Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

18.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53319

⸱

1 Kasım 2015

 , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center and University of Cincinnati College of Medicine

Bu makalede

Özet

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

Özet

Sistemik lupus eritematozus (SLE) çeşitli klinik ve immünolojik bulguları olan otoimmün bir hastalıktır. Birkaç spontan ve indüklenebilir hayvan modeli, bm12 transfer modeli de dahil olmak üzere insan hastalığının ortak bileşenlerini yansıtır. Bm12 splenositlerinin veya saflaştırılmış CD4 T hücrelerinin transferi üzerine, C57BL / 6 fareleri hızla büyük frekanslarda T foliküler yardımcı hücreler (Tfh), germinal merkez (GC) B hücreleri ve plazma hücreleri geliştirir ve bunu takiben yüksek seviyelerde dolaşımdaki anti-nükleer antikorlar izler. Bu model, saf bir C57BL / 6 arka planında fareler kullandığından, araştırmacılar nispeten kısa bir süre içinde transgenik veya nakavt fare suşlarında hastalık ilerlemesini hızlı ve kolay bir şekilde inceleyebilirler. Burada, çok renkli akış sitometrisi ile modelin indüksiyonu ve Tfh, GC B hücreleri ve plazma hücrelerinin kantitasyonu için protokolleri açıklıyoruz. Daha da önemlisi, bu protokoller SLE'nin çoğu fare modelinde hastalığı karakterize etmek ve diğer hastalık modellerinde Tfh, GC B hücrelerini ve plazma hücrelerini tanımlamak için de kullanılabilir.

Giriş

Sistemik lupus erythematosus (SLE), anti-nükleer antikor (ANA) üretim ve glomerulonefrit prototip, özelliği kompleks otoimmün bir hastalıktır. Çok sayıda diğer deri dahil olmak üzere, sekeller, kardiyo-pulmoner ve hepatik lezyon bazı kişilerde hastalığı ile ilişkilidir. ABD'de yaygınlık tahminleri kadınların ve azınlıkların 3 özellikle yüksek insidans ile, 150,000-1,500,000 1,2 dan, büyük ölçüde değişmektedir. SLE etyolojisi ayırt etmek zor olsa da, sistemik otoimmünite sonuçlanan çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimi kaynaklandığı düşünülmektedir.

Çeşitli hayvan modelleri hastalığın başlangıcı ve ilerlemesinde yol açan faktörleri incelemek için istihdam edilmiştir. SLE Klasik fare modelleri p gibi NZW F1 modeli ve NZM türevleri, MLR / lpr zorlanma ve BXSB / Yaa zorlanma ve indüklenebilir sistemleri NZB x dahil genetik yatkın fare suşları arasında,ristane ve kronik Graft Versus Host Hastalığı (GVHH) 'nın modelleri 4. GVHD modellerinde otoantikor üretiminin ilk raporlar F1 transferleri 5 içine ebeveyn için çeşitli fare suşları veya hamster suşu kullanılmıştır - 8; lupus benzeri hastalığı incelemek için kullanılan daha yaygın yöntemler şu DBA / 2 üst → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1 ve burada açıklanan bm12 transferi modeli bulunmaktadır. Her model kendi uyarılar vardır, ama bunlar genellikle insan hastalığın klinik özellikleri ile ilişkili özellikler ortak bir dizi paylaşır. Fare modellerinde en sık bildirilen parametreler, splenomegali lenfadenopati, nefrit, ANA üretimini içerir ve hücresel düzeyde, T foliküler yardımcı hücrelerin (TFH), germinal merkez (GC) B hücreleri ve plazma hücrelerinin genişlemesi.

- H2 - Ab 1 bm12 / KhEgJ (bm12) fareler, bir gerilme i uyanlabilir bm12 modeli IA bm12 B6 (C) lenfositlerin adoptif nakli ile elde edilirMHC sınıf II üzerinde 3 amino asit ikameleri haricinde C57BL / 6'ya Dentical, IA içine C57BL / 6 (B6) fareler, b. Alıcı APCler tarafından verici CD4 T hücrelerinin Alloactivation belirtileri yakın SLE benzeyen GVHH yol açar. Spesifik olarak, bu verici türetilmiş TFH genişlemesi, alıcının türetilmiş GC B hücreleri ve plazma hücrelerinin genişlemesini ve anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-kromatin ve anti-RBC antikorlar da dahil olmak üzere 9 Anas üretimini içerir. Zamanla, alıcı fareler glomerüler, interstisyel IgG mevduat ve böbrekler 10 damar bölgeleri ile ilişkili glomerülonefrit gelişebilir. Son zamanlarda insan hastalığına benzer, bu modelde 11 IFN tipi için kritik bir rol da vardır, göstermiştir. Özellikle, insan SLE ​​için belirleyici kriter, anti-dsDNA varlığında SLE uyumlu nefritin gelişmesini, bu fare modelinde belirgin özellikleri olan, her ikisi de 12 antikorları içerir.

