Yöntem makalesi

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

DOI:

10.3791/53402

⸱

7 Aralık 2015

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagozomal pH, fagozom olgunlaşmasını, oksidan üretimini, fagozomal öldürmeyi ve antijen sunumunu etkiler. Burada, floresan mikroskobu kullanarak canlı fagositlerdeki bireysel fagozomlardaki zaman-seyri ve son nokta pH değişikliklerini ölçmek için bir oransal yöntemi açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagositoz doğuştan gelen bağışıklık hücreleri öldürmek veya etkisiz yutulur malzeme veya antijen olarak sunmak ve adaptif immün yanıtları başlatmak için bakteri, apoptotik hücreler veya diğer yabancı partikülleri yutmak hangi aracılığıyla temel süreçtir. Fagozomların pH endomembranes ve proteolitik enzimler, fagositik vakuol bir parçalayıcı organele içine olgun izin olaylar aktivasyonu ile fizyon ya da füzyon düzenleyen kritik bir parametredir. Buna ek olarak, H + translokasyon diğer konakçı dokulara etkili bir öldürme için önemli ve sinyal olan reaktif oksijen türlerinin (ROS), yüksek seviyelerinin üretimi için gereklidir. Birçok hücre içi patojenler, phagosomal asitlenmesine sınırlayıcı fagosom biyoloji pH önemini vurgulayarak fagositik öldürmeyi yıkmak. Burada floresein izotiosiyanat (FITC) kullanılarak nötrofillerde phagosomal pH ölçmek için bir yöntem tarif rasyometrik fagositik targ olarak zimosan -etiketliets ve canlı hücre görüntüleme. Deney 490 nm'de uyarıldığında, ancak tek bir boyanın, yerine mutlak floresandan daha, bir pH bağımlı oranının sayılmasına olanak tanıyan, 440 nm'de uyarıldı olmadığında asidik pH ile söndürülür FITC, floresan özelliklerine dayanır. In situ boya kalibrasyonu ve gerçek pH değerlerine oranı dönüştürme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol, aynı zamanda temin edilmektedir. Onlar böyle ağartma olarak tedirginlikler daha az duyarlı olarak tek boya rasyometrik yöntemleri genellikle tek dalga boyu veya çift boya sözde rasyometrik protokollere üstün kabul edilir, ölçülen sinyali tahrif değişiklikleri, lazer varyasyonları ve düzensiz etiketleme, odak. Bu yöntem, kolaylıkla diğer fagositik hücre tiplerinde pH ölçmek için modifiye edilebilir ve zymosan atıl tanelerden canlı mikroorganizmalara, diğer herhangi bir amin içeren bir parçacık ile ikame edilmiş olabilir. Son olarak, bu yöntem, farklı pH aralıklarında ya da diğer phagosom karşı duyarlı olan diğer floresan probları faydalanmak için adapte edilebiliral faaliyetleri, bu fagozomların fonksiyonel görüntüleme için genel bir protokol yaparak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagositoz, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin büyük parçacıkları yuttuğu, tek hücreli organizmaların yeme mekanizmasından evrimleşen ve bir hedefe bağlanmayı, onu bir zarla sarmayı ve sitozol içinde fagozom adı verilen bir vakuol oluşturmak için zarı sıkıştırmayı içeren süreç. Fagozomal zar, plazma zarından türetilirken, aktif protein ve lipit ayırmanın yanı sıra fagozom oluşumu sırasında endomembranlarla füzyon, fagozomu, yutulan materyalin öldürülmesine, nötralizasyonuna ve parçalanmasına izin veren parçalayıcı özelliklere sahip hücre içinde ayrı bir organele dönüştürür1-3. Fagozomal olgunlaşma olarak adlandırılan bu süreç, elektronları güçlü oksidan O2- ve türevi reaktif oksijen türlerini (ROS) üreten fagozomlara aktaran nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz dahil olmak üzere bir dizi proteolitik ve mikrobisidal enzimin verilmesine dayanır 2,4.

