Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme 2+ Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Özet

Yaşlanmada hücre içi Ca²⁺ yeniden şekillenmesi, Ca²⁺ aşırı yükünün aracılık ettiği süreçler olan eksitotoksisiteye ve nöron hasarına katkıda bulunabilir. Bu çalışmada, bir nöronal yaşlanma modeli olan sıçan hipokampal nöronlarının uzun süreli kültürlerinde sitozolik ve mitokondriyal Ca²⁺'nın floresan ve biyolüminesans görüntülemesi kullanılarak yaşlanan beyinde Ca²⁺ yeniden şekillenmesini araştırmayı amaçladık.

Özet

Nörodejenerasyon ve iskemi ilişkili nöron hücre ölümüne Duyarlılık fazlasıyla yaşlı beyinde artmış, ancak sorumlu mekanizmalar kötü bilinmektedir. Eksitotoksisite, her iki saldırılar ile uyarılan nöron hasarına katkıda bulunduğuna inanılan bir yöntem, ^Ca2 + akışını ve mitokondriyal ^Ca 2 + aşırı teşvik glutamat reseptörlerinin aktivasyonu aracılık eder. Hücre içi ^Ca 2 + homeostazı hücre içi ^Ca 2 + homeostasis veya yeniden yapılanmasında önemli bir değişiklik eski nöronlar nöron hasarı lehine olabilir. Yaşlanma ^Ca 2 + yeniden modellemenin araştınlması için in vivo nöronlar arası bazı yönleri benzer sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültürlerde canlı hücre görüntüleme kullandık. Bu amaç için, hipokampal hücreleri ilk etapta, taze yeni doğmuş sıçan Hipokampuslardan gelen dağınık ve poli-D-lizin kaplı cam lamelleri kaplama vardır. Sonra kültürler birkaç gün boyunca kontrollü bir ortam içinde muhafaza veya W birçok edilirsırasıyla, genç ve yaşlı nöronların araştırılması için eeks. İkinci olarak, kültürlenmiş nöronlar fura2 ile yüklenir ve dijital fluoresan oranı görüntüleme kullanarak sitosolik ^Ca2 + konsantrasyonu ölçümlerine tabi tutulur. Üçüncü olarak, kültürlenmiş nöronlar mitokondri hedeflenen düşük meyil aequorin ve GFP bir tandem ifade eden plasmidler ile transfekte edilir. 24 saat sonra, hücre içinde aequorin koelenterazin ile yeniden ve nöronlar mitokondriyal ^Ca2 + konsantrasyonunun izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme tabi tutulur. Bu üç adım prosedür, örneğin glutamat reseptör agonisti NMDA ve bu ve diğer cevaplar yaşlanma etkilenir olmadığı karşılaştırma gibi ilgili uyaranlara sitosolik ve mitokondriyal ^Ca 2 + tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu prosedür nasıl etki sitozolik ve mitokondriyal Ca ²⁺ seçilen uyaranlara yanıtları yanı sıra nöron hücresi önlemeyi amaçlayan seçilen ilaçların test yaşlanma gibi yeni anlayışlar verebiliryaşla ilişkili hastalıklarda ölüme.

Giriş

Eksitotoksisite NOS'nin, iskemi gibi nörolojik akıntılar nöronal hasar ve hücre ölümüne neden olan en önemli mekanizmalardan biri olduğu ve Alzheimer hastalığı ¹ gibi nörodejeneratif hastalıklarda. Nörotoksisite Bu tip ağırlıklı Ca glutamat oyunculuk aracılık ²⁺ -geçirgen, İyonotropik NMDA reseptörleri (NMDAR) ^2. Glutamata kültürlenmiş nöronların nöronal apoptoz ⁴ neden eksitotoksisite ^3, yol açabilir. Biz ve diğerleri daha önce NMDA kaynaklı apoptosise nöronal açığı in vitro gelişimi ve ^5-8 yaşlanma değişebilir bildirmişlerdir.

