Yöntem makalesi

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

20K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53384

⸱

23 Aralık 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

Bu makalede

Özet

Bu protokol, küçük bir yetişkin periferik kan hacminden kan büyümesi endotel hücrelerinin (BOEC'ler) güvenilir bir şekilde oluşturulmasına ve karakterizasyonuna izin verir. BOEC'ler, vasküler bozuklukları olan hastalardan alınan endotel hücreleri için bir vekil olarak ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin üretimi için bir substrat olarak kullanılabilir.

Özet

Tarihsel olarak, vasküler bozukluğu olan hastalardan primer endotel hücrelerinin sınırlı mevcudiyeti, bu bireylerde endotel disfonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesini engellemiştir. Bununla birlikte, yetişkin periferik kandaki dolaşımdaki endotelyal progenitörlerden üretilen kan büyümesi endotel hücrelerinin (BOEC'ler) yakın zamanda tanımlanması, hasta kaynaklı endotel hücreleri için endotel benzeri, birincil hücre vekili sunarak bu sınırlamayı aşabilir. Endotel biyolojisi ve hastalık modellemesini anlama değerlerinin ötesinde, BOEC'lerin endotel hücre nakli tedavilerinde potansiyel kullanımları vardır. Ayrıca, nükleer yeniden programlama yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) üretilmesi için uygun bir hücresel substrattır ve diğer hücre tiplerine göre bir dizi avantaj sunar. Bu ve diğer uygulamalarda kullanılmak üzere yetişkin periferik kandan BOEC'lerin güvenilir bir şekilde üretilmesi, kültürü ve karakterizasyonu için bir yöntem tanımlamaktayız. Bu yaklaşım (i) nispeten küçük bir yetişkin periferik kan hacminden hastaya özgü endotel hücrelerinin üretilmesine izin verir ve (ii) morfoloji, hücre sinyalizasyonu ve gen ekspresyonu açısından primer endotel hücrelerine oldukça benzer hücreler üretir.

Giriş

Yakın zamana kadar, yeni kan damarlarının doğum sonrası kuşak önceden var olan damarların endotel hücreleri yeni damarların filizlenmesi olarak tanımlanan anjiyogenez olarak bilinen bir süreç yoluyla sadece meydana inanılırdı. 1. Bu süreç vaskülojenezde gelen tezat veya embriyojenez esnasında özel olarak meydana geldiği düşünülmektedir endotelyal progenitör kan damarlarının de novo oluşumu. 2 Bununla birlikte, daha yeni çalışmalar, tanımlanmış ve yetişkin periferal kan endotelyal progenitör hücre (EPC) dolaşımdaki izole var. Bu hücreler, kültürde olgun endotel hücrelerine dönüştürmek kapasitesine sahiptir ve doğum sonrası vaskülojenez katılma inanılmaktadır. 3,4

Izolasyon ve bu EPC genişlemesi için protokoller, tipik olarak vascul de dahil olmak üzere endotel büyüme faktörlerini ihtiva eden ortam içinde periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) kültürünü içerirar endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü-2. 5-8 EPC kültürleri önemli ölçüde farklı hücre tipleri, çeşitli üretir. İlk kültürler (<7 gün) "erken" EPC olarak literatürde bilinen bir monositik hücre tipi, hakim. Kendilerine ait olmasına rağmen, bu hücreler, monosit işaretleme maddesi CD14 ifade progenitör işaretleyici CD34 için negatiftir ve klasik endotel belirteçler CD31 ve VEGF reseptör 2 (VEGFR2) sadece minimal seviyeleri ifade etmedi. 5 devam kültür hücreleri, ikinci popülasyonuna yolaçar endotel benzeri hücreler gibi gizli koloniler görünür Geç sonucudur EPC veya kan sonucudur endotel hücreleri (BOECs) olarak da bilinir. Monositik erken EPC aksine, aynı zamanda endotel koloni oluşturan hücreler (ECFCs), akıbet endotel hücrelerini ya da geç akıbet endotel hücrelerini adı olmuştur BOECs, endotel hücre mono tabakaları tipik arnavut morfolojisi gösteren ve yüzey işaretleyici son derece benzerdir5 ve gen ifadesi 9 endotel hücrelerini olgun.

Periferik kandan endotel benzeri hücrelerin üretimi özellikle de pulmoner arteriyel Hipertoni (PAH), 10 ya da von Willebrand hastalığı. 11. Önceki BOECs mevcudiyeti, endotel gibi vasküler bozukluklarla ilgili endotel hücre fonksiyon bozukluğunun çalışma için, pek çok avantaj sunar hücreler sadece doğumda umbilikal ven ölüm ya da organ nakli, veya izole edilmiş anda nakledilmiş organ elde edilebilir. Bu azaltılmış durumu kardiyovasküler bozuklukların yanı sıra, endotel hücreleri ve ya kan hücreleri veya duvar hücreleri arasındaki etkileşim hastalardan endotel hücrelerinin biyolojisi anlamak için ciddi bir sınırlama temsil etmektedir. Ayrıca, izole ve bu kaynaklardan endotel hücrelerinin saf nüfusu kültüre teknik açıdan zor ve bu yöntemlerle elde edilen hücreler sadece bir limite sergileyend proliferatif kapasitesi. BOECs nedenle hasta kaynaklı primer endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için değerli bir vekil sunuyoruz.