Fagozomların lümen pH'ı, fagozom işlevi için gerekli olan çeşitli olaylar üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Birincisi, pH genel olarak endomembran kaçakçılığını etkiler, çünkü transmembran kaçakçılık düzenleyicilerinin pH'a bağlı konformasyonel değişiklikleri, Arfs, Rabs ve veziküler kaplama proteinleri gibi kaçakçılık belirleyicilerinin alımını değiştirir ve bu da hangi veziküllerin fagozomlarla kaynaşabileceğini tanımlar 5-8. İkincisi, fagozomal lümenin iyonik bileşimi de fagozomlar olgunlaştıkça dönüştürülür ve fagositik fonksiyonu destekleyen Na+/H+ değiştirici veya ClC ailesi Cl-/H+ antiporterleri gibi bazı iyon taşıyıcıları H+ translokasyonuna dayanır 9,10. Benzer şekilde, ROS üretimi fagozomal pH ile yakından bağlantılıdır. ROS ve toksik oksidan yan ürünleri, nötrofiller 4,11,12'de fagozomal öldürme için çok önemli olarak kabul edilmiştir ve makrofajlar, dendritik hücreler (DC'ler) ve amip 13-16 dahil olmak üzere diğer fagositlerde kritik roller oynadığı gösterilmiştir. NADPH oksidaz, NADPH tüketilirken sitozolde H+ salgılayan ve aksi takdirde enzim 17-21'in kendi kendini inhibisyonuna yol açacak büyük depolarizasyonu hafifletmek için, taşınan elektronların yanı sıra H+'nın eşlik eden HVCN1 kanallarından fagozomal lümene eşzamanlı transferini gerektiren elektrojenik bir enzimdir. Son olarak, birkaç proteolitik enzim farklı pH'ta optimal aktiviteye sahiptir, bu nedenle zamana bağlı fagozomal pH değişiklikleri hangi enzimlerin ne zaman aktif olduğunu etkileyebilir. Fagozomal pH'ın önemi, fagozomal pH 22-24'ü değiştirerek fagositik öldürmeyi en azından kısmen bozan Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis ve Salmonella typherium gibi organizmalar tarafından vurgulanmaktadır.

Memelilerde ana fagositler nötrofiller, makrofajlar ve dendritik hücrelerdir ve hücre tipine bağlı olarak, zamana bağlı fagozomal pH değişiklikleri büyük ölçüde değişebilir ve farklı roller oynuyor gibi görünebilir. Makrofajlarda, ATP'ye bağımlı proton pompası vakuolar ATPaz'ın (V-ATPaz) aracılık ettiği güçlü ve hızlı bir asitleşme, 25-27'yi öldürmeye aracılık eden anahtar faktörlerden biridir ve fagositozu bir yeme mekanizması olarak kullanan amiplerde bulunan mekanizmalara benzer 28. Bu hücrelerde asidik proteazların aktivasyonunun önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Buna karşılık, nötrofil öldürme, miyeloperoksidaz (MPO)11 tarafından üretilen HOCl'nin yanı sıra ROS'a daha fazla dayanır ve pH, ilk 30 dakika boyunca nötr veya alkali kalır, ancak daha sonra asitleşir 29,30. Nötr pH'ın, bazı katepsinler gibi oksidatif proteazların aktivitesini desteklediği öne sürülmüştür. DC'lerde fagozomal pH tartışmalıdır, bazıları asitlenme bildirirken diğerleri nötr veya alkali pH 31,32'dir, ancak ROS ve pH, bu hücrelerin ana işlevlerinden biri olan T hücrelerine antijen sunma yeteneğini derinden etkileyebilir 33.

