Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir. Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür. Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için
Bu makalede
Özet
Özet
Kanser hücre hatlarının istilacı doğasının metastatik potansiyelleri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, çoğu geleneksel tahlil, bu istilacı özellikleri üç boyutlu bir ortamda incelemez ve elde edilen veriler, biyolojik uygulanabilirliğin azalmasından muzdariptir. Burada, hücre hatlarının istilacı yeteneğini fizyolojik olarak ilgili bir ortamda görselleştirmek için bir yaklaşım sunulmaktadır. Kanser hücresi sferoid istila testi, ilk olarak bir hücre kültürü kabının kapağından sarkan ortam damlaları içinde sferoidler oluşturmak için yerçekimini kullanır. Daha sonra, bu sferoidler, bazal membran malzemeleri ve tip I kollajen karışımından oluşan bir 3D matrise gömülür. Kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki matrise çıkışı daha sonra zaman içinde izlenir. Burada açıklanan yöntem, farklı hücre tiplerinin kokültüründen sonra invazyonu, ilaçların/inhibitörlerin dahil edilmesini veya hücre dışı matris (ECM) bileşenlerindeki değişiklikleri incelemek için değiştirilebilir.
Giriş
Kanser hücre hareketi gibi davranışlar dolaşım sistemi 1 içine bazal membran ve giriş yoluyla işgali kolaylaştırır göz önüne alındığında, metastatik potansiyelin belirleyici olduğu bilinmektedir. Motilite üzerinde en çok araştırma yaygın bir üç boyutlu (3D) matris içinde hücrelerin hareketi olacak aslında nasıl bu aynı hücrelerin daha fazla temsilcisi olduğunu olma yolunda hızla ilerliyor olsa hücreler, iki boyutlu (2D) ayarında nasıl davrandığını odaklanmıştır vivo 2 davranır. 3D kültür sistemleri giderek büyüme kinetikleri ve ilaç duyarlılık 3, hücre morfolojisi değişir hücresel davranışları incelemek için kullanılır. 3D ortamın kapsamında kanser hücre işgali izlemek için arzu 3D hücre dışı içine bu parçacıklarının gömerek ardından asılı damla kültür yöntemiyle 4 aracılığıyla 3D hücre agrega (sferoidler) üretimini kapsayan daha önce kurulmuş tekniklerin sentezine yol açmıştır Matris (ECM) kolajen ve bazal membran malzemelerinin 5 oluşur. Bu yöntem, kolaylıkla deneysel koşullar altında çeşitli işgali karşılaştırma için kullanılabilir akıcı bir yaklaşım sağlayarak bu, daha önce bilinen teknikler geliştirmek için çalışmaktadır.
In vitro hücre motilitesini değerlendirmek için daha geleneksel yolları çizilmeye yara tahlil ve transwell tahlil 6 bulunmaktadır. Eski deney 2B ortamda hücre motilitesini tasvir ve in vivo işgali için kritik çeşitli özellikler, örneğin, bir proteaz aktivitesi 7 bağımsızdır. Transwell tahlil de ekler ters membran yüzeyinde hücre görünümü, yani ECM yüzeylerde ancak, yalnızca tek bir parametre ile daha iyi bir model hücre işgali kaplanır zaman ölçülen ve hücre işgali birçok nüanslar böylece kolaylıkla gözlemlenebilir değildirler. Bu teknikler, kanser hücresi sferoid yayılması deneyinin (Şekil 1 / strong>) Sadece fizyolojik ilgili olmayan bir ortamda hücre işgali gerçek zamanlı izleme sağlar, fakat aynı zamanda kolektif vs bireysel hücre göçü 8 olarak görüntülenebilir önemli hücre çizgisi özgü özellikleri, izin verir. Bu yöntem aynı zamanda, standart 3D kültürü büyüme tahlilleri fazla avantaj elde edilir. Hücreler bu kısıtlama kaldırdı sonra işgal etmeye teşvik edilecektir böylece asılı damla yöntemi ile hücresel agrega üretimi başlangıçta hücre hareketi kısıtlar. Bu kısıtlama kaldırdı kez Dahası, hücre çıkış sonra uygun quantitated edilebilir bir üniforma yönde devam edecektir.