In vitro uygulamalara ilave olarak, aynı zamanda BOECs otolog hücre nakli tedavileri de muhtemelen yararlıdır. Bu uygulamalar, 13 BOEC türetilmiş iPSCs hastalığı modelleme için kullanılabilir neovaskülarizasyonu (burada 12 ve referanslara bakın) teşvik etmek için her iki endotel hücre nakli, hem de uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin üretilmesini (iPSCs). Içerir ve başlangıç ​​olarak büyük potansiyel sunmaktadır otolog hücre tedavileri için malzeme. BOECs hızlı ve deri fibroblastlar daha yüksek verimlilik ile yeniden programlayın. Bundan başka, aynı zamanda BOECs translasyonel uygulamalar için uygun olacak herhangi bir teknoloji önemli bir özelliğidir karyotipik anormallikleri, serbest olan iPSCs üretimi için izin verir. Bir hasta bir kan örneği A iPSCs oluşturma yeteneğiLSO böylece yara iyileşmesi bozuklukları, ya çok genç olan hastalardan hücrelerinin üretilmesini kolaylaştıran bir cilt biyopsisi gereksinimini ve cilt fibroblast üretimini ortadan kaldırır.

Aşağıda ayrıntılı protokol tarafından onaylanan ve Ulusal Araştırma Etik Servis Komitesi (Doğu İngiltere) yönergelerine uygun olarak yapılan, nispeten küçük bir birimden% 90'dan fazla verimlilik BOECs üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem (60 sağlar mi), periferal kan. Bu hücreler yüksek proliferatif ve tek bir kan örneğinden hücre yüz milyonlarca üretimi için izin defalarca geçişli olabilir.

Protokol

BOEC kuşak protokolünün şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Kan Toplama ve Yoğunluk Gradient Santrifüj

  1. Her bir donör, iki 50 ml konik santrifüj tüpleri her sodyum sitrat 3 ilave edin. Damar delme ile kan 60 ml toplamak ve her tüpe 30 ml ekleyin. Karıştırmak için hafifçe 2-3 kez ters çevirin. Buna göre ayarlanır sitrat hacimli, protokol kan az 40 kadar ml kullanın.
    NOT: Bu kan örnekleri alındıktan sonraki 2 saat içinde işlenir esastır. Outgrowth koloni verim belirgin bir azalma kan sonuçlarının işlenmesi Gecikmeli.
  2. İlk şişeyi karıştırmak için birkaç kez ters çevirerek yoğunluk gradyan santrifüj ortamı içeren yeni konik tüpler hazırlayın. Steril bir başlık olarak, 50 ml konik bir tüp başı (kan, her 10 ml donör başına 6 tüp 1 tüp) yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamının 15 ilave edin.
  3. Dulbecco'nun Fosfat ile 1: 1 seyreltin kan-buffered Salin (DPBS). Çalışma yüzeyi ile 20 ° 'lik bir açıya yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamı içeren tüp yatırın. Bir pipet yardımı ve 25 mi serolojik pipet kullanarak, yavaş yavaş yavaş eğimli borunun duvar aşağı kan eklenerek ortam üzerine seyreltilmiş kan 21 ml katman.
    NOT: Aksi takdirde yoğunluk gradyan tabaka ile kan karışmasını en aza indirir ve daha sıkı buffy coat, hem de artan bir verimdeki üretecektir.
  4. 35 hızlandırıcı ile oda sıcaklığında dakika ve fren kapalı 400 xg'de Santrifüj örnekleri.
  5. 2.4 - Bu santrifüj döneminde adımlar 2.1 detaylandırılan kollajen kaplama başlar. Bu adımlar 3.1 adıma geçmeden önce tamamlanmıştır olun.

T-75 balonuna ve kültür besiyeri Preparasyon 2. Kolajen Kaplama

NOT: Bir hücre kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.