Daha da önemlisi, hormonlar, kemokinler ve sitokinler, olgunlaşmayı ve fagosit davranışında değişiklikleri indükleyen ve dolayısıyla fagozomal pH 34,35'i etkileyen sinyal olayları üretebilir. Benzer şekilde, ilaçlar, örneğin anti-kanser tedavileri için de düşünülen antimalaryal klorokin 36, fagozomal pH'ı ve dolayısıyla bağışıklık sonuçlarını etkileyebilir. Bu nedenle, çeşitli hücre biyologları, immünologlar, mikrobiyologlar ve ilaç geliştiricileri, belirli bir genetik bozulmanın, biyoaktif bileşiğin veya mikroorganizmanın doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkileri üzerindeki etkilerinin altında yatan mekanizmaları anlamaya çalışırken fagozomal pH'ın ölçülmesiyle ilgilenebilirler.

Burada, nötrofil fagozomal pH 19'un düzenlenmesinde HVCN1 kanalının önemini göstermemize izin veren nötrofillerde fagozomal pH'ı ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, 535 nm'de floresan emisyonu 490 nm'de uyarıldığında pH'a duyarlı olan ancak 440 nm'de değil olan floresein izotiyosiyanatın (FITC) oransal özelliğine dayanmaktadır 37. Bu boya kimyasal olarak bir hedefe, bu durumda zimozana bağlandığında, hücrelerin fagositoz olurken görüntülendiği ve fagozomal pH değişikliklerinin fagozom olgunlaştıkça gerçek zamanlı olarak ölçüldüğü geniş alanlı floresan mikroskobu kullanılarak takip edilebilir. Gerçek pH daha sonra, fagosite uğramış hücrelerin, fagozomlar içindeki pH'ın harici çözelti ile hızlı bir şekilde dengelenmesine izin veren nigerisin ve monensin iyonoforlarını içeren farklı pH çözeltilerine maruz bırakıldığı bir kalibrasyon deneyi yapılarak toplanır. Oran değerleri daha sonra çözeltilerin bilinen pH değeri ile karşılaştırılır, doğrusal olmayan regresyon ile bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur ve elde edilen denklem oran değerinden pH'ı hesaplamak için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Tüm hayvan manipülasyonları Cenevre Üniversitesi Hayvancılık Araştırma Komitesi kurallarına sıkı göre yapıldı.

