Kök hücre türevli kültürler, bulaşıcı hastalıkları modellemek için muazzam bir potansiyel barındırıyor. Burada, yetişkin kök hücrelerden türetilen fare ve insan mide organoidlerinin kültürü anlatılmaktadır. Organoidlere mide patojeni Helicobacter pylori mikroenjekte edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Enfeksiyon Hastalıkları Modeli Olarak Organoids: Helicobacter Pylori ve İnsan Kültür ve kemirgen Mide Organoids ve Mikroenjeksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
Son zamanlarda enfeksiyon biyologları, konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için yeni ve daha iyi modellere duyulan ihtiyacı karşılamak için kök hücre türevi kültürler kullandılar. Üç hücresel kaynak kullanılmıştır: Embriyonik kök hücreler (ESC), indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) veya yetişkin kök hücreler. Burada, yetişkin kök hücrelerden türetilen fare ve insan mide organoidlerinin kültürü tarif edilmekte ve mide patojeni Helicobacter pylori ile enfeksiyon için kullanılmaktadır. İnsan mide bezleri rezeksiyon materyalinden izole edilir, bir bazal matriks içine ekilir ve epidermal büyüme faktörü (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast büyüme faktörü (FGF) 10, gastrin ve transforme edici büyüme faktörü (TGF) beta inhibitörü içeren besiyerine gömülür. Bu koşullarda, mide bezleri midenin 4 soyunu içeren 3 boyutlu organoidlere dönüşür. Organoidler süresiz olarak genişler ve hücre dizilerine benzer şekilde dondurulabilir ve çözülebilir. Enfeksiyon çalışmaları için, bakteriler organoidlerin lümenine mikroenjekte edilir. Enfekte organoidler görüntüleme için işlenir. Açıklanan yöntemler, diğer organoidlere ve diğer bakteri, virüs veya parazitlerle olan enfeksiyonlara uyarlanabilir. Bu, birincil hücrelerde enfeksiyonun neden olduğu değişikliklerin incelenmesine izin verir.
Giriş
Patojenlerin çalışma, in vivo enfeksiyon taklit etmek için yeterli bir model sistemler kullanır. Kullanılan sistemlerin bazı optimum uzak iken bazı enfektif ajanlar için yeterli model sistemler eksiktir. Bir örnek nedensel mide kanseri gelişimi ile ilgilidir mide bakterisi Helicobacter pylori (H. pylori) 'dir. Yine daha uygun bir hücre kültürü sisteminde yokluğunda amacı birçok çalışma, kanserli kaskadının son nokta temsil kanser gelişimi kullanımı kanser hücre çizgisi altında yatan moleküler mekanizmaların, analiz etmek. Primer, dönüştürülmemiş hücreler bu çalışmalar için daha iyi bir model olabilir. Bununla birlikte, birincil hücreler donör az....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Mide organoid Kültür 1. kurulması
Not: Bu protokol, fare veya insan dokusundan gastrik bezleri izolasyonu için de kullanılabilir. Yaklaşık 1 cm² doku kullanılması tavsiye edilir. İnsan dokusu gastrik rezeksiyonu veya biyopsiler elde edilebilir.
- Malzemenin Hazırlanması
Not: Kullanılan bodrum matris Matrigel olduğunu. Her zaman buz üzerinde bodrum matrisi tutun. -20 ° C 'de taban matrisi saklayın ve kullanımdan önce buz üzerinde eritin. Bazal ortam HEPES Gelişmiş DMEM / F12 belirtir; Böyle Glutamax ve 1x Primocin uygun antibiyotikler gibi uygun bir glutamin kaynağıdır. Kullanılan kuluçka standart hücre kültürü kuluçka ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, gastrik bezleri (Şekil 2) ayrılmasına izin verir. Bezler organoids içine bezleri büyümeye izin laminin ve kolajen bakımından zengin bir 3 boyutlu bir çerçeve (Şekil 3) sağlanması, bir kuyu içinde damla olarak katılaşan temel matris içine ekilir. Organoids tipik haliyle küçük kistler başlar ve 12-16 gün içinde, bunlar 50-300 um (Şekil 4) bir çapa sahip olan küreler genişletmek. Bazı organoids bazı küçük buddings geliştirecek, kistik kalacak. İkincisi, genell.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, enfeksiyon biyolojisi için yetişkin kök hücrelerden sürekli genişleyen, dönüştürülmemiş birincil organoidlerin kullanımını açıklar. Kritik adımlar i) canlı bezlerin izolasyonu, ii) organoidlerin genişletilmesi ve iii) mikroenjeksiyondur. Aşağıda değişiklikler, sorun giderme ve teknik hususlar için bazı öneriler bulunmaktadır.