Bu yaygın sitosolik içermeyen ^Ca2 + konsantrasyonu ^([Ca2 +] _cyt) 'de bir artış hücrelerin aktivasyonuna yol açtığı kabul edilmektedir. Bu artış çok yüksek ve / veya yeterince sürekli olduğu, ancak hücre ölümünü ⁹ tetikleyebilir. Ayrıca, önerilmiştirbu eksitotoksisite mitokondriyal ^Ca2 + alımı ^10, glutamat ile indüklenen hücre ölümü ¹¹ karşı mitokondriyal uncoupler korunan nöronlarla nöronları tedavi yana gerektirir. Mitokondri ^Ca 2 + çok fazla alırsan, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek açılması sitokrom c ve diğer pro-apoptotik faktörlerin ve uyaran apoptoz serbest lider oluşabilir. Son zamanlarda bu mitokondriyal ^Ca 2 + alımı doğrudan doğruya tek bir hipokampal nöronlar ⁵ NMDA ile indüklenen ^Ca2 + mitokondriyal alımını bu makalede rapor bir yöntemi ölçülerek, nörotoksitisi yaşa bağlı duyarlılık ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Böyle öğrenme, hafıza ve diğer bilişsel süreçler ¹² gibi fizyolojik süreçlerde yer hipokampus, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların ¹³ derece hassastır. Bu, in vitro olarak birkaç hafta sonra, ileri sürülmektedir, kültürlenmişhipokampal nöronlar yaşlı nöronlar ¹⁴ tipik özelliklerinden bir sayısını göstermektedir. Buna göre, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlar yaşlanma gelişmiş eksitotoksisitenin ^Ca 2 + aracılı mekanizmalar araştırmak için kapsamlı bir model sağlayabilir.

Sunulan yöntemin genel amacı, bu nedenle, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlarda NMDA reseptör agonistleri tarafından ortaya çıkarılan diferansiyel Ca ²⁺ yanıtları da dahil olmak üzere yaşlanan beyinde hücre içi ^Ca 2 + homeostazı veya Ca ²⁺ yeniden önemli değişiklikleri araştırmak amacıyla, bir . Yöntem sırasıyla, sıçan hipokampal nöronların kültürü ayrıntılı bir açıklamasını ve bireysel nöronlar floresan ve biyolüminesans görüntüleme Sitozolik ve mitokondrial ^Ca 2 + konsantrasyonları izleme içerir. Kültürlü nöronlar sitozolik Ca ^{2 +} floresan görüntüleme standart bir prosedürdür. Bununla birlikte, bu yöntem, alt için daha az güvenilirdirHücresel Ca mitokondriyal ^Ca 2 + ^{2 +} olmak üzere ölçümleri. Bu nedenleri bile mM düzeyinde düşük mcM seviyesinden mitokondri değişebilir ^Ca 2 + konsantrasyonları için sentetik probların uygun hedefleme ve uygunsuz afinite eksikliği sayılabilir. Örneğin aequorin gibi proteinlere göre ^Ca 2 + prob kullanımı, hücre içi organellere hedef ve spesifik Ca ²⁺ bağlama siteleri ¹⁵ eksik farklı coelenterazines veya mutasyona uğramış problar kullanılarak farklı türevleri ^Ca 2 + eğilimleri kullanımına izin verdi. Bu şekilde, mitokondri hedefli Aequorini eksprese eden hücrelerin biyoışıldama görüntüleme bireysel nöronlar mitokondriyal ^Ca 2 + konsantrasyonlarının izlenmesini izin verebilir. Ancak, bu işlem biyoparlaklık görüntüleme ^16-18 için foton sayma kameraları ya da ultrasensitif CCD kamera kullanımını gerektirebilir. Daha fazla establ teyit edilmelidir yeni sonuçlar doğurabilir Bu yöntemÖrneğin olarak ished beyin yaşlanması modelleri, eski hayvanlardan beyin dilimleri.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Avrupa Sözleşmesi 123 / Avrupa Konseyi ve Direktifi 86/609 / EEC sayılı ile anlaşarak Valladolid Üniversitesi hayvan barınağı tesisi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde ele alınmıştır.

