral bölgeleri transfekte etmek için, negatif yüklü plasmid ihtiva eden bir çözelti, ventrikül içine enjekte ed....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik Beyanı: Farelerde ve deneysel prosedürlerin işleme hayvan bakımı için, Avrupa, ulusal ve kurumsal kurallara uygun olarak yapılmıştır.
1. Giriş Utero Elektroporasyon
Not: Daha önce 12,14 yayınlanan utero elektroporasyon gerçekleştirildi. Bu nedenle, yöntem aşağıdaki (Şekil 1) kısaca tarif okunur.
- Hazırlıklar
- Daha önce açıklandığı gibi 12 (1,5 pCAGGS içeren) Hızlı Yeşil renkli endotoksin içermeyen gelişmiş transfeksiyon dereceli plazmid çözüm hazırlayın.
- Enjeksiyonlar için (35 ° açı) borosilikat cam kılcal (0,8-0....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2, retrosplenial korteks içine gelişen bölgelerin utero elektroporasyon belirli için örnekler gösterir, motor korteks, somatosensorial korteks, piriform korteks, cornu 1-3 ammonis, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek , talamus ve hipotalamus. Transfeksiyonlarının sonuçları tavsiye açı (Şekil 2) yanında gösterilmiştir. In vivo açıları daha iyi görüntülenmesi için elektrot (0,5 mm) konumu da (amniotik kese içinde Şekil 5'te, rahimde.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, C75BL/6 farelerinin retrosplenial korteksi, motor korteksi, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, kornu ammonis 1-3, dentat girus, striatum, lateral septal çekirdek, talamus ve hipotalamusun nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Sağlanan tüm bilgilerle bu, C57BL/6 faresinde bu serebral bölgelerin transfeksiyonlarını kolayca yeniden oluşturmak için gerekli tüm bilgileri sağlayan ilk protokoldür. Önceki yayınlar çoğunlukla yalnızca birkaç belirli bölgeye odaklanmıştır ve bu nedenle belir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Teknik, Melanie Pfeifer ve Nikolai Schmarowski (Mikroskobik Anatomi ve Nörobiyoloji Enstitüsü, Mainz Üniversitesi Tıp Merkezi) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| EndoFree Plazmid Maxi Kiti | QIAGEN | 12362 | |
| Hızlı Yeşil | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilikat cam kılcal damarlar (0.8-0.9 mm çap) | Hassas Alet A.Ş. | 1B100F-4 | |
| Isofluran (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | onay numarası: 400684.00.00 | |
| göz merhemi (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| %0,9 benzil alkol% 0,9 tuzlu su çözeltisi | Üniversite Tıp Merkezi Eczanesi Mainz | ||
| gazlı bez (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| steril 5-0 Perma-El İpek Sütür | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| halka forseps 1/ 1.5 mm | Güzel Bilim Aletleri | 11101-09 | |
| halka forseps 4.8/ 6 mm | Güzel Bilim Aletleri | 11106-09 | |
| halka forseps 2.2/ 3 mm | Güzel Bilim Aletleri | 11103-09 | |
| Adson Forseps-Tırtıklı Düz 12 cm | Güzel Bilim Aletleri | 1106-12 | |
| IrisMakas-Narin Düz-Keskin/ Kör 10 cm | İnce Bilim Aletleri | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Makas-Düz 15 cm | Güzel Bilim Aletleri | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forseps-Inox | Güzel Bilim Aletleri | 11251-20 | |
| Castroviejo İğne Tutucu-Kilitli-Tungsten Karbür 14 cm | Güzel Bilim Aletleri | 12565-14 | |
| Elektroporatör CUY21 SC | Nepa Gen A.Ş. | ||
| FST 250 Sıcak Boncuk Sterilizatörü | Güzel Bilim Araçları | 18000-45 | |
| Mikro öğütücü EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Mikropette Çektirme | Sutter Enstrüman Şirketi | P-97 | |
| Platin elektrotlar 650P 0,5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platin elektrotlar 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platin elektrotlar 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platin elektrotlar 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anestezi sistemi | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Buhar 19.3 | |
| Isıtma plakası | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Sıcaklık Kontrol Cihazı 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
Kaynaklar
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