Var sespontan modeller üzerinde bm12 modelinin veral avantajları. Kendiliğinden SLE benzeri belirtiler geliştirmek Classic modelleri nakavt ya da başka genetiği değiştirilmiş fareler zor ve zaman alıcı kapısı yapmak melez fare suşları değil, B6 zemin üzerine B6 arka plan, ya da büyük genetik lokusların üzerinde kendilenmiş fare suşlarının ya güvenmek. Bm12 uyarılabilir model, genetik olarak tadil edilmiş farenin özel genler hastalık için önemli olabilir hücresel bölmesinin daha hızlı biçimde teşhisine izin veren, donör veya alıcı olarak görev yapabilir. Ayrıca, bm12 modelinde hastalık gelişimi en spontan modelleri için birkaç ay ile karşılaştırıldığında, Anas görünümünü kadar sadece 2 hafta gerektiren, çok daha hızlıdır. Ayrıca, farklı zaman noktalarında hastalığı geliştirmek kendiliğinden model aksine, bm12 → B6 modelde hastalığın başlangıcı ve işleyişi yüksek senkronize edilir. Bu olabilir b uygun boyutta kohortların üretimi sağlare hastalık gelişiminin her aşamasında girişimsel ya da terapötik stratejiler için kullanılır.

Aşağıda B6 arka plan üzerinde, C57BL / 6 farelerine bm12 lenfositler adoptif nakli, ya da genetik türevleri tarafından SLE-benzeri otoimmünite başlatılması için ayrıntılı bir protokoldür. Buna ek olarak, TFH GC B hücreleri numaralandırma için bir akış sitometri boyama protokolü tarif eder ve plazma hücrelerinin hücre türleri, insan hastalığı ile ilişkilidir. Daha da önemlisi, bu protokoller SLE Birçok fare modellerinde hastalığa karakterize ve diğer hastalık modellerinde TFH GC B hücreleri ve plazma hücreleri tanımlamak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan çalışmaları değerlendirme ve laboratuvar Animal Care International Akreditasyon ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Derneği (IACUC) tarafından belirlenen esaslara uygun olarak spesifik patojen içermeyen koşullar altında gerçekleştirildi.

NOT: Bu tür vericiden veya alıcı hayvanlar mümkünse birinin üzerine CD45.1 gibi konjenik işaretleyici ifade birleştirin fareler, bu donör greft verimliliği ve donör CD4 T hücre popülasyonunun spesifik genişleme izlenmesi için izin verir, çünkü. Donör veya alıcı olarak aksi genetiği değiştirilmiş farelerin kullanılması göz önünde olursa, gerilme düzgün B6 arka plana backcrossed edilir veya transfer hücreleri reddedilmez-bu olabilir temsilcisi sonuçları ve tartışma bölümlerinde daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır emin olun.

NOT: 12-16 fareler enjekte için yeterli hücreleri vermelidir farelerin bm12 hasat 4 donör için aşağıdaki prosedürleri ayrıntı hacimleri. Altıoniki haftalık bm12 farelere yaklaşık% 25 CD4 T hücreleri ile kabaca 100-140.000.000 lenfositleri verim. Yukarı veya aşağı buna göre farelerin farklı sayılar veya farklı fare türüne, ölçek hacmi ile başlayarak edin. C57BL / 6 fareleri, genel olarak sadece% 20 CD4 T hücrelerine daha yakın benzer verimler verir.

NOT: oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın ve uzun vadeli lenfosit canlılığı bozabilir ısı ve soğuk şoku önlemek için RT ortam kullanın. Doku hasat ve aseptik teknik kullanılarak bir doku kültürü kaputu doku işleme adımları uygulayın. Bu protokol tüm medya ile IMDM ise% 10 ısı ile inaktive aksi belirtilmediği sürece, FBS ve basitçe anılacaktır "eksiksiz bir medya."

