Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Summary

Nükleer zarf proteinleri birçok temel biyolojik süreçte merkezi bir rol oynar ve çeşitli insan hastalıklarında rol oynamıştır. Bu protokol, LINC komplekslerinin bozulmasının uzay-zamansal kontrolüne izin veren yeni bir Cre/Lox tabanlı fare modelini açıklar.

Abstract

Gelişmekte olan ve yetişkin dokulardaki nükleer göç ve ankraj, büyük ölçüde Nükleoskeleton ve Hücre İskeletinin LInker'leri (LINC kompleksleri) adı verilen büyük makromoleküler protein düzeneklerine dayanır. Bu protein iskeleleri nükleer zarfı kaplar ve çekirdeğin içini çevredeki sitoplazmik hücre iskeletinin bileşenlerine bağlar. LINC kompleksleri, evrimsel olarak korunmuş iki protein ailesinden oluşur, Sun proteinleri ve sırasıyla SUN ve KASH alanları olarak adlandırılan C-terminal moleküler imza motiflerini barındıran Nesprins. Güneş proteinleri, N-terminal nükleoplazmik alanı nükleer lamina ile etkileşime girerken, C-terminal SUN alanları perinükleer boşluğa çıkıntı yapan ve Nesprins'in KASH alanı ile etkileşime giren iç nükleer zarın transmembran proteinleridir. Kanonik Nesprin izoformları, sitoplazmaya çıkıntı yapan ve hücre iskeletinin bileşenleriyle etkileşime giren değişken boyutlu bir N-terminaline sahiptir. Bu protokol, endojen SUN/KASH etkileşimlerini hücre tipine özgü bir şekilde bozan baskın-negatif bir transgenik fare stratejisinin doğrulanmasını açıklar. Yaklaşımımız, LINC kompleksi inaktivasyonunun germ hattı modelleriyle ilişkili perinatal ölümcüllük ve hücre otonom olmayan fenotipleri gibi birçok dezavantajı atlayan Cre / Lox sistemine dayanmaktadır. Bu nedenle, bu model, çok çeşitli dokularda gelişim ve homeostaz sırasında LINC komplekslerinin rolünü anlamak için yararlı bir araç sağlar.

Introduction

Nükleer zarf (NE) Sitoplazmadan nükleolazma ayırır. Nükleer gözeneklerin bağlamak bir iç ve bir dış çekirdek zarı (INM sırasıyla Onm,) oluşmaktadır. Her iki membranlarla tarif lümen perinükleer alanı (PNS) olarak adlandırılır. Onm granüllü endoplazmik retikulum (ER) bir uzantısı olan ve INM nükleer lamina yapışır, A ve B tipi ile temsil edilen çekirdek tip V ara ipliklerin bir ağ örgüsü ^1,2 lamins. Nucleoskeleton ve hücre iskeleti (LINC) komplekslerinin bağlayıcılar fiziksel iskelet ipliklerin ve moleküler motorlar (Şekil 1A) çekirdeğin iç bağlamak için bütün çekirdek zarfı kapsayan makromoleküler monte edilmiş halleridir. Güneş (Sad1 / Unc84) proteinler ve Nesprins (Nükleer Zarf SPectRINS): Bunlar KD ayrılmaz transmembran proteinlerinin iki aileyi karakterize evrimsel korunmuş motiflerinin arasındaki etkileşimleri oluşur. Memelilerde, Sun1 ve Sun2 arN-terminal bölgesi nucleoplasmic A ve B tipi lamins ^3-5 ile doğrudan etkileşip etkileşmediği INM e transmembran proteinleridir. PNS içinde INM diğer tarafında, Sun proteinler 150 C-terminal amino asitler, SUN alanı adı verilen ~ evrimsel korunmamış streç barındırır. SUN etki evrimsel korunmuş Kash ile doğrudan etkileşim (Klarsicht / Anc-1, Syne Homology) etki, Nesprins moleküler imza. Kash etki, bir zar geçiş alanı ⁶ ve ardından PNS içine çıkıntı ~ 30 C-terminal amino asidi bir streç oluşur. En az dört farklı Nesprin genler (Nesprin1-4) NE ⁷ lokalize proteinler Kash içeren kodlar. Şaşırtıcı bir 1000 kDa (Nesprin1 dev) için boyutları değişir ~ 50kDa (Nesprin4) den Nesprins, sitoplazmik bölgeleri, çoklu spektrin gibi aktin, plectin ve moleküler motorlar ^8- olarak iskelet bileşenleri ile etkileşimi sağlayarak tekrar yanı sıra özel motifler içeriyor ^13.