  1. Stok Ty seyrelterek bir 50 ug / ml kolajen çözeltisi hazırlayın. I 0.02M asetik asit Örnek 10 ml kolajen pe: kolajen stok için 4.05 mg / ml konsantrasyonda, 0.02 M asetik asit 10 ml kolajen 123.5 uL ekleyin. Steril filtre kollajen süspansiyonu, kullanımdan önce.
  2. Serolojik bir pipet kullanarak, bir T 75 hücre kültürü şişesine kolajen çözeltisi 7,5 ml ekleyin. Bu hacim 5 ug kollajen / cm 2 (veya 375 ug / şişesi) verir. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile kaplayın şişe.
  3. Üretici tarafından sağlanan büyüme faktörü takviyeleri ile endotel bazal ortamı ilave ile BOEC üretimi için kullanılan endotelyal büyüme ortamı hazırlayın. Tüm takviyeleri ekleyin, ancak serum ilave etmeyiniz. , BOEC üretim ortamının 15 ml hazırlamak büyüme faktörü eklemeleri içeren endotelyal büyüme ortamı, 12.5 ml tanımlanır fetal sığır serumu (FBS), 2.5 ml ekleyin.
  4. , 1 saat kaplama süresinden sonra Bölüm 3'te belirtilen adımlara devam kollajen çözüm aspirat ve pipetleme kalan asetik asit silsin10 ml DPBS. DPBS kapalı aspire ve bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın. Aşama 3.3 sırasında elde edilen hücre süspansiyonu, şu anda kaplama hazır değilse, kurutma-out kolajen kaplama tutmak için şişeye BOEC üretim ortamının 5 mL ekleyin.

3. Toplama ve PBMNCs ve Kaplama

  1. Aşama 1.4'te tarif yoğunluk gradyan santrifüjü takiben, dikkatli bir şekilde, steril plastik bir transfer pipeti kullanarak, ince beyaz tabaka faz toplanır. Buffy coat toplanması her tüpten hücre süspansiyonu ve plazma yaklaşık 20 ml vermelidir. Yoğunluk gradyan ortamı transfer kaçının.
  2. Mononükleer hücre süspansiyonu 1 seyreltilir: DPBS'de 1 ve karıştırmak için ters. Maksimum fren ile gaz pedalı 300 x g'de 20 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin.
  3. Santrifüj işleminin ardından, basılı art arda her bir topağa BOEC üretim ortamı, 1 ml ilave edilmesi ve yukarı ve aşağı pipetleme süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Havuz hücresi bir süspansiyonlarıKalan ortamı ile 10 ml d kontör toplam hacim.
  4. Toplam hücre sayısı, örnek hücre süspansiyonu 10 ul bir tahmin almak ve kırmızı kan hücreleri lyse olacak Türk'ün solüsyonu 490 ul ile 50x sulandırmak için. Bir hemositometre kullanılarak seyreltilmiştir hücre süspansiyonu, 10 ul numune sayısı.
    NOT: Kan 60ml kaplama için yaklaşık 100-150 x 10 6 beyaz kan hücrelerini boyun eğmek zorundadır.
  5. Tek bir kollajen kaplı T-75 balon içine Plaka tüm hücre süspansiyonu,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C 'de 15 mL / şişe ve kültür üst kadar orta hacimli. Bu anda kaplama hücreler pasaj 0 temsil etmektedir.
    Not: Bu, daha sonraki bir zamanda veya BOECs oluşturulabilir farklı laboratuara PBMNCs taşımak amacıyla BOECs elde etmek amacıyla, önceki BOEC izolasyon izole PBMNCs dondurmak mümkündür. Bununla birlikte, bu dondurma PBMNCs BOEC izolasyonun etkinliğini azaltabilir dikkat etmek önemlidir. Syöntemi için aşağıdaki ee bölüm 8.

4. Uzun süreli Hücre Kültürü

  1. Taze BOEC üretim ortamının 15 ml ekleyerek ortam her 2 günde değiştirme (5: endotelial hücre büyüme ortamı 1 karışımına FBS tanımlanır). Hafta sonları için, orta değişiklikler her 3 gün gecikebilir.
    NOT: akıbet koloniler kültür 7 ve 14 gün arasında görünmelidir.
  2. Akıbet kolonilerin görünümü için gün 7-14 BOEC kültür şişesi izleyin. Klasik endotel Arnavut kaldırımı morfolojisi sergileyen hücreler dairesel grupları gibi koloniler tanımlayın.
  3. Koloni ya da çoklu koloniler bir şişe içinde tespit edildikten sonra, ortam değişiklikleri ile devam eder ve koloniler pasajlarının önce koloni başına yaklaşık 1000 2.000 hücrelere büyümeye olanak sağlar. Kaba bir görsel tahmin ile koloni başına hücre sayısını belirler.
    NOT: Bir rehber olarak, bir hafta birinci akıbet kolonisinin tanımlanmasından sonra geçit ilk akıbet kolonileri adettendir.
  4. DPBS 10 ml ile iki kez durulama ile şişeler Geçiş hücreleri. 1X Tripsin-EDTA 5 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. 5 dakika sonra, ortam (FBS ihtiva eden) 10 ml tripsin nötralize etmek ve tekrar pipetleme ile süspansiyon haline hücreleri getir.
  5. 5 dakika boyunca 300 x g'de, taze BOEC üretim ortamının 15 ml tekrar süspansiyon ve yeni bir T-75 balonuna (temsil kanalı 1, P1) içine tüm bir hücre süspansiyonu plaka santrifüjleyin süspansiyon. Hiçbir kollajen kaplama gereklidir.
  6. Hücreler birleştiklerinde, (kap başına yaklaşık 3-5 x 10 6 hücre) kadar yukarıda tarif edildiği gibi orta değişiklikler devam edin. Birleşmiş sonra, geçit hücreleri adım 4.3 de tarif edildiği gibi.
    Not: itibaren geçit 2, hücreler artık BOEC nesil orta gerektirir ve endotel hücre büyüme ortamı ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş, standart FBS içinde kültürlenebilir. Kollajen varlığı BOEC prolifer artırabilirsiniz olduğunu gösteren kanıtlar var gibi Kollajen kaplama, isteğe bağlı bir adım ileri gidiyor olarak kullanılabilirtirme oranları.
  7. Devam Pasajlanması, plaka T-75 balonuna başına hiçbir az 750.000 den hücreleri için düşük hücre yoğunlukları BOECs çoğalan durmasına neden olabilir.