Bezleri serbest bırakmak için kuvvetli çalkalama veya pipetleme kullanan ve eşit derecede başarılı olabilen diğer izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığın.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hans Clevers, organoid kültürü için çeşitli patentlerin mucididir. Aksi takdirde yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, AB Marie Curie Bursu (EU/300686-InfO) tarafından S.B.'ye ve Birleşik Avrupa Gastroenteroloji Vakfı'ndan H.C.'ye Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. Teknik yardım için Harry Begthel, Jeroen Korving ve Hubrecht Görüntüleme Merkezi'ne, ilk organoid kültürü konusundaki yardımları için Meritxell Huch'a ve tartışma için Yana Zavros'a teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Orta | |||
| HEPES | Invitrogen | 15630-056 | |
| Gelişmiş DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Matrigel, GFR, fenol içermeyen | BD | 356231 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-079 | Stok konsantrasyonu 200 mM, nihai konsantrasyon 2 mM |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Stok konsantrasyonu 50 x, son konsantrasyon 1x |
| N-Asetilsistein | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stok konsantrasyonu 500 mM, son konsantrasyon 1 mM |
| Murin rekombinant EGF | İnvitrojen | PMG8043 | Stok konsantrasyonu 500 &mikro; g/ml, nihai konsantrasyon 50 ng/ml |
| İnsan rekombinant FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stok konsantrasyonu 100 &mikro; g / ml, nihai konsantrasyon 200 ng / ml |
| TGF ve beta; i A-83-01 | Tocris | 2939 | Stok konsantrasyonu 500 & mikro; M, son konsantrasyon 2 ve mikro; M |
| Nikotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | Stok konsantrasyonu 1 M, son konsantrasyon 10 mM |
| [Leu15]-Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | Stok konsantrasyonu 100 & M, nihai konsantrasyon 1 nM |
| RHOKi Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | Stok konsantrasyonu 10 mM, nihai konsantrasyon 10 &mikro; M |
| Wnt3A şartlandırılmış orta | Clevers Lab'da üretilen kararlı hücre hattı. Nihai konsantrasyon% 50. Hücreler Hans Clevers'ten elde edilebilir. | ||
| R-spondin1 şartlandırılmış ortam | Kuo Lab'da üretilen kararlı hücre hattı. Nihai konsantrasyon% 10. Hücre hattı Calvin Kuo, Stanford'dan elde edilebilir. | ||
| Noggin şartlandırılmış ortam | Clevers Lab'da üretilen kararlı hücre hattı. Nihai konsantrasyon% 10. Hücreler Hans Clevers'ten elde edilebilir. | ||
| R-spondin3 | Ar-Ge D | 3500-RS/CF | R-spondin için alternatif kaynak. Bu, insan bağırsağı organoidleri (1 & g / ml), ancak henüz mide organoidleri üzerinde değil. |
| Noggin | Peprotech | 120-10 | Noggin için alternatif kaynak. Bu, insan bağırsak organoidleri (100 ng / ml) üzerinde test edilmiştir, ancak henüz mide organoidleri üzerinde test edilmemiştir. |
| TrypLE express | Yaşam Teknolojileri | 12605036 | Enzimatik ayrışma çözümü |
| CoolCell® Alkolsüz Hücre Dondurma Kapları | biocision | BCS-405 | |
| Geri Kazanım Hücre Kültürü Donma Ortamı | Invitrogen | 12648-010 | |
| Antibiyotikler< / güçlü > | |||
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Bakteri ve mantarlara karşı bir antibiyotik bileşimi. Bir kültürün başlamasından sonra faydalıdır. Uzun süreli kültür için diğer antibiyotiklere geçebilir veya hiçbirine geçmeyebilirsiniz. |
| Penisilin / Streptomisin | Invitrogen | 15140-122 | Stok konsantrasyonu 10.000 / 10.000 U / ml, nihai konsantrasyon 100/100 U / ml. Uzun süreli kültürde Primosin'e alternatif olarak kullanılabilir. |
| Diğer | |||
| Cımbız | Neolabs | 2-1033 | İnce uçlu cımbız, kas tabakasının dokudan atılması için yardımcıdır. |
| 4 Kuyu Multidish | Thermo Scientific | 144444 | Diğer Multidish Yemekleri kullanabilirsiniz. Bunlar özellikle mikroenjeksiyonlar için yararlıydı çünkü düşük bir dış kenara sahipler ve manipülatör için daha fazla hareket kabiliyeti sağlıyorlar. |
| Mikromanipülatör | Narishige | M-152 | |
| Mikroenjektör | Narishige | IM-5B | |
| Stereomikroskop | Leica | MZ75 | |
| Tezgah | Temiz Hava | ML2 durumunda stereomikroskoba uyacak şekilde özel olarak üretilmiştir | |
| Kılcal damarlar | Harvard Aparatı | GC100T-10 | 1 mm dış çap, 0,78 mm iç çap. |
| Mikropipet Çektirme | Sutter Aletleri | Alevli Kahverengi Mikropipet Çektirme | |
| anti Cag A antikoru | Santa Cruz | sc-25766 |
Kaynaklar
- Aiuto, L., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells. PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).
- Penkert, R. R., Kalejta, R. F. Human Embryonic Stem Cell Lines....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