Araştırmalar Lamin / Güneş / Nesprin / moleküler motorlar bir evrimsel olarak korunmuş "eksen" nükleer göç ve ankraj kontrol teşkil ettiğini göstermiştir. Linc karmaşık bileşenlerin çeşitli knock-out (KO) fare modelleri tanımlanmış ve memeli gelişim ^9,14,15 sırasında KD Sun ve Nesprin proteinlerinin rollerini anlamak için bir çerçeve sağlayan aracı vardı oylandı. Ancak, bu modeller en önemlisi mevcut birçok önemli sakıncaları: of fenotipik katkılarını ayırt olmayan özerk etkileri, 2) zorluk hücre nedeniyle fenotipleri yorumlarken 1) zorluk Kash-az Nesprin vs Kash içeren, 3) ¹⁶ izoformları Çok sayıda hücre tiplerinde NE Sun ve Nesprin proteinlerin işlevsel fazlalık hem Kash-etki alanı için eksik farelerde ¹⁷ tüm SUN-Kash etkileşimleri ve farelerin 4) perinatal öldürücülüğü inaktive karmaşık ıslah planları gerektirirNesprins1 ve 2 yetişkin analizi ¹⁸ fenotip engellemektedir.

Bu protokol, böylece yukarıda özetlenen sakıncaları birçok atlayarak bir hücre özerk ve gelişimsel olarak düzenlenen bir şekilde in vivo tüm SUN-Kash etkileşimleri bozmak için tasarlanmış yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu Cre / lox tabanlı fare modeli, iki önemli kavramları dayanır: 1) bilinen herhangi bir Nesprin proteininin Kash alanı hücre kültür sistemlerinde KD EGFP hedef ve 2) SUN etki fazla sentezlenmesi, böylece, Kash etki alanları ile etkileşime promiscuously için yeterlidir Herhangi Kash etki tüm endojen Paz etki doyurmak ve dominant-negatif bir şekilde ¹⁷ (Şekil 1B) Linc kompleksleri inaktive edecek. Bu protokol, doku hasat ve serebellar Purkinje hücrelerinde tüm SUN-Kash etkileşimlerinin bozulması doğrulamak için kullanılan işlem adımları açıklar.

Protocol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler St. Louis Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Fare Islahı ve Genotiplendirme

1. ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20 Tg üretmek için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Tg fareler (PCP2-Cre) fareler Breed. Not: Bu protokol kalanı serebellumdaki Purkinje hücreleri EGFP-KASH2 ekspresyonunu sınırlamak için Tg (PCP2-Cre) fare hattı kullanımı üzerinde odaklanmasına rağmen, benzer bir prosedür başka Tg (Cre) fare ile takip edilebilir ( Şekil 2A).
2. Daha önce açıklandığı gibi ¹⁹ hem EGFP ve Cre transgenini barındıran yavrular tanımlamak için genotipleme gerçekleştirin.

Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu için Materyallerin 2. Hazırlık

1. -20 ° C'de% 30 PBS sükroz (1x PBS 30 g sükroz / 100 mi) ve deposunun 100 ml hazırlayın. Doku h günlüktranscardial perfüzyonları bir 35 ml şırınganın içine arvesting, çözündürme ve sukroz çözeltisi yük ~ 30-35 ml olmuştur.
2. PBS içinde% 4 PFA 40 ml (10 mi,% 16 paraformaldehit ve 30 ml PBS) hazırlayın. Transcardial perfüzyonları için 35 ml şırınganın içine Yük ~ 30-35 ml% 4 PFA.
3. Doku diseksiyon 10 ml PBS ile bir 10 cm'lik bir doku kültürü plağı doldurun.
4. 16 mg / ml ketamin ve 3 mg / ml ksilazin içeren bir ketamin / ksilazin kokteyli hazırlanır.
5. Diseksiyon için% 70 etanol içinde bir çözelti hazırlayın.