Fagositik Hedeflerinin 1. Hazırlık

  1. 10 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) kurutularak zimosan 20 mg ekleyin. 10 dakika boyunca kaynar su banyosuna Vorteks ve ısı. 5 dakika boyunca 2.000 xg'de Serin ve santrifüj.
  2. Bir su banyo sonikatörü içinde 10 dakika için supernatant, 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon ve sonikasyon çıkarın. Iki adet 1,5 ml'lik tüplere 500 ul aktarın. 5 dakika boyunca 11.000 x g'de santrifüjleyin.
  3. 500 ul PBS ile yıkama tekrarlayın. Kaynatıldı zimosan donduruldu ve -20 ° C'de saklanır, bölünmüş olabilir.
  4. Taze CO 3 0,1 M Na-2 hazırlanan 500 ul, pH 9,3, yukarıdaki (aşama 1,2) iki kez zimosan yıkayın.
  5. Son yıkamadan sonra 490 ul süspanse. 10 mg 10 ul ekle / FITC dimetil sulfoxid içinde eritildi mle (DMSO), girdap, folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca çalkalanarak kuluçkalayın.
  6. Önce 0.5 mi DMSO + 300 ul PBS, daha sonra 0.5 ml DMSO + 450 ul PBS, o zaman sadece PBS sonra + 150 ul PBS, 0.5 ml DMSO, yukarıda tanımlandığı gibi (aşama 1,2) yıkama, bağlanmamış boya kaldırın.
  7. Bir hemositometre kullanılarak zymosan güvenin. 500 ul PBS, girdabına zimosan 1 ul ekleyin, o zaman merkezi ızgara üzerine yerleştirilen lamel karşılayan hemositometre odasına kenarına 10 ul ekleyin. 20X amacı ile donatılmış bir aydınlık alan mikroskop hemositometre monte edin.
  8. 16 kareler içeren sol üst köşesindeki odaklanın ve bir el taksitli sayacı kullanarak bu alandaki tüm zimosan parçacıkları saymak. Sağ alt köşede tekrarlayın. = Zymosan konsantrasyon / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml Sayısı: aşağıdaki denklem kullanılarak zymosan konsantrasyonunu hesaplayın. Etiketli zimosan donduruldu ve -20 ° C'de saklanır, bölünmüş olabilir.
  9. Etiketli zymosan wi opsonize100 seyreltme: 1 bir tavşan anti-zimosan antikor th. Vorteks ve 37 ° C su banyosu içinde 1 saat boyunca inkübe edilir. (Adım 1.2) yukarıdaki gibi 500 ul PBS ile yıkayın.
    Not: zymosan sonra analiz daha zorlaştırabilir öbekler şeklinde eğilimi Sonikasyon yüksek, özellikle de opsonızasyonu sonra, tavsiye edilir. % 65 h / h sıçan ya da insan serumu ile Opsonizasyon alternatif olarak kullanılabilir.
  10. Adımda 1,7-1,8 de tarif edildiği gibi, bir hemositometre kullanılarak zimosan Sayısı ve 100 x 10 6 parçacık / mL'ye seyreltilir. Örneğin tamamlayıcı veya opsonızasyonu gibi diğer fagositik uyarıcıları ile Opsonizasyon alternatif gerçekleştirilebilir.

2. Canlı Video Mikroskopi

  1. Başka bir yerde 38 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi primer fare nötrofil izole edin.
    1. Alternatif olarak, herhangi fagositik hücre türünü kullanın. Roswell Park Memorial Institute (RPMI),% 5 fetal dana serumu (hacim / hacim), 200 U penisilin / streptomyci ile desteklenmiş 1640 ortam içinde buz üzerinde tutun nötrofillerin, 10 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda kullanıma hazır olana kadar. Diğer hücre tipleri 1-4 gün önce, tohumlanabilir.
  2. , 35 mm cam alt çanağın merkezine nötrofillerin 2 x 10: 5 (20 ul) ilave edilir ortam 50 ul ekleyerek damla yayılması ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 mi belirli bir MPO inhibitörü 4-aminobenzoik hidrazid (4-ABH, 10 uM) ihtiva eden 37 ° C'ye ısıtıldı ekleyin. Sodyum azit (5 mM) gibi Spesifik olmayan MPO inhibitörleri de kullanılabilir, ancak yakın zamanda, pH 39 ek spesifik olmayan etkiler gösterir uygulamak için önerilmiştir.
  4. Bir 37 ° C ısıtma sistemi ve 40X petrol amacı ile donatılmış bir geniş açılı floresan mikroskop çanak monte edin. Hücreler ve ekipmanlar denge sağlamak için 10 dakika için görüntüleme hücrelere inkübe edin.
  5. Parlak-alan iletim görüntü elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın [phase ya da 440 nm ya da 490 nm eksitasyon ve 535 nm emisyonda, her 30 saniyede eğer varsa diferansiyel girişim kontrast (DIC)].
  6. Çok fazla photobleaching ve fototoksisite ve deneysel sorular bağlı olarak soruluyor önlemek için mikroskop sistemine göre pozlama süresini ve satın alma sıklığını ayarlayın. Görüntü elde etme başlayın.
  7. 2 dakika sonra, 10 x 10 6 (50 ul), FITC-zimosan çanak merkezine opsonize ekleyin. Kullanılan fagosit ve hedefin tipine bağlı olarak hücre oranlarını: Hedef ayarlayın.
  8. 30 dakika boyunca görüntülemeyi devam edin. 30 dakika sonra time-lapse edinimi durdurmak ve bir zamanlayıcı başlar. Sahne taşıyın ve 5 dakika içinde, görüntü diğer fagozomların bakış farklı alanlarda 10 veya daha fazla anlık yakalamak.