Sıçan Hipokampal Nöronlar 1. Kısa ve Uzun Vadeli Kültürü

1. Poli-D-lisin hazırlanması, 12 mm cam lamelleri kaplama.
   1. En az 24 saat süre ile etanol içinde 12 mm çapında bir cam lamelleri sterilize edin. Bunları steril koşullar altında kurumaya bırakın.
   2. Petri kabındaki parafilm şeridi lamelleri dağıtın. 1 mg / ml poli-D-lisin 200 ul her bir lamel yüzeyi kapatılır. O / N tedavi izin verin.
   3. Ertesi gün, steril koşullar altında 90 dakika boyunca iki kez damıtılmış, steril su ile her 15 dakikada bir lamelleri yıkayın.
   4. Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ile dört sıra çok kaplı plaka Dolgu ile sabitleştirilir. Neurobasal Kültür Ortamı ile takviye edilmelidir% 10 fetal bovin serumu,% 2 B27, 1 ug / ml gentamisin ve 2 mM L-glutamin.
   5. Çok kaplı plaka lamelleri yerleştirin. Kullanılana kadar nemlendirilmiş 37 ° C ve% 5 _CO2 inkübatör koruyun.
2. Yenidoğan sıçanlarda hipokampal nöronlar izolasyonu.
   1. Steril koşullar altında, bir şişeye (20 ul / ml) içinde 1,8 ml papain çözeltisi (şirketinden satın alınmış) hazırlayın: 20 ul'lik bir son konsantrasyon elde etmek için / 1.8 mi Hank artı% 0.6 BSA içinde 40 ul papain ilave ml (ul hesaplanmalıdır ) satıcılar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Hank% 0.6 BSA% 4 sığır serumu albümini 15 ml HBSS ortamı 85 ml karıştırılması ile hazırlanır (BSA, 100 mi HBSS içinde BSA 4 g çözme hazırlanır). Steril bir kaput içinde hazırlayın.
   2. Kullanımdan önce 37 ° C 'de 30 dakika boyunca Hank artı% 0.6 BSA içinde papain inkübe edin. Kullanım öncesi 0,22 um filtre kullanılarak çözelti filtre.
   3. Dulbecco'nun ekleyerek Ham F-12 ortamı hazırlamakIki kez damıtılmış steril su içinde 900 ml Eagle Ortamı tozu (L başına 13.5 g) modifiye edilmiştir. Sonra 6 gr HEPES ve 336 mg NaHCO ₃ ekleyebilir ve NaOH 4 N. 1 L çözelti elde ve 0.20 mikron polietersülfon kullanarak filtrelemek için steril su ekleyin kullanarak 7.42 pH ayarlamak (PES) üst filtreyi şişe. Bir steril bir muhafaza içinde bu işlemi uygulayın. Sonunda Kullanmadan önce steril koşullar altında _CO 2 ile çözüm doyurabilecek. Mağaza çözümleri 4 ºC de ve onları soğutulmuş kullanın.
   4. Dekapitasyon yenidoğan (P0) fare yavrular Euthanize ve steril HBS orta kafa yıkayın. Steril makas yardımı ile kafatası açın. Bir spatula ile beyin ekstrakte edin ve Ham F-12 ortamı içinde hızlı bir şekilde yıkayın.
   5. Her yarımkürede (Şekil 1B) bir neşter yardımıyla bir çapraz kesim yapın ve Ham F-12 orta içeren Petri taşımak.
   6. Diseksiyon forseps yardımıyla ve büyüteç altında dikkatlice atın meninksler.
   7. büyüteç kullanarak korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda hipokampus tanımlayın. Sonra bir sınır dikkatlice çekerek ve göz makas kullanarak konumundan kaldırarak korteksten hipokampus ayırın.
   8. Steril Hank ortamında Ca ^{+ 2 ve} Mg yoksun ²⁺ artı% 0.6 BSA ile doldurulmuş bir 4-iyi levhaya hipokampal doku transferi ve hipokampal doku yıkayın. Çıkarmadan medya aynı göz makas kullanarak küçük parçalar halinde doku (2 x 2 civarında mm) kesti.
   9. 1,8 ml önceden süzüldü papain çözeltisi ihtiva eden bir şişeye hipokampal parçaları aktarın. Sonra sıra, hafifçe çalkalanarak 37 ºC'de inkübe. 15 dakika sonra, (nihai 50 ng / ml), DNase I çözeltisinin 90 ul ve 15 dk daha inkübe edilir.
   10. 10 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın ve taze Neurobasal Kültür Ortamı ile fragmanları yıkayın. 5 ml'lik plastik pip ile doku parçaları geçirerek hücre süspansiyonu eldeette.
   11. 5 dakika boyunca 160 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Bir plastik steril Pasteur pipeti kullanarak Süpernatantı ve Neurobasal Kültür Orta 1 ml pipet otomatik bir 1 ml dikkatlice pelet askıya.
   12. Bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücre yoğunluğu ölçün. Neubauer odasına üzerine cam lamel koyun. Hücre süspansiyonu 10 ul ekle. Hücre süspansiyonu homojen ve hiçbir kabarcıklar yapma odasına girer emin olun. Mikroskop altında hücrelerin sayısını ve 30 x 10 ³ hücre içeren 40-80 ul uygun bir damla elde etmek için gelen hesaplamaları gerçekleştirmek. Toplam hücre sayısı, kullanılan hayvanların sayısına bağlı olacaktır.
3. Kısa ve sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültür.
   1. Her bir ila yaklaşık 50 ul arasında bir damla yaklaşık 30 x 10 ³ hücreleri Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ihtiva eden dört oyuklu çok kaplı plaka üzerinde önce hazırlanan ve inkübatör plaka muhafazade bir poli-D-lizin kaplı 12 mm çapında bir cam lamel ihtiva eden çok kaplı plaka.
   2. Kültür değiştirmeden deneylerde önce in vitro 2-5 gün (DIV, kısa vadeli, genç kültürler) ya da> 15 DIV (Uzun vadeli, yaşlı kültürler) için nemlendirilmiş 37 ºC ve% 5 _CO2 inkübatör primer hipokampal hücreleri korumak Ortam.