1. Yeni Bir Yöntem genotipleme bm12 fareler için

NOT: genotipleme için kısa bir kısıtlama sindirmek tabanlı protokol şu anda sadece yayınlanmış genotipleme yöntemidir sıralamaya basit ve ucuz bir alternatif olarak, burada sağlananBu fareler için.

  1. Fare kuyrukları genomik DNA izole. Fare kuyruğu kupürü hakkında ayrıntılı protokoller için bir önceki vallahi makale ve kuyruk cDNA nesil bakınız 13 sindirir.
  2. Tablo 1 'de listelenen primerler ve ısı döngüsü koşulları kullanılarak bm12 MHC-II IA b ve IA ortak 474 bp'lik bir DNA fragmanını çoğaltmak için bir ters transkriptaz polimerize zincir reaksiyonu (PCR) 14 gerçekleştirin.
  3. Sınır enzimi PsuI veya vahşi tip IA b keser onun isoschizomers (BstX2I, BstYI, MflI veya XhoII) birini, ancak IA bm12 mutant kullanılarak PCR ürünü ~ 7 ul ile sindirmek gerçekleştirin. Su karışımı belirtmek tampon ve enzim olacak üreticiler, ve 5 dakikalık bir inkübasyon ile sağlanan protokol sindirimi takip edin. 37 ° C'de 15 ile birkaç saat.
  4. Yük ürün sindirimi ve 30-45 dakika boyunca, etidyum bromür 14 ile birlikte% 1 poliakrilamid jel üzerinde yapılmıştır. 1 de50V-gerçi optimum voltaj ve saat ayarları kullanılan PCR jel aparat bağlı olarak değişecektir. UV ışığı ile DNA bantları gözünüzde canlandırın. Örnek sonuçlar Şekil 1 'de gösterilmiştir.

figure-protocol-1
Genotipleme sonuçları bm12 Şekil 1. Temsilcisi.
IA bm12 / bm12 olmayan homozigoz farelerde, belirlemek için, kuyruk DNA'sının PCR ile bm12 için taranmıştır / kısıtlama genotipleme (Adım 1) sindiremez. Homozigot vahşi tip (IA b / b) DNA, 227 iki bant ve (~ 250 bp az bir kalın bant olarak görüntülendi) 247 bp verir; homozigot bm12 (IA bm12 / bm12) DNA ürünleri 474 bp bir bant; ve heterozigot (IA bm12 / b), DNA ~ 250 ve 474 bp iki bant verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Hasat DonörHücreler

  1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) kullanarak Kurban donör fareler birincil ve ikincil ötenazi yöntemleri -onaylı. Örneğin, sonra servikal dislokasyon yapılmıştır CO2 ile havasız bırakılarak fareler euthanize.
  2. 11-13 gibi 10 ml tam medya içeren 15 ml tüpler içine aseptik teknik, hasat dalak ve lenf nodları (yüzeysel servikal, mandibular, brakial, aksiller, mezenter ve inguinal) kullanma.
    NOT: Ayrıntılı lenf nodu diseksiyonu protokolleri 16 önceki raporlarda bakın - 18. Bu model transferi için yalnızca fare splenositlerin kullanarak da başarılı olur, ancak lenf nodu eklenmesi önemli ölçüde donör farelerin gerekli sayısını azaltır.
  3. Bir şırınga pistonu kullanarak 70 mikron hücre süzgeçler ile adım 2.2 toplanan lenfoid dokuların ezme tek bir hücre süspansiyonu oluşturun. Her 4 için daha iyi verim için, aşırı yüklemeyin süzgeçler kullanımı ~ 6 süzgeçlerfareler işlenir ve işleme sık iken pislik tutucu durulayın. 400 x g'de 5 dakika boyunca, daha sonra iki 50 ml konik tüp içine 4 fareden gelen santrifüj hücre dokuları birleştirin ve süpernatant süzün.
  4. 50 ml tam medya ve yeni konik tüp transferi hem konik tüpler gelen süspanse hücreleri. Oda sıcaklığında bu tüp tutun.
    NOT: Yağ tüp yüzüne yapışır ve tüp yerini değilse, nihai hücresel verimleri düşebilir.

3. Donör Hücre Sayım

NOT: Numunenin tamamının en canlılık, kırmızı kan hücresi (RBC) liziz korumak için tavsiye edilmez.