5. Donma ve Çözülme BOEC Kültürleri

  1. 5 dakika boyunca 300 xg'de bölüm 4.3 ve santrifüj açıklandığı gibi hücreleri Trypsinize. Ortam, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Bu endotelial hücre büyüme ortamı gerektirmez; 10%, standart FBS bulunan DMEM yeterli olacaktır. Bir hemositometre kullanılarak el ile hücre sayımı gerçekleştirmek için hücre süspansiyonu, 10 ul numune toplayın.
  2. Buz soğukluğunda kriyoprezervasyon ortamında (% 50 FBS ve% 10 DMSO ile% 40 DMEM) 'de 2x10 6 hücre / ml'de tekrar santrifüj ve süspansiyon haline getirin. Bir buz soğuk izopropanol dondurulması gemi ve yerinde 0.5 ml (10 6 hücre) her şişeye, yer şişeleri ekle -80, en az 2 saat ° C derin dondurucuda sıvı nitrojen aktarmadan önce. Birden fazla 24 saat boyunca -80 ° C 'de hücreler bırakma.
  3. Hücreler çözülme 15 ml konik santrifüj tüpüne önceden ısıtılmış ortam 10 ml ekleyin.
    NOT: pasajı 1 hücreleri çözdürme zaman çözdürme sonrası ilk 2 gün FBS tanımlanmış% 20 ile desteklenmiş endotel hücre büyüme ortamına çözülme. Bu daha kararlı bir hücre izolasyonu ileriye yol açar.
  4. Sadece küçük bir buz kristali şişe içinde kalana kadar hafif bir çalkalama ile 37 ° C su banyosu içinde, sıvı azot ve çözülme hücreleri çıkarın. Konik santrifüj tüpüne flakon damla damla içeriğini ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 xg'de aşağı doğru döndürün.
  5. 10 ml EGM-2mV +% 10 FBS içinde Süpernatant aspire ve tekrar süspansiyon hücre pelet. 15 ml T-75 şişesi ve kontör orta ekleyin.

Akış Sitometrisi ile BOECs 6. Karakterizasyonu

  1. Lekeleme tampon maddesi içinde ml başına 10 6 hücre konsantrasyonunda bölüm 4.4 ve tekrar süspansiyon tarif edildiği gibi, Bölüm 4'te tarif BOEC koloniler trypsinize hücreleri genişletmek için izin verilmiş sonra (DPBS with% 2 FBS ve 2 mM EDTA).
  2. CD45, CD14, CD34, CD31 (kullanım 01:20 seyreltme tüm) veya VEGFR2 (sulandırmak 01:10) yöneltilen florokrom-konjuge antikor (detaylar için bakınız Tablo 1) ile 10 5 hücreleri birleştir. Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika kuluçkalayın.
  3. 1 ml 5 dakika boyunca 300 xg'de tampon ve santrifüj boyama hücreleri yıkayın. Süpernatant aspire ve analiz için 400 ul tampon boyama tekrar süspansiyon. 4 ° C'de tutun hücreleri ve ışıktan analizden önce korunmaktadır.
  4. Deneyde kullanılan floresan konjuge antikorları tespit etmek için donatılmış bir sitometresindeki sitometrik analizi yapın.
  5. İleri ayarlama ve yan dağılım gerilimleri yanı sıra FITC ve APC kanallar için gerilimler tarafından sitometresindeki hücre popülasyonunu belirlemek için bir lekesiz BOEC örneği kullanın.
  6. Her florokrom için izotip lekeli hücreleri kullanarak eşik yolluk belirleyin. Presenc dayalı olarak her bir hücre yüzey markörü için pozitif değerlendirilmesiflorokrom için izotip kontrol grubuna kıyasla flüoresans yoğunluğunda bir pik kayması e analiz edilir.