3. Kalibrasyon ve Kontrol Deneyleri

  1. Deney günü (tarifleri Tablo 1'de tarif edilmektedir), önceki pH ayarlama solüsyonlarının hazırlanması ve 10 ml'lik miktarlar halinde dondurma.Bir su banyosu içinde 37 ° C 'kalibrasyon çözümleri ve sıcak çözülme. Bir pH ölçer ile pH kontrol ve çözeltiler gerçek pH kaydedilir.
  2. Önceki görüntü alımı için cam alt çanak peristaltik bir pompa monte edin ve (bölüm 2) Yukarıda açıklandığı gibi canlı video mikroskopi gerçekleştirin.
  3. 30 dakika iktisap sürenin sonunda, yemeğin içindeki çözüm kaldırmak için pompa açın ilk kalibrasyon çözeltisinin 1 ml ekleyin ve pompayı durdurun.
  4. Sinyal genellikle 5 dakika stabilize kadar bekleyin. Her kalibrasyon çözeltisi ile tekrarlayın.
    1. Deney, günde en azından bir kalibrasyon gerçekleştirin ve yüksek pH ile başlayan ve en sıralı olarak çalışma, hem de düşük pH başlayarak ve en yüksek doğru ardışık çalışma kalibre edin.
  5. Bir kontrol olarak, cam alt tabak içinde 900 ul HBSS içinde hücreler, HBSS içinde seyreltilmiş 100 uM NADPH oksidaz inhibitörü difenil propionium iyodür 100 ul (DPI) ekleyin ve10 dakika inkübe edilir.
  6. Edinimi başlatın ve (adım 2.7) yukarıdaki gibi zymosan ekleyin. Fagositoz 15 dakika sonra HBSS içinde seyreltilmiş bir (conca) konkanamisin 10 uM V-ATPaz inhibitörü 10 ul ve 15 dakika daha devam görüntüleme.