Sitosolik Ca 2. Floresans Görüntüleme ²⁺ Konsantrasyon

1. Floresan görüntüleme test çözümleri hazırlanması.
   1. NaCl 145, KCI 5, _MgCl2 1, _CaCl2 1, glükoz 10, sodyum HEPES, 10 (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın.
   2. NaCl 146, KCI 5, glükoz CaCl ₂ 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış, ^Mg2 + içermeyen, HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın.
   3. Bir Fina NMDA ^Mg2 +, -ücretsiz olarak, HEPES-tamponlu salin (HBA) çözme100 mcM l konsantrasyonu ve 10 mcM glisin ile tamamlar.
   4. (MM olarak) çözerek yerine NaCl KCI ihtiva eden bir HBS çözeltisi hazırlayın: KCI 145, _MgCl2 1, _CaCl2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42) glikoz.
2. Floresan kalsiyum prob fura2 / AM ile hipokampal hücre yükleme.
   1. Inkübatör kapalı lamelleri içeren hücre kültürü alın ve 500 HBS ul başına iyi içeren yeni bir dört iyi çok kaplı plaka aktararak RT'de HBS ortamı ile yıkayın.
   2. Fura2 kuluçkaya bırakılır / karanlık bir yerde, oda sıcaklığında (25 ° C) sıcaklıkta 60 dakika boyunca (aynı HBA ortam içinde hazırlandı) AM 4 uM.
   3. 60 dakika sonra, taze HBS orta lamelleri yıkayın.
3. Sitozolik kaydedilmesi floresan görüntüleri ^[Ca 2 +] kültürlü hücrelerde.
   1. Lamba, mikroskop, perfüzyon sistemi, floresan kamera ve bilgisayarı açın.
   2. Bir termostatlı bir platformda lamelleriters mikroskop sahnede açık 12 mm cam lamelleri ve 40X objektif (1.3 yağ, NA) kullanarak mikroskobik alanı seçin. Ya da yokluğunda test maddelerinin mevcudiyetinde (37 ° C) önceden ısıtılmış HBS ortamı ile sürekli hücreleri serpmek. / Dakika yaklaşık 5-10 ml bir oranda akış muhafaza edin.
      Not: canlı hücreler için hücre perfüzyon Sistem, açık 12 mm cam lamelleri için termostatlı bir platform içine monte edilir. Bir valf kontrol cihazı ile donatılmış 8 hatları yerçekimi ile çalışan bir perfüzyon sistemi çözümleri serpmek için kullanılır. Bir vakum pompası herhangi bir aşırı yayıcıyı çıkarmak için sorumludur. Solutions içinde boru ısıtma sistemi kullanılarak ısıtılır.
   3. Deklanşör hem uyarma dalga boylarında kapalı bir arka plan görüntüsü yakalama.
   4. 340 ve 380 nm dönüşümlü hücreler Epi-aydınlatır. Tutanak ışığı 520 nm bir fura-2 dikroik ayna tarafından süzülür bir floresan kamera, her 5-10 sn yayılan.
   5. Kayıt süresi bittiğinde, tam sekans o saklamakf görüntüleri daha fazla analiz için bilgisayara 520 nm'de yayılan.
4. Kaydedilen floresan görüntü analizi.
   1. Deney dosyasını açın. AQUACOSMOS yazılımı kullanarak, 'Oranı' üzerine tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Oranı görüntü bir dizi elde etmek için elde edilen görüntüler olarak piksel oranı piksel hesaplayın.
   2. 'Arka plan eleme' ayarlayarak arka plan çıkarın. Basın 'başlangıç ​​hesabı'.
   3. Basın 'her zaman dizisi' düğmesi ve ilgi antik bölgeleri silmek (ROI). Tek tek hücrelerin kantitatif analiz için, bireysel nöronlar karşılık gelen faiz veya İB'nin yeni bölgeleri kurmak. Her ROI ve her görüntüye karşılık gelen her bir piksel ortalama tüm oran değerleri, bireysel ROI (hücreler) için bu oran floresan değerleri bir kayıt elde etmek.
   4. Bir grafik progr her ROI karşılık gelen oran floresan değerlerini ihraç bireysel kayıtları grafiğini içinduyuyorum.
   5. Uygun bir veri analizi kullanılarak her bir uyarıya cevap olarak oran floresanın artışların büyüklüğü tahmin edilmesi ve yazılımı grafik için ilgili hesaplamalar sağlayın.