Immunofluorescent Mikroskopi BOECs 7. Karakterizasyonu

  1. Endotelial hücre büyüme ortamı 500 ul 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda lamelleri olmadan 24 oyuklu düz dipli doku kültür plakasında Plaka BOECs +% 10 ısı ile inaktive edilmiş oyuk başına FBS ve bağlı ve 37 ° C'de büyümeye bırakın ° C, hücreler kadar% 5 CO2, en az 70-80, her yüzey alanının% de (hafif microsope altında görsel inceleme ile tahmini konfluent) kapsamaktadır.
  2. DPBS 1 ml 5 dakika boyunca her bir hücrelerin yıkayın.
  3. DPBS içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi 500 ul 4 ° C 'de hücreler O / N sabitleyin.
  4. Oyuk başına DPBS 1 ml 3 x 5 dakika boyunca hücreler yıkanır. Ekleyin ve sırasıyla bir pipet ve bir aspiratör kullanarak DPBS kaldırmak.
  5. DPBS içinde% 0.2 polisorbat 20, 3 x 10 dakika boyunca hücreler geçirgenliği.
  6. DPBS içinde% 10 FBS içeren bloke edici tampon içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe hücreleri.
  7. 4 ° CO de leke hücreleri antikor seyreltme tamponu CD34 (10 ug / ml), CD144 karşı birincil antikor ihtiva eden (DPBS içinde% 0.1 sığır serum albümini) içinde 300 ul / N (1: 300) ya da vWF (1: 250) . Tüm ayrıntılar için Tablo 1'e bakınız.
  8. DPBS ile 5 x 10 dakika boyunca, bağlanmamış birincil antikor yıkayın.
  9. (: 200, 1 hiç) Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe hücreleri.
  10. DPBS ile 5 x 10 dakika boyunca Bağlanmamış ikinci antikorları yıkayın.
  11. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol 1 ug (DAPI) ile hücrelerin inkübe edin.
  12. Bir başka 3 x 5 dakika boyunca DPBS ile hücrelerin yıkayın.
  13. Bir takmak kullanarak floresan uyarma için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış ters bir mikroskop kullanılarak 100x büyütmede görüntü hücreleri ve yakalama görüntülerisonraki analiz çevrimdışı için ed dijital fotoğraf makinesi.

8. Donma ve Çözülme PBMNCs

  1. Santrifüj sonraki aşamada 3.2 sonunda, orta aspire ve manuel tekrarlanan pipetle kadar olan ve bir P1000 pipet kullanarak aşağı hücre pelet bozabilir. Bir hücre süspansiyonu üretmek için hafifçe karıştırın emin olarak, dondurma ortamı,% 90 serum ve% 10 DMSO 1 ml ilave edilir. Bir cryovial hücre süspansiyonu aktarın ve dondurma ve Bölüm 5'te açıklandığı gibi çözülme.

Sonuçlar

Kan 60 ml ince beyaz tabaka mononükleer hücrelerin izolasyonu, tipik olarak 100-150x10 6 toplam beyaz kan hücreleri elde edilir. Tek bir T-75 balonuna kaplanmıştır zaman, çözünen hücre süspansiyonu içinde hücrelerin çok sayıda zor aydınlık mikroskobu kullanılarak tek tek yapışmayan hücreler çözmek için yapar. Tekrarlanan orta değişiklikler yapışmayan hücrelerin temizlenmesi neden olur ve "erken" EPC monositik adherent nüfusun görselleştirme için izin verir. Gün 7 'de, T-75, yaklaşık 7x10 6, bu uzunlamasına yapışan hücrelerin içerecektir. 7 ila 14 günlük itibaren BOECs kolonileri şişesi (Şekil 2A) içinde görünmelidir. Koloniler, ilk olarak 3-5 bitişik hücreleri görünür. Dışsal gelişimi koloni sayısı kan 60 ml başına 1 ila 10 kolonileri arasında değişebilir. Genellikle genç donör (yani 20-25 yaş) aynı zamanda daha önceki kültür görünen akıbet kolonilerinin, daha fazla sayıda üretme eğilimindedir.BOECs birkaç yüz hücrelerden oluşan, dairesel koloniler oluşturmak için hücre, bu merkezi gruptan çoğalır. Bu kolonilerin içinde hücreler klasik endotel Arnavut kaldırımı morfolojisi sergilerler.