4. Analiz

  1. Time-lapse film ve fagosom anlık analizi.
    Not: Aşağıdaki talimatlar ImageJ için özeldir. Adım adım talimatlar kullanılan yazılım bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir, ancak bu bölümde anlatılan fonksiyonlar en profesyonel görüntü analiz yazılımı mevcuttur.
    1. Profesyonel görüntü analiz yazılımı ile görüntüleri açın. Hiçbir hücreler vardır bir alanda kare çokgen seçim aracıyla küçük bir kare yatırım getirisi çizim ve ROI Eklentiler> BG Çıkarma tıklayarak 490 kanal arka plan çıkarın. Ardından> tıklayarak Düzen> Seçim 440 kanalda aynı yatırım getirisini yüklemek Seçme ve tekrarı geri yükleyin.
    2. Daha sonra Operasyonu açılır menüden 'Divide' seçerek, ... Süreç> Görüntü Hesaplama tıklayarak Image1 ve image2 açılır menülerden uygun görüntüleri seçerek 440 kanala bölünür 490 kanal 32-bit oranı görüntü olun ve 32-bit (float) sonuç check-kutusunu işaretleyerek.
    3. > Rainbow RGB Görüntü> Arama Tabloları tıklayarak bir oran ile uyumlu renk kodlama renk kodlama look-up tablosu değiştirin. Eşik oranı görüntü> Threshold> Görüntü tıklayarak 0 ve sonsuzluk piksel ortadan Ayarlanır .... NaN onay kutusunu Set arka plan piksel seçili olduğundan emin hale o zymosan kırmızı görünür, böylece kaydırma çubuklarını ayarlayın ve Uygula'yı tıklatın.
    4. Görüntü tıklayarak bir çok kanallı kompozit içine parlak alan kanalı ile bu oran yığını birleştirin> Renk> Kanallar Birleştirme ve gri kanal açılır menüden parlak alan görüntü ve yeşil kanal açılır menüden oran görüntüsünü seçme ve seçmeOnay kutusunu kaynak görüntüleri tutun. Time-lapse film veya fagozomların analiz edilmelidir belirlemek için anlık tarayın. Parlak alan kanal için yararlıdır.
    5. Ekle> fagozomların etrafında oval poligon seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgelerini çiziniz ve Analiz> Araçlar> ROI Yöneticisi tıklayarak ROI yöneticisi ekleyebilirsiniz. Daha fazla> Çok ölçün ve dilim onay kutusunun başına bir satır de-seçilerek tıklayarak kendi zymosan yoğunluk oranını ölçün.
    6. Time-lapse film için, parça her zaman noktasını ölçmek için Ctrl + M yazarak, bir yatırım getirisi çizim ve zamanla yoğunluk değerlerini izlemek için gerektiğinde yatırım getirisi hareket ettirerek bir seferde bir fagozomların. Bir elektronik tablo yazılımı içine Sonuçları penceresinde ölçümleri kopyalayın.
      Not: bağımsız deneyler 15 (deney x 3 başına 5 zamanlı kurslar) Analizi ideal ama daha az ya da gözlenen değişkenlik bağlı gerekebilir olduğunu. İB'leri Tasarruf her zaman tavsiye edilir. Bazı yazılım paketleri izin görüntü regiStration ve İB'nin dinamik güncelleştirme, analiz bu bölümünü kolaylaştırmak.
  2. Floresans pH değerlerine Dönüşüm
    1. Bölüm 4.1'de açıklandığı gibi kalibrasyon time-lapse filmlerde fagozomların için 490/440 oranını ölçün.
    2. Elektronik tabloda zamanla oran değerlerini çizmek ve her pH kalibrasyonu karşılık gelen süre ortasında içinde 5 zaman noktalardan (5-20 arası, genellikle) görüş alanı içindeki tüm fagozomların ortalama oran değerlerini hesaplamak Çözelti. (Ayrıca Şekil 5A kırmızı kutuları bakın.)
    3. Gerçek ölçülen pH karşı bu ortalama 490/440 oranı değerlerini çizilir. Tek bir grafiğe içine en az 3 bağımsız kalibrasyon birleştirin. Genellikle sigmoid denkleme, doğrusal olmayan regresyon (en iyi uyum eğrisi) gerçekleştirmek için bir istatistik veya sayısal bir yazılım paketi kullanın.
      Not: Örneğin, Şekil 5B'de kullanılan denklem Boltzmann sigmoidal oldu [Y = Taban + ((Top-Taban)/ (1 + EXP ((V50-X) / Eğim)) Y değerleri 490/440 oranları], X pH değerleri ve Üst, Alt, V50 ve eğim parametreleri yazılım tarafından hesaplanır vardır.
    4. PH oranı değerleri dönüştürmek için elde edilen denklemi kullanın.