Kanser hücresi sferoidler deneyleri için kullanılan en popüler ECM malzeme Matrigel ve bu bileşenlerin her biri metastatik davranışını etkileyen önemli ve farklı rolleri vardır burada tip I, hücre oranında yerleştirilmiştir. Matrigel Engelbreth-Holm Swarm fare sarkoma hücreleri tarafından üretilen proteinlerin salgılanan karışımıdır ve baseme içinde zenginleştirilmiş olanBöyle laminin, Entactin ve tip IV kollajen 9 olarak nt zar proteinleri. Bu nedenle, Matrigel bundan böyle adlandırılır "bazal membran malzemeler". Bu bazal zar malzemeleri hücre davranışı 11 üzerindeki etkileri bir dizi gösterirler sayıdaki başka protein ek olarak, kanser hücresi yayılımını tamamen 10 boyunca yapışma integrin için gerekli temel ligandı sunar. Buna karşılık, genellikle tendon ve diğer yoğun kollajen yapılar 12 asit sindirimleri hazırlanabilir I kolajen türü, vücut bağ dokusu ve stromanın destekleyici dokuların ve organların büyük bir yapısal elemanı olarak hizmet eden daha basit bir dolgu maddesi. Bu kollajen fiziksel özellikleri, hücre motilitesinin bir dizi özellik düzenleyen ortaya konmuştur; örneğin tümör-stroma arayüzünde kolajen fibrilleri hizalama stroma 13 içine işgalci, sonradan bu fibriller boyunca geçirmek için kanser hücrelerinin izin verir. Burada yer alan deneyinde, hem tip I kolajen ve bazal zar malzemeleri 3D kanser hücresi-stroma etkileşimleri incelemek için bir araç olarak kullanılır.
Hücreler 3 boyutlu bir matris içine gömülü edildikten sonra işgal izlenebilir kontrol yollarının engellenmesi veya stimülasyon etkisi. Hücreler, asılı damla ya da uzun bir işleme işgali modüle etmek için gerekli olacaktır bağlı olarak 3D kültür, transfer üzerine büyüme sırasında ön muameleye tabi tutulabilir. Kısa tedaviler için, ilacın alımından sonra küremsi süspansiyon, hem de hücrelere yeterli ilaç maruziyeti kolaylaştırmak için, 3D kültürleri saracak ortamı ile karıştırılabilir önerilir. Daha sonra, normal veya tümör bağlantılı stromal hücreleri, tümör hücresi istilasını modüle edilmesinde rolünü değerlendirmek için, ya da ne kadar parakrin ve otokrin sinyal etkiler, hücre davranışını tespit etmek matris malzemesi ile karıştırılabilmektedir. Bu fikir bir çalışmada gösterilmiştir nerede col Coculturekanser ve asılı damla endotelyal hücreler üzerinde sferoidler 14 içinde damar ağı yol açtı. Kanser hücre istilası farklı alt-tabaka 15 tarafından temas edilmesinin Son olarak, ECM bileşenleri, aynı zamanda, değiştirilebilir. Aşağıda sunulan durumda, yöntem, çeşitli koşullar altında kanser hücresi invazyonunu değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar. Genel olarak, tüm hücre kuşakları asılı damla parçacıklarının yaratacak ve epitel dönük hücre hatları genellikle, normal küre formunda olduğu belirlendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Sferoidlerin 1. Üretim
- Bir PBS kullanarak 70% konfluansa ~ adherent kanseri hücre kültürleri ayırarak damla kültürleri asılı tek hücre süspansiyonu hazırlamak% 0.05 tripsin-EDTA solüsyonuna maruz bırakılarak, ardından yıkama.
- Hücre kültür ortamı ile tripsin solüsyonu nötralize ve hücre süspansiyonu, bir kısım kullanarak hücreleri sayın. Not: Hücre hattı bağlıdır belirli bir hücre kültür ortamı, test edilen. Hücre kültür ortamı genellikle DMEM +% 10 FBS olduğu, ATCC medya önerileri uygulayın. Daha fazla bilgi Malzemeleri Tablo bulunabilir.
- Hücre kültür ortamı 20 ul damla başına 500-1000 hücre ekimi için izin vermek için bir seyreltme gerçekleştirin.