Onlar koloni başına yaklaşık 1000 hücreler içeren zaman geçit ilk kolonileri tercih edilir. Akıbet koloniler tipik 7 gün kültürde orijinal görünümünü sonra bu büyüklüğe ulaşmak. Kolonisi yeni bir T-75 balon içine geçişli sonra, 5 gün ya da daha az (Şekil 2B) olan bir konfluent tek tabaka (kap başına 3-5x10 6 hücre) oluşturacak şekilde prolifere gerekir. Izolasyonların küçük bir yüzdesi olarak (<% 10), akıbet koloniler görünmesini başarısız ya da bu ilk Pasajlanması adımı takip yeterince prolifere yok. Ilk Pasajlanması sonra düşük çoğalmasını sergileyen BOECs nadiren kararlı BOEC izolasyonlar olmak ve sık sık iki ya da üç pasajlar içinde çoğalan durdurmak için gidin. MonositikBOEC kültürleri içinde bulunan ilk EPC proliferatif olmayan ve tipik olarak 1-2 kanallarda kültürlerden temizlenir. Bu erken hücrelerin Gümrükleme hücre ölümüne nedeniyle erken hücrelerin yetersizliği Pasajlanması ve tekrarlanan Pasajlanması olmayan proliferatif erken EPC seyreltme sonra tekrar yapışma.

Geçiş 1 hücreler ya kültür içinde pasajlanmağa veya daha sonraki kullanım için aşağı dondurulabilir. Stabil bir yalıtım oluşturulur sonra hücreler kadar latent olmadan önce geçit 8 veya 9'a kadar 3-5 yeni T-75 şişelerinde 1 konfluent bir şişeye bir oranda geçişli olabilir. Yine, hücre yoğunluğu, kültür boyunca önemlidir. Deneyimlerimize göre, herhangi bir daha az 750,000 daha hücre büyümesi durmalarına neden olabilir daha düşük hücre yoğunlukları gibi, T-75 balonuna kaplanmıştır edilmelidir. BOECs yüksek proliferatif potansiyele rağmen, hücreler de overconfluent haline gelmesine izin verilmemelidir (örn.,> Şişeye başına 5x10 6 hücre) Bu oturumlar neden olabilir Bir non-proliferatif fenotipe BOECs iyon.

Biz BOEC endotel belirteçler için uygun hücre yüzeyi ve hücre içi boyama görüntüler gerektiği gibi herhangi bir hücre etiketli olmak öneriyoruz. BOECs karakterizasyonu tipik endotelial hücre markörleri için işaretlemeden sonra, akış sitometrisi (Şekil 3) ya da floresan mikroskobu (Şekil 4) ile elde edilebilir. BOECs endotel yüzey belirteçleri CD31 ve VEGFR2 için pozitif ve monosit işaretleyici CD14 ve pan-lökosit işaretleyici CD45 için negatiftir. BOECs ayrıca Weibel-Palade organları posess ve dolayısıyla ayrık, noktasal sitoplazmik boyanma olarak Von Willebrand Faktör (vWF) ifade eder. Pulmoner arter veya aort endotel hücreleri gibi diğer olgun endotel hücre tipleri, aksine BOECs da yüzeylerinde progenitör ve aktivasyon markeri CD34 ifade eder.

ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/>
Endotelyal büyüme ortamı içinde, kolajen kaplı plakalar üzerinde Şekil 1. BOEC nesil protokol şematik diyagramıdır. Periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, yoğunluk gradyan santrifüjü ile damar kanından izole edilir ve kültürlenmiş FBS tanımlandığı içeren. BOEC koloniler kültür 7-14 gün içinde ortaya çıkar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-1
Şekil temsilcisi BOEC kültürlerin 2. aydınlık görüntüler. (A) akıbet koloniler Arnavut kaldırımı tek tabaka halinde düzenlenmiş ve merkezi bir noktadan radyal dışarı çoğalırlar endotel benzeri hücrelerin, koleksiyonları olarak mevcut günlerde 7 ve 14. Kolonileri arasındaki kültürler görünür. Etraftaki akıbet kolonileri yapışık monoErken kültürlerde hücrelerin büyük çoğunluğunu oluşturan cytic hücreleri. Daha önce açıklanan bu hücreler, "erken" endotel progenitör hücreler, bir iğ şeklinde bir yapıya sahip ve monositik işaretleyici CD14 ifade eder. Non-proliferatif monositik hücreler ölür veya Pasajlanması sonra yeniden takmak için başarısız ya da (B) pasajlayarak ardından, yüksek proliferatif BOECs, kültürler devralacak. Ölçek çubuğu 250μm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil akış sitometrisi ile BOECs 3. karakterizasyonu. BOECs tripsinize edilmiş ve spesifik yüzey belirteçleri (kırmızı çizgi) karşı floresan-konjuge izotip kontrol antikorları (dolu zirve gri) ya da antikorları ile boyanmıştır. Sitometrik karakterizasyonu için yüzey belirteçlerihematopoetik belirteçler CD45 ve CD14, endotel belirteçler CD31 ve VEGFR2 ve progentior ve endotel aktivasyon belirteci CD34. dahil bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Endotel hücre işaretleyicileri için BOECs Şekil 4. immünofloresan boyama. BOECs bölgesinin Örnek immünofloresan görüntüleri endotel hücre yüzey işaretleyici CD144 karşı antikor (-kaderin, -ve sağ üst panel) ve kan glikoproteini von Willebrand faktörü (vWF, sağ alt panel) immunohistokimyasal . Nükleer DAPI boyama gösteren tekabül eden panelleri solda gösterilir. Ölçek çubuğu 50um. CD144 için. bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Tartışma