  1. Iyi adım 2.4 tek bir hücre süspansiyonu karıştırın 1 ml çıkarın ve ayrı bir 50 ml'lik konik aktarın. Sayarken kenara oda sıcaklığında, el değmemiş hücreler (49 ml) Kalan ayarlayın.
  2. 1 ml verici hücre örneği bir amonyum klorür-esaslı alyuvar lisiz tamponu 3 ml ekleyin. 1 dakika boyunca yavaşça karıştırın. Sallanan, daha sonra tam ortam, bir 50 ml doldurmaknd 5 dakika santrifüj. 400 xg ve decant süpernatant de.
  3. Süspanse (Hemasitometre kullanarak tripan mavisi ile, örneğin,) 10 ml tam medya ve sayım hücre RBC-lize. Ile çarpın sonucu 49-Bu kenara non-lize bir numune içinde Kalan hücrelerin toplam sayısıdır. Sil hücreleri RBC-lize edildi.

Ve / veya CD4 T hücre Arıtma 4. Donör Hücre Etiketleme

  1. Eğer arzu edilirse, bu gerekli olmasa da, bu aşamada, CD4 T hücrelerinin saflaştırılması. 19 deki gibi CFSE ile etiket hücreleri, ya da diğer hücre izleme boyalar, arzu edildiği takdirde ayrıca, bir örneği temsil edici sonuçları bölümünün Şekil 4 'de gösterilmiştir.
    NOT: Bu yüksek saflıkta elde etmek ve 20 de tarif edildiği gibi, yüksek yaşama kabiliyetiyle, el değmemiş hücrelerinin yaprakları gibi bir CD4 T hücresi Saflaştırma için, negatif manyetik seçim önerilir. Bu endotoksin içermeyen tamponlar kullanılması önemlidir; Bu nedenle, bunun yerine BSA ayırma tamponu wit yapmakh% 2 FBS ve EDTA tavsiye edilen konsantrasyondur.

Donör bm12 Hücreleri 5. Enjeksiyon

  1. 400 x g'de 5 dakika boyunca aşama 3 (ve saflaştırılmış ya da arzu edildiği gibi, Aşama 4'te olduğu gibi etiketlenmiştir), santrifüj hücreleri donör lenfositlerinin sayılmasından sonra. Ml başına 120 milyon lenfositleri (ya da ml başına 30 milyon saflaştırılmış CD4 T hücrelerinin) PBS içinde supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri süzün. Steril, 5 ml kolayca 27,5 G x 13 mm iğne ile donatılmış 1 ml şırınga kapasiteli yuvarlak tabanlı bir tüp ya da başka steril tüp hücreleri aktarın.
  2. Donör örnekleri içinde, CD4 T hücrelerinin yüzdesini belirlemek için akış boyama 4 ° C'de kenara aşama 5,1 donör hücrelerin küçük bir model olan, enjeksiyon öncesinde. Olan en az antikor paneli (Tablo 2) kullanılarak Aşama 8'de tarif edildiği gibi, bu örnekler Leke.
    Not: farklı fare türüne alınan hücreler, ayrı verici olarak kullanılır, bu önemli bir husustur, ve CD4 T hücre yüzdesi büyük oranda, pur farklılık varsaUS-PS gerekli olabilir.
  3. Yavaşça, ama iyice hücreleri karıştırın. Bu kadar hücrelerin pipetleme tarafından ve ekli iğne olmadan 1 ml şırınga kullanarak aşağı yapılabilir. Karıştırma sonrası, 1 ml şırınganın içine hücreleri çizin. Hava kabarcıklarını çıkardıktan sonra iğne takın. Şırınga emişli sırasında kapalı tutulması iğne hücre canlılığı korumaya yardımcı olur.
  4. 21 de tarif edildiği gibi, intraperitonal (30000000 lenfosit veya fare başına 7.500.000 saflaştırılmış CD4 T hücrelerinin eşit) fare başına 250 ul enjekte edilir.
    Not: Burada gösterilen deneylerde ve önceki çalışma 11'de, her bir fare yerine, geleneksel olarak kullanılan 100,000,000 toplam splenositler daha bm12 vericilerden 30000000, toplam lemfositler enjekte edilir. Laboratuarımızda yayınlanmamış veriler, herhangi bir fark fare başına 30 ya da 100,000,000 lenfosit enjeksiyondan sonraki 14. günde serum anti-dsDNA'nın gözlenmiştir. Bu önemli ölçüde deneyler için gerekli olan farelerin sayısı, nefrit wit gelişimini azaltırkenh hücreleri bu sayı değerlendirilmemiştir.