3. Diseksiyon ve Doku Koleksiyonu

1. Bir tane 1 ml'lik şırınga kullanılarak, vücut ağırlığının her 25 gramı için, ketamin / ksilazin kokteyli 500 ul enjekte edilir ve 15 dakika ~ bekleyin. Alternatif olarak, ilgi biyolojik sistemine uygun olan başka bir kurumsal onaylı sedasyon yöntemi kullanın.
2. Sedasyon üzerine hafifçe dorsal tarafı ile strafor tepsi üzerinde tüm pençeleri pin, ağrı yanıtı eksikliği onaylamak için arka pençe tutamfare aşağı bakacak.
3. % 70 etanol ile karın Sprey ve kalp erişmek için göğüs kafesinin üst alt karın bir kesi yapmak.
4. Kalbin sağ atrium küçük bir kesi yapmak ve kalbin sol ventrikül içine% 30 sukroz çözeltisi içeren şırınga yerleştirin.
5. ~ 2-5 mi başına dakika bir hızda çözelti serpmek. Ne zaman boş şırınga kaldırmak ve% 4 PFA çözümü ile tekrarlayın.
6. Strafor tepsiden fare sabitlemesini ve beyin erişmek için başını kesmek.
7. Forseps ve makas kullanılarak hayvanın başının etrafında deri kaldırmak. Bir iğne ile kafatasının arka kısmında bir delik Poke ve dikkatli makas ve kesme forseps ile kafatası çıkarın.
8. Beyin açıkça erişilebilir bir kez, beyincik kaldırmak ve PBS içinde yerleştirmek için forseps kullanabilir. Bir neşter ile sajital düzlemde beyincik iki eşit parçaya böler ve 4 ° C'de bir gece% 30 sukroz çözeltisi aktarın. Not: hazırlık içinparafin kesitler vardır öncesinde doku gömme ve kesit için% 4 PFA 4 ° C'de gece boyunca beyincik sabitleyin.

4. Doku İşleme ve Kesit

1. Kuru buz ve 2-metil bütan içeren bir bulamaç hazırlanır. Banyosunun sıcaklığı 5 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.
2. OCT bileşiği ile cryomold doldurun ve kalıba iki eşit parçaya bölünmüş beyincik yarısı yerleştirin.
3. Bir diseksiyon mikroskobu ve forseps pozisyon bir çift (beyincik orta hat yakınında) iki eşit parçaya bölünmüş bir yüzey yukarı bakacak şekilde beyincik kullanma.
4. Ekim bileşiği, bir doku numunesinin yaklaşık beyaz bir katı matris oluşana kadar 5 dakika boyunca kuru buz bulamaca cryomold aktarın. Not: Gerekirse dondurulmuş numune hemen -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
5. Etiket cere 15 mikron bölümleri toplamak amacıyla üreticinin talimatlarına göre, doku bölümleri toplamak için poli-lisin slaytlar tedavi edilen ön ve Kriyostat hazırlanmasıbellum. Bölümleri toplamak için dikkatle slayt poli-lizin kaplı tarafı Ekim bölümüne başvurun. Bölümünün yönünü korumak için, bu aşama esnasında slayt dönmez.
6. Boyama ve görüntüleme ile devam kadar -20 ° C'de saklayın doku bölümleri.