Mitokondriyal Ca 3. Biyoparlaklık Görüntüleme ²⁺ Konsantrasyon

1. MitGAmut plazmid ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar transfeksiyonu.
   NOT: Hücreler ilk olarak mitokondri hedefli sekans ve yeşil flüoresan proteini (GFP) kaynaşmış bir ^Ca2 + bağlama sahası eksik mutasyona uğramış Aequorini içeren mitGAmut plazmid ile transfekte edilir. Bu yapı, mitokondriyal ^Ca 2 + alımı büyük artışlar algılar ve GFP floresan ile transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Plazmid geliştirilmiş ve nazik P. brulet ve birlikte çalışanlar ¹⁸ (CNRS, Paris, Fransa) tarafından temin edildi.
   1. Cenin sığır serumu eksik Neurobasal kültür vasatı içeren, Neurobasal TF Hazırlama, B27, gentamicve 2 mM L-glutamin.
   2. Neurobasal TF 50 ul artı bir viyal (Çözelti A) 2.5 ul transfeksiyon reaktifi hazırlayın. 50 Neurobasal TF ul artı 4 ug bir şişe içinde mitGAmut plazmid (Çözelti B) hazırlayın. Sallayarak olmadan 20 dakika boyunca karıştırma izin çözüm A. üzerinde hafifçe çözüm B ekleyin.
   3. Taze Neurobasal TF 200 ul içeren yeni çok kaplı plakalara hipokampal nöron içeren lamelleri aktarın.
   4. Her lamel üzerinde damla çözüm A + B 100 ul damla ekleyin. 30 dakika boyunca çalkalayarak kuluçkalayın. Orta çıkarın. Taze Neurobasal TF hücrelerin bir kez yıkayın. Orijinal Neurobasal Kültür Orta lamelleri dönün.
   5. 37 ° C ve% 5 transfeksiyonundan sonra _CO2 seviyesinde ilave bir 24 saat boyunca kültür nöronları etkin ekspresyonu ve probun hedef izin vermek.
2. Biyoparlaklık görüntüleme için deney çözeltilerinin hazırlanması.
   1. Olarak NMDA 100 uM ya da 145 mM KCI içeren HBS çözümler hazırlayınYukarıda (2.1 Adım). 10 mM Ca içeren ²⁺ artı 100 mcM digitonin HBS çözeltisi hazırlayın.
3. Coelenterazine n mitokondri hedefli aequorin Sulandırma.
   1. HBS 200 ul ihtiva eden bir dört plaka transfekte hipokampal nöronlar içeren transfer lamelleri.
   2. 4 uM'lik bir son konsantrasyon elde boyunca HBS'de 200 ul coelenterazine n (200 uM) 4 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. RT (25 ° C), 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edin.
4. Mitokondriyal kaydedilmesi biyolüminesans görüntüleri ^[Ca 2 +].
   1. Mikroskop, lamba, perfüzyon sistemi, biyolüminesans kamera ve bilgisayarı açın.
   2. Termostatlı bir (37 ° C) perfüzyon odasına yeniden lamelleri aktarın ve 5-10 ml / dk'lık bir oranda önceden ısıtılmış HBS çözeltisi ile sürekli olarak serpmek.