6. Verimlilik Aşılama belirleyin

NOT 1: Bu bölümde optimal enjeksiyonları almış olabilirsiniz herhangi bir fare (örneğin, bir fare greft görülen bunun <% 10 belirlemek için 3. günde alıcı verici hücre aşılama derecesini belirlemek için nasıl anlatacağız Aynı gruptaki diğer tüm fareler). Bu veriler aynı zamanda genetik olarak değiştirilmiş fare suşundan hücreleri (detaylar için temsili sonuçlar bölümüne bakınız Şekil 6), daha sonra zaman noktalarında reddedilen olup olmadığını belirlemenize yardımcı olabilir.

NOT 2: Bu bölüm CD45.1 bm12 donörler ve CD45.2 C57BL / 6 alıcıları kullanırken bağışçılar ve alıcıların farklı konjenik geçmişlere, örneğin, üzerinde farelerden ise mümkündür, ya da donör hücreleri hücre izleme boya ile etiketlenmiş zaman. Önemlisi, 3 gün sonrası enjeksiyon de, CD4 T hücreleri minimal genişleme uğramıştır (seaşılama derecesi gözlenen farklılıklar enjeksiyonlar değişkenlik genişleme nedeniyle değildir bu yüzden e temsili sonuçlar bölümünde, Şekil 4).

  1. % 4 izofluran veya diğer IACUC onaylı yöntemle fareler anestezi. Düzgün kan beraberlik geçmeden önce anestezi fare sağlamak için arka ayak refleksleri test edin.
  2. Örneğin 22 gibi, retro orbital damar ağını delmek olarak, IACUC onaylı bir yöntem kullanarak Hasat 100-200 ul kanı. Örneğin liyofilize dipotasyum EDTA içeren malzeme tabloda başvurulan plazma toplama tüpleri, gibi bir anti-pıhtılaştırıcı madde ihtiva eden ayrı ayrı 0,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kan toplamak. Kan alımından sonra, nihai doku hasat (Adım 7) kadar kalacak yere geri evde kafes içinde fare daha sonra, kanama durur sağlamak yerleştirmek için steril bir havlu veya gazlı bez kullanarak fare göz hafifçe basınç uygulayın.
    NOT: Fareler yeterli bilince kavuştular gözetimsiz kadar fareler bırakmayınventral yatma korumak ve tamamen iyileşti kadar başkalarının şirkete fareler dönmez.
  3. (Daha sonra yavaşça iki faz arasında karıştırılması en aza indirmek için dikkatli olmak, 200 ul pipet ile 21 ° C yüksek yoğunluklu hücre ayrıştırma çözeltisi 200 ul altında yatan, 21 ° C PBS ile 500 ul kan hacmi getirmek ve konik alt mikrosantrifüj tüpüne transfer ) önerilen çözümler için malzemeler Tablo bkz. Düşüğe ayarlanmış santrifüj fren 20-25 ° C de 20 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
  4. 800 mL soğuk tam ortam içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 1 ml pipet ve transfer ile lenfositlerin içeren üst tabakayı çıkarın. Yavaşça hücreleri karıştırmak için vorteks. 5, 4 ° C'de dakikada ve dökme sıvı supernatant 700 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
  5. 200 ul içinde süspanse hücreleri t belirlemek için olan en az antikor paneli (Tablo 2) kullanılarak Aşama 8'de tarif sitometrisi olarak akış için tam bir ortam, 96 oyuklu U tabanlı plakaya transfer ve lekeO PBMC yüzdesi olarak CD4 T hücre greft göreli bolluk.

7. Final Doku Hasat

NOT: Bu sonuçlar bölümünde tarif edilen deneyler 14 gün donör hücrelerin enjeksiyonundan sonra hasat edilmiştir (ya da bazı durumlarda daha az zaman olarak), bu TFH hücreleri ve plazma hücrelerinin ilk geliştirilmesi de gibidir; Bu model, SLE kronik GVHD modeli olduğu, ancak, hastalık daha sonraki zaman noktalarında izlenebilir. Optimum zaman aralığı her deneyde yöneltilen araştırma sorusuna bağlıdır.