5. Boyama ve Beyincik Bölümlerin Görüntüleme

1. Doku boyamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   PBS ~ 50 mi
   ~ PBS içinde% 4 PFA 5-10 mi
   ~ PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu 10-20 mi
2. Çözülme serebellar kesitler. Önemli olarak, EGFP solmasının engellenmesi için, sürekli ve yoğun herhangi bir ışık kaynağı maruz kaldıkları en aza indirir.
3. Hidrofobik bir bariyer kalemini kullanarak, doku kesitlerinde etrafına bir dikdörtgen çizin.
4. 5 dakika boyunca% 4 PFA ile bölümleri Post-fix. Hidrofobik bariyer (genellikle ~ 500 ul) tarafından tarif tüm alanı kapsayacak şekilde yeterli sıvı kullanın. , Bir vakum ya da pipet yeniden kullanmasabitleştirici doku kesitlerinde rahatsız etmemek için özellikle dikkatli olmak taşıyın.
5. Bir pipet ile hafifçe doku bölümleri bozmadan slayt PBS uygulanır. 5 dakika sonra dikkatlice sıvıyı çıkarmak için vakum veya pipet kullanın. PBS üç kez toplam durulama tekrarlayın.
6. Bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde, PBS içinde% 0.5 Triton X-100,% 10 eşek serumu (çözeltisi 900 ul başına 3 ul kalbindin ve / veya Nesprin2 antikoru) uygun bir primer antikor seyreltme uygulanır. Karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edilir.
   Not: EGFP-KASH2 dondurulmuş kesitler üzerinde doğrudan floresan mikroskobu ile görünür olacaktır, ve bir anti-EGFP antikor kullanılması gerekli değildir. Parafin kesitleri hazırlanmış, ancak EGFP-KASH2 görüntüleme, bir anti-EGFP antikor ile immunodeteksiyon gerektirir.
7. Antikor çözüm çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın.
8. 1 Hazırlama:% 0.5 Triton X-100 içinde Alexa Fluor sekonder antikor seyreltileri 1000,Karanlıkta% 10 eşek PBS serum ve mağaza.
9. Yavaşça Nihai PBS durulama çıkarın ve karanlıkta bir saat süreyle ikincil antikor seyreltme uygulanır.
10. Ikincil antikor çözüm çıkarın yıkayın ve bölüm üç kez yıkayın. Gerekirse, ilk PBS uygulama esnasında, örneğin DAPI (~ 300nM) olarak nükleer leke, uygulanır.
11. Tamamen doku ve doku bölümünde medya montaj yeri ~ 5-7 ul yerinden PBS çözüm kaldırmak. Doku bölümünün üstünde bir cam lamel yerleştirin ve karanlıkta, oda sıcaklığında ~ 15-30 dakika boyunca bekletin.
12. EGFP ve adımları 5,8 / 5,9 kullanılan ikincil antikorlar için uygun olan herhangi bir başka dalga boylarını görselleştirmek için uygun filtreler ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu kullanın. Serebellar dilimleri, EGFP-KASH2 nükleer jantlar görüntülemek için bir 20X objektif kullanın.

Results

Bu protokol, Tg (PCP2-Cre) fareler kullanılarak beyincik Purkinje hücreleri için EGFP ekspresyonu KASH2 kısıtlamak için Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) fare modelinde yararını göstermektedir. Tg olarak ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) yavruları, LacZ / V5 açık okuma çerçevesi bu şekilde özellikle Purkinje hücreleri (Şekil 2A) için hedeflenen EGFP-KASH2 ekspresyonuna yol açan Cre rekombinaz tarafından P6 eksize edilir. Beklendiği gibi çekirdeğe (Şekil 2B) çevresinde gözlenmiştir EGFP-poz...

Discussion

En kritik aşama başarılı Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) modeli, uygun bir Cre fare hattı (ler) i belirlemek için kullanıldığı in vivo LINC komplekslerinin rolünü incelemek için. Cre içindeki yollar yer alan diğer hücre tiplerinde aktif Gerçekten de, eğer, bu sonuçların yorumunu komplike olabilir. Beyincik (Şekil 2B), moleküler ve granül hücre katmanlarında burada gösterildiği gibi Dolayısıyla, bu, at hücreleri incelemek için önemlidir. Aynı şekilde, herhangi bir fizyolojik ilgili fenotipleri maksim...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sükroz	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
%16 Paraformaldehit Çözeltisi	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710
OCT Bileşik	Doku-Tek	4583
Yapışma Slaytları	StatLab	M1000W
Eşek Serumu	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Kalem	Vektör Laboratuvarları	H-4000
Anti-Calbindin Antikoru	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Antikoru	Abcam	ab13970
Anti-Nesprin2 Antikoru			Daha önce Ref. 21'de açıklanmıştır
Floresan Montajı Medya	Dako	S3023
2-metil bütan	Sigma Aldrich	O3551