   3. 40X objektif (yağ, NA: 1.3) kullanılarak, a ifade hücreleri içeren mikroskobik alan seçinFITC filtreleri kullanarak yeşil flüoresan proteini (GFP) ekspresyonu ile bağlantılı bir floresan emisyonu ile gösterildiği gibi poaequorins. Tipik bir alanı 1-2 transfekte edilmiş hücreleri içerebilir. Bir CCD kamera kullanarak, GFP floresan görüntü yakalamak.
   4. Mikroskop ışığı kapatın. Işık yolunda bulunan dichroic içeren kutu çıkarın. Uyarma ışık kapatın ve tam karanlık koyu-kutusunu kapatın.
   5. Ya da test solüsyonları 37 ° C'de önceden ısıtılmış olmayan HBS ortamı ile 5-10 ml / dakika hücreleri serpmek.
   6. Fotonik emisyon görüntüleri bir görüntü işlemcisi ile ele bir foton sayma makinesi ile her 10 saniyede yakalayın.
   7. Her bir deneyin sonunda, kalan tüm foton emisyon serbest bırakmak için HBS'de 10 mM digitonin 0.1 mM _CaCl2 ile hücreleri geçirgenliği.
      Not: Bu fotonik emisyonlar toplam fotonik emisyonları, ^Ca 2 + konsantrasyonlarda kalibrasyon için gerekli bir değerini tahmin etmek için yukarı eklenmelidir <./ li>
   8. GFP ilişkili floresan görüntü ile bilgisayarda saklayın biyolüminesans görüntüleri foton sayma görüntüleme önce ele geçirdi.
5. Mitokondriyal ^[Ca2 +] yansıtan biyoışıldama görüntülerin analizi.
   1. Özel bir yazılım kullanılarak fotonik emisyonları ölçmek. Fotonik emisyon mitokondriyal serbest Ca dönüştürülebilir ^{2 + konsantrasyonu ([Ca2} +] _mit) Brini ve ark., ¹⁵ tarafından tarif edilen algoritmasını kullanarak yapar.
   2. Deney ve GFP floresan görüntüyü açın. Deneyin başında çekilen floresan görüntülerine göre transfekte hücrelerin şekli çizerek özel yazılım yardımı ile ilgi (ROI) Seç bölgeleri.
   3. Her görüntü aynı ROI yapıştırın. Her ROI toplam fotonik emisyonları zaman içinde her noktada her hücre için parlaklık emisyon değeri (L) elde etmek için özel bir yazılım ile hesaplanır.
   4. Tüm fotonik emiss ekleyinTüm fotonik emisyonları içeren bir biyoışıldama görüntü elde etmek, özel bir yazılım kullanarak, permeabilization digitonin sonra elde edilenler dahil biyoışıldama görüntüleri, iyonlar.
   5. Hesaplamalar için belirli bir yazılıma ilgi her bölge için fotonik emisyonların ihracat değerleri. Bunu yapmak için, her zaman her ROI için biyoparlaklık değerlerini hesaplamak için 'Grafik' üzerine tıklayın. 'Toplam değeri' seçin ve 'tüm görüntüleri mevcut yatırım getirisini kullanın. Basın 'hesapla'. Bir çalışma sayfasına 'txt.file' ve ihracat verileri kaydetmek. Her ROI için, ^[Ca 2 +] _mit aşağıdaki algoritmayı kullanılarak hesaplanır:
      