  1. Bm12 donör hücreleri (aşama 5,4) enjeksiyonundan sonra önceden tespit edilmiş bir zaman noktasında, ötenazi, IACUC onaylı yöntem kullanılarak fareler kurban. Kansız bırakılarak ardından CO2 ile boğma tavsiye edilir. Servikal dislokasyon ötenazi ikincil yöntem olarak işlev görebilir, fakat bu kan beraberlik verimini düşürebilir.
  2. Hafifçe% 70 içeren bir sprey şişesi ile fare karın Islaketanol. Yaklaşık 1 cm genital üzerinde cerrahi makas ile küçük, yüzeysel kesi olun. Sağlam periton fasya tutmak için dikkatli olmak, sternum doğru karın derisinin geriye çekilmesi.
    Not: henüz iyi karakterize edilmemiş olmasına rağmen, ölçülmüş ve ilave bir hastalık parametresi olarak analiz edilebilir 14. günde 0.5-3 mi asit, genellikle, bu hastalıklı farelerin.
  3. 18 G iğne ile 5 ml şırınga takın. Hayvanın kafasına doğru ve fasya düzlemine 15 ° açıda yukarıya yönelik iğne ile karın sağ alt kadranda içine iğne takın. Assitler aspire ederken bağırsak ile tıkanmış iğne önlemeye yardımcı olmak için çekum yakın iğne ucu yerleştirin.
  4. Dikkatle sonra yavaşça enjektöre assitler çizin yan fare döndürün. Asit elde edildikten sonra, şırınga çıkarın ve syri tarafında hacimsel işaretlere bağlı olarak aspirat hacmi, kayıtnge.
  5. Daha sonra işlenmek için buz üzerinde 5 ml'lik yuvarlak dipli bir tüp ve deposuna Deşarj asit.
  6. Esasen 22 olarak inferior vena kava (IVC) dan beraberlik yoluyla Hasat kan. Donuk forseps kullanarak, yavaşça IVC ortaya çıkarılması, farenin sol tarafına bağırsakları hareket ettirin. IVC içine 1 ml şırınga takılan bir 27.5 G iğne takın ve yavaş yavaş kan 400-500 ul çizin.
  7. Hemoliz en aza indirmek için, yavaş yavaş 0.5 ml mikrosantrifüj serum veya plazma toplama tüpüne kan enjekte. ELISA ile Anas sonra serum analizi için buz üzerinde kan tutmak.
  8. (Istenen lenf nodları ve böbrekler, özellikle daha sonraki zaman noktalarında ve glomerülonefrit de toplama atılır eğer, dalak ve) incelemek ve alakalı ek dokular edinin. Yavaşça bağırsak geri hayvanın sağ tarafına doğru yerleştirerek ve dalak birincil bağ dokusu olan pankreas, dalak çekerek çıkartın.
  9. Kalan pankreas çıkarın, sonra tartmakBrüt splenomegali SLE fare modellerinde yaygın bildirilen parametre olarak, hemen diseksiyonu sonrası yüksek hassasiyetli dengesi üzerinde dalak. Buz üzerinde 1 ml tam ortam ile doldurulmuş ayrı ayrı 1,5 ml tüpler içinde lenf dokuları yerleştirin. % 10 nötral tamponlu formalin böbrekleri Fix veya 23 gibi daha sonraki histoloji için böbrekleri dondurmak oturtun.
  10. 3 dakika boyunca toplama 2 saat içinde Santrifüj kan. 10,000 x g'de (4 ° C). ELISA ile ANA sonra analiz için -80 ° C'de serum ve mağaza çıkarın. Detaylı ANA ELISA protokolleri 24,25 önceki raporlara bakın. Birden çok 10-20 ul alikotları saklayın serum donma / çözülme devrelerine en aza indirmek ve gelecekteki deneyler daha fazla sayıda izin vermek.
  11. Santrifüj 5 dakika boyunca 400 xg Asitli. 0.5 ml birkaç tüpleri içine 1 ml pipet ve kısım ile süpernatantı. Antinükleer antikorlar (Anas) ya da diğer çözünebilir enflamatuar aracıların daha sonraki analizler için -80 ° C'de süpernatan dondurun.
  12. Süspanse hücresel kuruş Yaklaşık 1 ml tamamlanmış ortam iyon ve (Kademe 8'deki gibi) akış boyama için 96 oyuklu U tabanlı plakaya 200 ul aktarma.
  13. Ayrı tüpler içine 70 mikron hücre süzgeçler sayesinde her dalak ezin ve eksiksiz bir medya ile durulayın. 1 dakika boyunca 1 ml soğuk eritrosit lizis tamponu ile splenositlerin yeniden süspanse edin. ve sallanan hafifçe karıştırın. 400 x g'de 5 dakika boyunca soğuk tam ortam ve santrifüj ile 10 ml hacim getirin ve süpernatant süzün.
  14. 5 ml tekrar süspansiyon hücre pelet tam medya ve hemasitometre kullanarak saymak. Eksiksiz bir medya 200 ul 1-3 milyon hücre içerecek şekilde ses seviyesini ayarlayın. Donör CD4 T hücre ve alıcı B hücresi farklılaşması ve genişleme ölçmek için uzun bir paneli (Tablo 2) kullanılarak akış sitometrisi (Aşama 8) için boyama başlayın.
    NOT: Ne lazer bağlı olarak, photomultiplier tüp (PMT) ve filtre seti kombinasyonları birden paneller içerisine T ve B hücre analizi paneli ayıran gerekli olabilir, vardır.
ve_title "> 8. Akış Boyama