BOEC'lerin yetişkin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMNC'ler) sağlam ve verimli bir şekilde türetilmesine izin veren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz, önceki BOEC izolasyon yöntemlerindeki ilerlemeleri temsil eden iki önemli iyileştirmeyi içermektedir. 14-16 Bunlar, başlangıçtaki PBMNC kültür ortamında heparin bulunmamasını ve tanımlanmış, embriyonik kök hücre onaylı serumun kullanımını içerir. Bu son iyileştirme özellikle önemlidir. Embriyonik kök hücre (ESC) onaylı serum, daha tutarlı bir serum sınıfıdır ve serumda BOEC izolasyonuna fayda sağlayan hangi bileşen(ler)in zenginleştirildiği henüz bilinmemekle birlikte, bu tanımlanmış serumun BOEC üretiminin etkinliği üzerindeki etkisi bizim elimizde açıktır. Ek olarak, insan serumu kullanarak BOEC'leri izole etmede de başarılı olduk, böylece klinik çeviri için BOEC'lerin üretilmesine izin verdik. Elimizde, bu rafine protokol, stabil BOEC kültürlerinin donörlerin %90'ından fazlasından başarılı bir şekilde izole edilmesiyle sonuçlanır ve bu da onu şimdiye kadar bildirilen en güvenilir BOEC üretim yöntemlerinden biri haline getirir. Belirli serumların kullanımı BOEC üretimi için kritik öneme sahip olsa da, aynı zamanda mevcut protokolün birincil sınırlamasını da temsil eder. Teknikte gelecekteki gelişmeler, bu hücrelerin serumsuz, tanımlanmış kültür koşullarında üretilmesini içerebilir.

Protokoldeki Kritik Adımlar, kan örneklerinin toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede işlenmesini, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeden sonra buffy coat hücrelerinin tamamen toplanmasını ve ilk kolonilerin P0'dan P1'e zamanında geçirilmesini içerir. Bu geçiş adımı, istikrarlı bir izolasyonun oluşturulması için kritik öneme sahiptir. Diğer endotel hücreleri gibi, BOEC'ler de kaplama yoğunluğuna çok duyarlı görünmektedir. Geçişten sonra kaplama yoğunluğu çok düşükse, BOEC'ler çoğalmayacaktır. Tersine, kolonilerin geçmeden önce aşırı birleşmesine izin verilirse, hücreler de çoğalmayı durduracak ve uzun, mezenkimal hücre fenotipine dönüşme eğiliminde olacaktır. 7 ila 14. günler arasında birkaç koloni ortaya çıkarsa veya kolonilerin boyutu küçükse, sorun giderme, P0 kolonilerini bir T-75 yerine bir T-25 şişesine geçirerek hücre yoğunluğunu artırmayı içerebilir.