      ^[Ca2 +] (M) = [R + (R · K _TR) - 1] / [K _{R -} (R · K _R)];
      
      burada,
      R = [L / (L _toplam λ)] ^{1 / n}
      L ilgi her bölgede ölçüm zamanında yayılan lüminesan olup.
      L _toplamıdırÇevrede her bir bölgesi için ölçüm zamanında o anda dokusunda mevcut sayım eklenmesinden sonra kalan toplam lüminesans. λ, K _TR K _{R ve n,} değerleri aequorin kombinasyonuna bağlıdır (doğal tipte veya mutasyona uğramış) ile coelenterazin kullanılan (vahşi tip veya n tipi) sabitler yanı sıra kayıt sıcaklığı ¹⁶ bulunmaktadır. Burada kullanılan kombinasyon için 37 ºC'de, (AEQ ve coelenterzine n mutasyona uğramış), aşağıdaki değerleri kullanılır: K _R = 8.47 x 10 ^7, K _TR = 165,6 x 10 ^3, n 1204 ve λ = 0.138 =.
6. Uygun bir veri analizi kullanılarak her uyarıcıya yanıt olarak biyolüminesans artışların boyutunu tahmin ve yazılım grafik için ilgili hesaplamalar yapmak.

Sonuçlar

Burada ^Ca 2 + biçimlenme ve sitozolik ve mitokondriyal üzerindeki NMDA etkilerini değerlendirmek için basit bir yöntem tarif ^[Ca 2 +] yaşlı nöronlarda. Şekil 1 izole ve neonatal sıçanların hipokampal nöronlar kültürü için prosedürün şemasını göstermektedir. Başlamadan önce, steril, poli-D-lizin kaplı cam lamelleri hazırlamak ve 4-iyi bir çanak onları bulmak gerekir. Ardından, yenidoğan sıçanlar öldürüldü ve beyin kaldırılır. Hipokampus izole sonra, doku dikkatle papain ile disperse...

Tartışma

Yaşlanan beyinde hücre içi Ca ²⁺ yeniden şekillenmesi homeostasis bilişsel kaybı ile ilgili olmuştur, iskemik hasar, eksitotoksisite ve nörodejenerasyon yatkınlık artmıştır. In vitro bu hipotezi araştırmak için Ca ²⁺ görüntüleme prosedürleri mevcuttur. Ne yazık ki, eski hipokampal nöronlar uygulanabilir kültürleri güvenilir değildir. Son zamanlarda, bu gözlenmiştir olduğu sıçan hipokampal nöronlarının ROS birikimi lipofusin granüller, heterokromatik odaklar oluşumu, aktivasyon pJNK ve p53 ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nörobazal Kültür Ortamı	Gibco	21103-049
HBSS ortamı	Gibco	14170-088
Jambon F-12 ortamı	Gibco	31330-038
DNase I (sığır pankreasından)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobin Serumu	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamin	Gibco	25030-032
12 mm cam lameller	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4 kuyulu çok tabaklı plaklar	Nunc	176740
Petry tabakları	JD Catalan sl	2120044T
Steril pipetler	Fisher Scientific	431030
Fura2-	Yaşam Teknolojileri	F1201
Lipofektamin2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glisin	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV mikroskobu	Carl Zeiss Inc.
Xcite aydınlatma sistemi	EXFO
ORCA ER floresan kamera	Hamamatsu
VIM foton sayma CCD kamera	Hamamatsu
VC-8 valf kontrolörü	Warner Instruments
SH-27B ısıtma sistemi	Warner Instruments
Aquacosmos Yazılımı	Hamamatsu Fotonik