      Not: Örneğin, Şekil 5B'de, sodyum azid mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisi için elde edilen denklem şöyledir 490/440 oranı = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . pH Çözme aşağıdaki denklemi sağlar: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1,178 / (Oran-1,103)) - 1))].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda bir deney için temsili sonuçlar olduğu takdirde burada yabani tip ya da kemik-iliğinden izole edilmiş primer fare nötrofil phagosomal pH Hvcn1 - / - farenin karşılaştırıldı. Başarılı bir deneme için, daha sonra görüntü analizi sırasında segmente daha zor olacaktır çok fagozomların, kaçınarak, time-lapse film tüm süresince görüş alanı içinde yeterli fagozomların elde etmek önemlidir. Şekil 1'de görüldüğü gibi İyi ve kötü confluencies örnekleri. Zamana bağlı ve anlık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha fazla zaman hedefleri bağlanmış bir pH duyarlı boya kullanılarak benzer bir strateji geliştirerek, ancak fagozomların bir popülasyonunun ortalama pH ölçer gibi spektroskopi ve FACS gibi alternatif yöntemler, daha zaman alıcı olmakla birlikte, mikroskopi çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, iç ve dış içsel bağlı değil, diğer bir deyişle, partiküllerin kolayca sırasıyla gidermek ya da dış parçacıklar etiket, örneğin tripan mavisi ya da antikorlar gibi diğer kimyasallar eklemeye gerek kalmadan bir şekilde ayırt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından 31003A-149566 (N.D.'ye) ve The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust tarafından Genç Araştırmacı Sübvansiyonu (P.N.'ye) aracılığıyla mali olarak desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Zymosan A tozuSigma-AldrichZ4250Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Floresein izotiyosiyanatSigma-AldrichF7250Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Anti-zimosan antikoru (Zymosan A Bioparticles opsonizing reaktifi)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 eşdeğer bir üründür. Alternatif olarak,% 25 serum opsonize edici bir reaktif olarak kullanılabilir.
4-Aminobenzoik hidrazid (4-ABH)Santa Cruzsc-204107Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Difenileniodonyum klorür (DPI)Sigma-AldrichD2926Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Concanamicin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var
NijeryaSigma-AldrichN7143Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var
MonensinEnzo ALX-380-026-G001Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var
Fosfat tamponlu salin (PBS)Life Technologies14200-075Toksik, eldiven kullanın, çeşitli sağlayıcılar var
Hank'in denge tuzu çözeltisiYaşam Teknolojileri14025092Ringer'ın dengeli tuz çözeltisi veya diğer berrak fizyolojik tamponlar olabilir ikame edilebilir.
Sodyum karbonat (Na2< / sub>CO3< / sub>)Sigma-AldrichS7795Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES)Sigma-AldrichM3671 ve nbsp;Çeşitli sağlayıcılar var
4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES)Sigma-AldrichH3375Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
N-Metil-D-glukamin (NMDG)Sigma-AldrichM2004 & nbsp;Çeşitli sağlayıcılar var
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime; -tetraasetik asit (EGTA)Sigma-Aldrich3777Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris)Sigma-AldrichT1503 & nbsp;Çeşitli sağlayıcılar var
Potasyum klorür (KCl)Sigma-AldrichP9333Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-AldrichS7653Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Magnezyum klorür (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Mutlak Etanol (EtOH)Sigma-Aldrich2860Çeşitli sağlayıcılar mevcuttur
Cam tabanlı 35 mm petri kapları (Florodish)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi ve mikro;-şeffaf tabaklar veya uygun görüntüleme odalarına sahip lameller desteklenebilir
Sonicating su banyosuO. Kleiner AGBunun yerine bir sonikatör kullanılabilir, çeşitli alet sağlayıcıları mevcuttur
HeamocytometerMarienfeld GmbHÇeşitli alet sağlayıcıları mevcuttur
Geniş alan canlı görüntüleme mikroskobuCarl Zeiss AGÇeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur, ancak mikroskop 440/535 ve 490/535 uyarma/emisyona duyarlı görüntüleme yapabilmelidir. Parlak alan özelliklerine sahip dönen disk konfokal kurulumları ikame edilebilir, ancak zymosan daha sık odak dışına çıkma eğilimindedir.  
Peristaltik pompa (Dynamax RP-1)RaininÇeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur
pH metreSchott Gerate GmbHÇeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur
ManuelSayaç Milian SAÇeşitli cihaz sağlayıcıları mevcuttur

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670(2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FITC i aretli ZymosanN trofil FagositozuCanl H cre G r nt lemepH KalibrasyonuOranl G r nt lemeFagozomal Olgunla maReaktif Oksijen T rleri

İlgili makaleler