- 10 cm çanak Edinme ve alt steril PBS 5 ml ekleyin. Not: Bu adım asılı buharlaşma damla korur. Düşük maliyetli "bakteriyolojik notu" yemekleri, hücre kültürü sınıf yemekleri yerine kullanılabilecek kadar hücreler devamı olmazKültür yüzey hareket ederler.
- Kapağın iç yüzeyine seyreltilmiş hücre süspansiyonu, 20 ul damlalar aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
- Pipet 40 10 cm çanak kapağı üzerine (8 damla 5 satır) düşer.
- Kültür çanak üzerinde kapağı ve yer ters çevirin. Sferoidler oluşturmak için 72 saat boyunca 37 ° C 'de asılı damla kültürleri inkübe edin.
- Kendine güvenen, henüz kontrollü bir şekilde kapağı çevirin. Not: Çok hızlı veya çok yavaş kapağı Inverting damlacıklar kaydırmaya neden olabilir. Diğerleri, kompakt agrega üretilmesi için fazla 72 saat gerekebilir Bazı hücre hatları, 48 saat ya da daha az parçacıklarının oluşturabilir.
3D Matrix içine sferoitlerin 2. gömülmesi
- Gece boyunca sferoidler, gömme işlemi öncesinde 4 ° C'de büyüme faktörü azaltılmış bazal membran malzeme bir kısım çözülme.
- İsteğe bağlı: Önceden ECM ile Katman kuyu doku kültürlerdeki potansiyel sfero etkileşimi önlemek içinyüzeye yeniden.
- 24 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına ECM'nin pipetleyin 200 ul.
- ECM tüm kuyu yüzeyini kaplayan emin olmak için plakayı eğin.
- Dikkatle bir pipet ile aşırı ECM çıkarın.
- 3 saat oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de: kuyu kuruyana kadar plaka inkübe edin.
- İsteğe bağlı: Önceden ECM ile Katman kuyu doku kültürlerdeki potansiyel sfero etkileşimi önlemek içinyüzeye yeniden.
- Doku kültürü çanak kapağı devirme ve medyayı bir araya getirerek parçacıklarının toplayın. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine sferoidlerle medya aktarın.
- Sferoidler mikrosantrifüj tüp dibinde yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Sferoidler gözle görünür olmalıdır.
- . Soğuk (4 ° C) 100 ul bir ayrı ön-soğutulmuş bir tüp içinde kollajen tip ile bazal membran malzeme 100 ul karıştırın erken katılaşmasını önlemek için ya da bir jel, 4 ° C 'de karışımı tutun.
- Küçük hacimli transfer eğer önceden soğutulmuş pipet ipuçlarını kullanın.
- Dikkatli verBen hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bazal membran malzeme ve kollajen tip karıştırma. Not: jel gömülü hale eğer Hava kabarcıkları protokolde daha sonra görüntüleme engelleyebilir.
- Mikrosantrifüj tüp 40 ul alt kısmından parçacıklarının aspire ve ben karışımı kollajen bazal membran malzemeleri / tip ile birleştirir. Karıştırma sırasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatli olun. Not: Çözelti 100 ul kollajen tip I ve sferoitlerin 40 ul 4 bağımsız 3D kültürler için yeterli malzeme yaratacak, 100 ul bazal membran malzemelerinin içeren. Bu büyütülüyor veya aşağı olabilir.
- Pipet, 24 oyuklu bir plaka üzerinde kuyuların merkezlerine viskoz karışımın 40 ul düşer. Kuyunun tarafına çalışmasını karışımı önlemek için plaka düz tutun. Not: 24 oyuklu bir plaka üzerinde bir tek sütun - 4 kuyu - Her bir durumda test edilecek için tavsiye edilir.
- Plaka int yerleştirinoa 37 ° C inkübatör ve 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. 3D kültür bu dönemde polimerize olur.
- Yavaş yavaş hücre kültür ortamının 1 ml 3D kültürleri daldırın.
- Ayrıca jel polimerizasyonu teşvik etmek kuyular içine eklerken medya sıcak olduğundan emin olun.