  1. Aktarım, ya da 96 oyuklu U tabanlı plakanın ayrı oyuklarına yuvarlak tabanlı tüp bağımsız 5 ml 200 ul komple ortam içinde 1-3.000.000 splenositler.
    NOT: 96-plaka kullanarak birden fazla numune leke, ancak çapraz bulaşmayı önlemek için her kuyuda örnekleri plaka dikkat çekmek için etkili bir yoldur. Bir 96-yuvalı plaka 24 örnekleri uygun şekilde tutabilir.
  2. 3 dakika boyunca 500 xg'de Santrifüj plaka., Uygun (biohazard) kabın içine plakadan sonra fiske süpernatant.
  3. İmalatçının tavsiye ettiği konsantrasyon ve 1 ug / ml'de anti-CD16 / anti-CD32 antikor kokteyli, saflaştırılmış bir tamir edilebilir canlılığı boya ihtiva eden (PBS içinde% 1 FBS) akışı, tampon 100 ul hücre pelletleri yeniden süspanse edin. Daha sonra canlılığı boya söndürmek için 100 ul soğuk tam ortam eklemek, 20-25 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
    NOT: hastalıklı farelerin splenositler genellikle ölü veya ölmekte hücrelerin nispeten yüksek sayı içeren;Bu nedenle, bir canlılığı, boyanın dahil, ölen hücrelerden daha temiz, daha güvenilir veri elde spesifik olmayan antikor etiketleme önlemek için önerilir. Benzer şekilde, anti-CD16 / anti-CD32 kokteyli Fc reseptörlerinin spesifik olmayan bağlanma floresan etiketli antikor engellemek için dahil edilir.
  4. 3 dakika boyunca 500 xg'de Santrifüj plaka., Biohazard kabına plakadan sonra fiske süpernatant. 200 ul akış tamponu içinde süspanse hücreleri. 3 dakika boyunca 500 xg'de Santrifüj plaka., Biohazard kabına plakadan sonra fiske süpernatant.
  5. 50 ul akış tamponu ihtiva eden antikor kokteyli içinde süspanse hücreleri (Tablo 2). 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe, daha sonra 150 ul akış tamponu ilave edin. Tekrarlayın yıkama adımı 8.4.
  6. PBS içinde 100 | il% 2 paraformaldehid ile yeniden süspanse hücreleri. 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe, daha sonra 100 ul akış tamponu ilave edin. 3 dakika boyunca 500 xg'de Santrifüj plaka., Biohazard kabına plakadan sonra fiske süpernatant.
  7. Resuspend 200 ul akış tamponu içinde, boru parçaları veya standart akış tüpleri akışı akış sitometresinde elde kadar karanlıkta 4 ° C'de ilave 100-200 ul akış tamponu ve mağaza eklemek için aktarın.
  8. Sitometresi boyanma birkaç gün içinde seçilen antikor panelleri için uygun lazerler ve Proje Yönetim Ekipleri ile donatılmış bir akış edinin. Ayrıca rekor ileri dağılım genişliği ve / veya yükseklik dağılım alanı, yan dağılım alanı ve kullanılan floresan parametrelerin alanını iletmek. Güvenilir sonuçlar için, ≥1,000 verici her WT numune hücreleri, ya da çok olayların toplanması mümkün olmayabilir donör hücreleri, minimal genişleme gösteren genetiği değiştirilmiş veya başka manipüle farelerde toplam lenfosit eşdeğer sayıda kazanır.
    Not: analizler (- 6 Şekil 3) temsilci sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak tarif edilmiştir akım sitometrisi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hastalıklı farelerin kütle ve hücreselliği (Şekil 2) olarak dalak 2-3 kez, sağlıklı farelerin büyüklüğü sergileyen az 14 gün gibi splenomegali gelişir.