Tekniğe hakim olunduktan sonra, ortaya çıkan BOEC'ler, endotel hücre biyolojisinin in vitro çalışmaları, hastalık modellemesi ve ilaç taramasının yanı sıra in vivo hücre nakli tedavileri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Herhangi bir hücre terapisi sürecinin geliştirilmesinde önemli bir husus, patojenik mutasyonlardan arınmış hücrelerin kullanılmasıdır. Protokolümüz kullanılarak izole edilen BOEC'lerin, kopya sayısı varyasyonlarından arınmış genomlara sahip olduğunu ve bu nedenle toplandıkları bireyi temsil ettiğini daha önce göstermiştik. Ek olarak, BOEC'den türetilen iPSC hatlarının çoğunun kopya sayısı varyasyonlarından arınmış olduğunu da gösterdik. 13 Bu, fibroblasttan türetilen iPSC'lerdeki kopya sayısı varyasyonuna ilişkin önceki raporlarla çelişmektedir. Bugüne kadar, bu hücreler, bu derecede genomik doğruluğun rapor edildiği tek iPSC'ler olmaya devam etmektedir. Bu özellik, iPSC biyolojisi alanı ve iPSC'lerin hastalık modelleme, ilaç taraması ve gelecekteki hücre nakli tedavilerinde kullanımı için önemlidir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, İngiliz Kalp Vakfı (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Vakfı, Fondation Leducq, Fight for Sight, Cambridge Biyomedikal Araştırma Merkezi, Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü tarafından finanse edilen hibelerle desteklenmiştir: (i) BHF Oxbridge Rejeneratif Tıp Merkezi [RM/13/3/30159], (ii) BHF Cambridge Araştırma Mükemmeliyet Merkezi, (iii) Addenbrooke's Hastanesi, Cambridge Üniversitesi Hastaneleri NHS Foundation Trust ve (iv) Papworth Hastanesi NHS Foundation Trust ve Cambridge NIHR BRC Hücre Fenotipleme Merkezi'ni destekledi. MLO, bir BHF Orta Düzey Bursu tarafından finanse edilmektedir. FNK, bir BHF Doktora Öğrenciliği tarafından finanse edilmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kan toplama için
60 ml luer-lok uçlu şırıngaBD309653
19G Surflo Kanatlı İnfüzyon SetiTerumoSV-19BL
50 ml konik santrifüj tüpüStarLabE1450Donör başına 2
Sodyum SitratMartindale İlaç 270541
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Buffy coat izolasyonu için
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (Ca2+ ve Mg2+ olmadan)Sigma-AldrichD8537
Steril sarılı plastik transfer pipetleriAppleton WoodsKC231
Turk' s ÇözeltiMillipore1.093E + 09
< güçlü > İsim< / strong><strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
hücre kültürü, hücreleri geçirmek ve dondurmak için< / güçlü >
Tip 1 Kollajen (sıçan kuyruğundan elde edilir)BD Biosciences35-4236
Dulbecco' s PBS (Ca2+ ve Mg2+ olmadan)Sigma-AldrichD8537
0.02M Asetik Asit Sigma-AldrichA6283reaktif dereceli suda hazırlanır
Endotelyal Büyüme Ortamı-2MV
(Bullet Kit içerir, ancak serum içermez)		LonzaCC-3202Not: < / strong> Besiyerinin heparin içermemesi esastır.  
Kullanmayın EGM-2.
Fetal Sığır Serumu (ABD), TanımlanmışHiklonSH30070
10x Tripsin EDTAGibcoT4174Kullanmadan önce PBS'de 1x'e seyreltin
Isı ile İnaktive Edilmiş FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Bay Buzlu Dondurma KabıSigma-AldrichC1562
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Akış sitometrik karakterizasyonu için
FITC-konjuge fare anti-insan CD14BD Biosciences555397Fare IgG1k, Klon: WM59
Seyreltme: 1:20
FITC konjuge fare anti-insan CD31BD Biosciences555445Fare IgG1k, Klon: WM59
Seyreltme: 1:20
APC konjuge fare anti-insan CD34BD Biosciences555824Fare IgG1k, Klon: 581 / CD34 < br / > Seyreltme: 1:20
FITC konjuge fare anti-insan CD45BD Biosciences560976Fare IgG1k, Klon: HI30
Seyreltme: 1:20
  APC konjuge fare anti-insan VEGFR2R& D SistemleriFAB357AFare IgG1, Klon: 89106
Seyreltme: 1:10
FITC konjuge fare IgG1k izotip kontrolüBD Biosciences555748Klon: MOPC-21
Seyreltme: 1:20
APC konjuge fare IgG1k izotip kontrolüBD Biosciences555751Klon: MOPC-21
Seyreltme: 1:20
APC konjuge fare IgG1k izotip kontrolüR& D SistemleriIC002A
Seyreltme: 1:10		Klon: 11711
EDTA, 0.5M çözümSigma-AldrichE7889
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar
İmmünofloresan mikroskobu için 
Corning Costar 24 oyuklu doku kültürü plakasıSigma-AldrichCLS3527
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
Polisorbat 20Sigma-AldrichP2287
Monoklonal fare anti-insan CD34 antikoruR& D SystemsMAB72271Clone 756510, IgG1, 10 &mu'da kullanın; g/ml
Poliklonal keçi anti-insan VE-cadherin (CD144)R& D SystemsAF938Antijen afinitesi ile saflaştırılmış IgG, 1:300'de kullanım
Monoklonal tavşan anti-insan Von Willebrand Faktörü (vWF)Abcamab154193Klon EPSISR15, 1:250'de kullanın
Eşek anti-fare IgG (H + L) ikincil antikor, Alexa Fluor 488 konjugeYaşam TeknolojileriA-21202Poliklonal, 2 mg / ml, 1:200'de kullanım
Eşek anti-keçi IgG (H + L) ikincil antikoru, Alexa Fluor 488 konjugatıYaşam TeknolojileriA-11055Poliklonal, 2 mg / ml, 1: 200
Eşek anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikoru, Alexa Fluor 568 konjugeYaşam TeknolojileriA-10042Poliklonal,   2 mg / ml, 1:200
DAPI (4 & prime ;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)Sigma-AldrichD95421 & mu'da kullanım; g/ml
,

Kaynaklar

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Periferik Kan İzolasyonuYoğunluk Gradyan SantrifüjüKollajen KaplamaBOEC Üretim BesiyeriHücre Kültürü ProtokolüEndotelyal Hücre MarkerlarıCD144 İmmünofloresansıVon Willebrand Faktör BoyamaKriyoprezervasyon Yöntemi
İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.