- KRİTİK ADIM: yavaşça 3D kültürlere medya ekleyebilirsiniz. Kuyulara çok hızlı bir şekilde ortam Pipetleme doku kültürü yüzeyinden 3D kültürlerin ayrılması yol açabilir.
3. İzleme ve Sfero Invasion Analizi
- Araştırmacı tarafından karar zaman noktalarında çevredeki 3D matris içine sferoitlerin Image işgali. 20x objektif lens bir ters mikroskop kullanılarak fotoğraf elde edin. Not: İdeal zaman noktaları test edilen hücre hattı bağlı olarak farklılık gösterecektir. Daha invaziv hücre hatları kısa bir süre sonra kaplama sferoidler kendi dışarı çıkmasını başlar ve bu nedenle, ilk fotoğrafı alacakkaplama sonrası birkaç saat içinde s. Genel olarak, fotoğraf (kaplama) sonra 0 saat, 24 saat ve 48 saat sonra alınmıştır. Invasion genellikle kaplama sonrası 24 saat 48 varmıştır.
- Görüntü J. gibi görüntü analiz yazılımı kullanarak invaziv yeteneklerini ölçmek
- Sfero kenarından hücre mesafe olarak işgali analiz edin.
- Yarıçapı ve / veya maksimal invaziv mesafeyi işaretlemek için Düz Beraberlik Aracı'nı kullanın.
- Uzunluk ölçümünü görüntülemek için "Tedbir" üst menüde "Analiz", ve sonra tıklatın.
- Sfero dışında toplam invaziv alanı olarak işgal edilmesi.
- Sfero ve / veya toplam invaziv alanın sınırını izlemek için Freehand Beraberlik Aracı'nı kullanın.
- Alan ölçümünü görüntülemek için "Tedbir" üst menüde "Analiz", ve sonra tıklatın.
- Görüntülerin bir yığın için ölçümler oluşturmak için ROI Yöneticisi Araçları gibi bir eklenti kullanın.
- Sfero kenarından hücre mesafe olarak işgali analiz edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sferoid invazyon testi kullanılarak (Şekil 1), kanser hücre soylarının bir paneli, hem de bazal membran malzemeleri ve tip I kolajen oluşan 3 boyutlu bir matris içinde implantasyon sonrası sergilenen hücre egress miktarı için küreler oluşturma kabiliyetleri için test edildi (Tablo 1). Bu sonuçlar, her kanser hücre çizgisi, in vitro olarak bir epitel morfolojisi sahip hücre çizgileri düzenli ve düzgün agrega üretme eğilimindeydi iyi biçimli sferoidler, yaratacaktır göstermektedi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, bir küremsi yayılması deneyinin (Tablo 1) kanser hücre soylarının bir paneli performansını değerlendirildi. Genel olarak, sferoid oluşumu hücre-hücre birleşme varlığı küremsi benzeri mimari oluşumunu teşvik fazla epitelyal dönük hücre hatları, gelişmiş olduğunu fark. MDA-MB-231 hücreleri gibi, bir epitelyal mezenkimal geçiş geçirmiş bilinen hücre hatları, dolayı azaltılmış E-, N- ve P-kadherin ifadesi 16 büyük olasılıkla Asılı damla kültüründe parçacıklarının oluşturmazlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
NIH hibe P30 CA051008 ve T32 CA009686 (ATR) tarafından desteklenir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış | Corning | CB-40234 | |
| Kollajen Tip I, Sıçan Kuyruğu, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Yaşam Teknolojileri | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Orta | Yaşam Teknolojileri | 11875-093 | |
| PBS | Yaşam Teknolojileri | 10010-023 | |
| 0.05% Tripsin-EDTA | Yaşam Teknolojileri | 25300-054 | |
| Fetal Sığır Serumu, Isı ile İnaktive Edilmiş | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC ile Muamele Edilmiş Yemekler | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24 kuyulu TC ile muamele edilmiş Plakalar | NEST Biyoteknoloji | 702001 | |
| Olympus IX-71 Ters Mikroskop | |||
| Hücre hatları, RPMI + %10 FBS'de tutulan BT-474 ve LNCaP hücrelerinin beklentisi ile DMEM + %10 FBS'de tutuldu. |
Kaynaklar
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