Splenositler sırayla ışık dağılım (SSC-A tarafından FSC-A) kapılı, çift (FSC-A tarafından FSC-W veya H), canlı hücreleri (canlılık boya düşük boyama), ve CD4 + TCRβ + (Şekil ortadan kaldırılması Şekil 3A). Donör hücreleri CD45.1 ve CD45.2 (Şekil 3B, sol ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bm12 indüklenebilir modeli SLE hücresel ve moleküler süreçler incelemek için nispeten kolay ve etkili bir yoldur. Çok kendi antigenine karşı yönlendirilen adoptively transfer CD4 T hücrelerinin aktivasyonu kronik, burada açıklandığı gibi, akış sitometresi ile ölçülebilir TFH GC B hücreleri ve plazma hücrelerinin birikmesine yol açar. Hızla ve kolayca SLE hastalarında meydana benzeyen ve sonuçta otoantikorların patolojik birikimini yöneten otoimmün germinal merkez süreçlerinde aday genler ve yeni tedavilerin rolü sorguya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Lupus Araştırma Enstitüsü, NCI hibe CA138617, NIDDK hibe DK090978, Charlotte Schmidlapp Ödülü (E.M.J.'ye) ve Albert J. Ryan Bursu (J.K.'ye) tarafından desteklenmiştir. Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi Romatoloji Bölümü'ndeki Araştırma Akışı Sitometri Çekirdeği tarafından sağlanan ve kısmen NIH AR-47363, NIH DK78392 ve NIH DK90971 tarafından desteklenen destek ve enstrümantasyon için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJJackson Laboratuvarı001162CD45.1+ BoyJ fare suşu
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJJackson Laboratuvarı001162Bm12 fare suşu
FastDigest PsuILife TechnologiesFD1554Genotipleme için kısıtlama sindirim enzimi
1X RBC Lizis TamponueBioscience00-4333-57
IMDMGE SağlıkSH30228.01
Plazma Ayırma Tüpü (PST)BD365974Dipotasyumlu kan alma tüpü EDTA
Serum Ayırma Tüpü (SST)BD365967Pıhtı aktivatörü ile kan alma tüpü / SST Jel
FicollGE Healthcare17-1440-02 Yüksek yoğunluklu hücre ayırma çözümü
Lympholyte-MCedarlaneCL5030Yüksek yoğunluklu hücre ayırma çözeltisi
GL-7-biotineBioscience13-5902-82 
Streptavidin-BUV395BD564176
CD138-BV421BioLegend142508
CD4-BV510BioLegend100559
TCR ve beta;-BV605BD562840
CD45.1-BV711BioLegend110739
CD45.2-FITCBioLegend109806
PD-1-PEBioLegend135206
CD19-PerCPBioLegend115532
Fas-PE-Cy7BD557653
CXCR5-APCBioLegend145506
Sabitlenebilir Canlılık Boyası ef780eBioscience65-0865-18
CD4-BV421BioLegend100443
1.2 ml FACS tüp ekleri, raflıABD Bilimsel1412-1400
BD Falcon & trade; Yuvarlak Tabanlı BorularBD352017

Kaynaklar

  1. Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
  2. Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
  3. Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
  4. Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694(2011).
  5. Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
  6. Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
  7. Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
  8. Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899(1976).
  9. Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
  10. Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
  11. Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
  12. Petri, M., Orbai, A. -M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
  13. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246(2007).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  15. Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012).
  16. Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265(2007).
  17. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  18. Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , Available from: http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html (2009).
  19. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259(2010).
  20. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319(2007).
  21. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771(2012).
  22. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  23. Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928(2012).
  24. Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20(2003).
  25. Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5(2011).
  26. McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
  27. Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y. Nature. 376, 695-698 (1995).
  28. Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815(2003).
  29. Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
  30. Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
  31. Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
  32. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

BM12 ModeliT Foliküler Yardımcı HücrelerGerminal Merkez B HücreleriPlazma HücreleriAkış SitometrisiSplenosit TransferiAnti Nükleer AntikorlarGerminal Merkez Oluşumu
C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.