RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

Giovanni Lugli; Yachana Kataria; Zachary Richards; Peter Gann; Xiaofeng Zhou; Larisa Nonn

doi:10.3791/53405

Method Article

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

DOI:

10.3791/53405

⸱

November 26th, 2015

Giovanni Lugli¹ , Yachana Kataria¹ , Zachary Richards¹ , Peter Gann¹ , Xiaofeng Zhou² , Larisa Nonn¹

¹Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, ²Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, aşağı akış RNA analizi için heterojen prostat dokularından saf hücre tipi popülasyonlarını izole etmek için etkili bir yöntem olarak lazer yakalama mikro-diseksiyonunu kullanmaktır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prostat bezi, stromal, epitelyal, nöroendokrin ve immün hücre tiplerinden oluşan heterojen bir ortam içerir. Sağlıklı prostat, ayrık epitelyal astarlı sekretuar lümenleri çevreleyen fibromüsküler stroma ve çok küçük bir immün ve nöroendokrin hücre popülasyonundan oluşur. Buna karşılık, prostat kanseri bölgeleri, stromal popülasyonu büyük ölçüde azalmış veya hiç olmayan displastik luminal epitel ile artmıştır. Stromal ve epitelyal hücre tipleri arasındaki derin fark göz önüne alındığında, herhangi bir aşağı akış moleküler analizi için hücre tiplerini ayırmak zorunludur. Bu bilgiye rağmen, gen ekspresyonu çalışmalarının büyük bir kısmı iyi huylu prostatı mikro diseksiyon olmadan kanserle karşılaştırır ve bu da iyi huylu örneklerde stromal yanlılığa yol açar. Lazer yakalamalı mikro diseksiyon (LCM), farklı hücre tiplerini bir numune bölümünden fiziksel olarak ayırmak için etkili bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, RNA'nın LCM tarafından toplanan insan prostat epitelinden başarılı bir şekilde izole edilebileceğini ve RT-qPCR ve RNAseq gibi aşağı akış gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabileceğini göstermektir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prostat bezi, öncelikle düz kas ¹ oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre ^2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) 'de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde ³ arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi.

1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine

Bir gün önce veya bir kaç saat numune kesit önce, temiz araçlar (yani, fırça, forseps, coplins, bıçaklar, PEN-çerçeveli slaytlar (değilse zaten RNaz ücretsiz), bir ETOH güvenli işaretleyici ve bir kalem) ve iç Bir sprey şişesi ve laboratuar mendil kullanarak çözüm-dekontaminasyon RNaz RT Kriyostat.
1. RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir önceki çalışmada aynı hastadan ⁴ dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontrolleri incelemek için tavsiye edilir. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku işleme kıyasla, LCM huylu doku.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yıllar boyunca bu metodolojiyi optimize etmedeki yardımları için Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco ve Avani Vaishnav'a ve RNA sıralama analizi için Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi'nden Yang Zhang ve Dr. Jian Ma'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH / NCI R01 CA166588-01 (Nonn), Amerikan Kanser Derneği Araştırma Görevlisi 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH / NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Sağlık Eşitsizlikleri Fikir Ödülü PC121923 (Nonn) ve Kanseri Önleme Vakfı hibesi (Zhou) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-UZAKTA	MBP	7005-11
KALEM membran 4.0 mm slaytlar	Leica	11600289
Cam slaytlar, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Etanol 200 geçirmez	Decon laboratuvarları.	2701
DEPC (dietil pirokarbonat)	Sigma	D-5758
Kriyostat	Leica	CM3050
Coplins (Boyama kavanozu)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Boyama rafı)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope Aperio (	Leica)	ScanScope®
Toluidin Mavi	Fluka	89640-5G
Lazer Mikrodiseksiyon Sistemi	Leica	LMD7000
Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA İzolasyon Kiti	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Marka
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Florometre	Yaşam Teknolojileri	Q32866	Thermo Fisher Scientific Marka
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti	Thermo Fisher Scientific Marka	4368814	Uygulamalı Biyosistemler
Evrensel cDNA Sentez Kiti II, 8-64 rxns	Exiqon 203301
TaqMan microRNA RT kiti	Uygulamalı Biyosistemler	4366597	Thermo Fisher Scientific Marka
Hematoksilen boyası	Ricca Kimya Şirketi	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Bilimsel	7111

CSLCM için 0.5 ml İnce Cidarlı Tüpler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles