Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi

20.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53422

⸱

14 Ocak 2016

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

Bu makalede

Özet

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Özet

Karmaşık gen düzenleyici ağlar, bitkilerdeki biyolojik süreçleri ve gelişimsel geçişleri düzenler. Genlerin seçici transkripsiyonel aktivasyonu ve susturulması, bitkilerin çevresel sinyallere ve gelişimsel ipuçlarına tepkisine aracılık eder. Bu nedenle, bitkilerde biyolojik süreçlerin nasıl düzenlendiğine dair derin bir anlayış kazanmak için bitki gen ekspresyonunu kontrol eden mekanizmalara ilişkin içgörüler çok önemlidir. Burada tarif edilen kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tekniği, Arabidopsis thaliana model türünün genlerindeki veya genomik bölgelerindeki proteinlerin DNA bağlanma bölgelerini tanımlamak için bir prosedürdür. Transkripsiyon faktörleri, kromatin proteinleri veya histonların translasyon sonrası modifiye edilmiş versiyonları gibi ilgilenilen proteinlerin DNA'sı ile etkileşimleri, ChIP protokolü ile verimli bir şekilde analiz edilebilir. Bu yöntem, protein-DNA etkileşimlerinin in vivo olarak fiksasyonuna, kromatinin rastgele parçalanmasına, protein-DNA komplekslerinin spesifik antikorlarla immünopresipitasyonuna ve ilgilenilen protein ile ilişkili DNA'nın PCR teknikleri ile miktar tayinine dayanmaktadır. Bu metodolojinin Arabidopsis'te kullanılması, çeşitli bitki biyolojik süreçlerini kontrol eden transkripsiyonel düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu yaklaşım, Arabidopsis kromatin proteini EBS'nin bağlanma bölgelerinin, çiçeklenme FT'nin ana geninin düzenleyici bölgelerine tanımlanmasına izin verdi. Bu proteinin FT'nin genomik bölgesinde belirli histon işaretlerinin birikimindeki etkisi de ChIP analizi ile ortaya çıkarıldı.

Giriş

Son yıllarda, moleküler genetik ve genomik geniş bir araç, model türleri, Arabidopsis thaliana geliştirilmiştir. Bu teknoloji bitki gelişim nasıl düzenlendiğinin anlaşılması muazzam ilerleme kolaylaştırmıştır. Bir model olarak Arabidopsis kullanılarak incelenmiştir gelişim süreçleri arasında, çiçeklenme zamanında genetik kontrolü yaygın analiz edilmiştir. Bu çalışmalar, bitkiler gibi hormonlar ve bitki yaşı gibi endojen uyaranlara yanıt olarak çiçeklenme çok hassas zaman modüle olduğunu göstermiştir ve ayrıca mevsim 1 doğal döngüsü ile vakit çiçekli senkronize gibi fotoperiyot ve sıcaklık gibi çevresel sinyallere, 2. Çiçeklenme zamanında değişiklikler ile Arabidopsis mutantlar ün izolasyonu ve tanımlanması, endojen ve çevresel faktörlere yanıt olarak çiçeklenme süresini düzenleyen genlerin karmaşık bir ağ meydana çıkararak belirleyici olmuştur. Bu genetik devrelerdirÇiçeklenme anahtarları olarak hareket birkaç usta genlerin seviyesinde entegre ve çiçek inisiyasyon tam zamanlama çiçekli teşvik ve çiçek entegratör genlerinin 1,3 yukarısında işe faaliyetlerini bastırmak dengesine bağlıdır.

Genomik yaklaşımların son kullanımı ile destekli çiçekli başlama kontrolünde rolü için belirlenen genlerin fonksiyonel karakterizasyonu, çiçeklenme zamanında modülasyonu transkripsiyonel regülasyon merkezi rolünü ortaya koymuştur. Aslında, çiçekli kodlamak transkripsiyon usta genlerin çoğu 4 faktörleri. Buna ek olarak, kromatin remodeling protein komplekslerinin bir dizi çiçeklenme ana genlerin ekspresyonunu etkilemektedir. Gözlemlenmesi, değişen çiçeklenme defa izole Arabidopsis Bir dizi mutantlar kromatin değiştirici çeşitli kodlayan genlerinde mutasyon taşıyan ortaya çıktı. Histon olarak posttranslasyonel modifikasyonlar farklı kromatin remodelerse kuyrukları, DNA'ya göre nükleozom konumlandırmak ya da Arabidopsis'te 5,6 çiçeklenme uygun düzenlenmesi için histon varyantları gerekli kanonik histonları vardır alışverişi. Bu kromatin remodeling aktiviteleri arasında birikmesini veya örneğin belirli histon kalıntılarda asetilasyon veya metilasyon gibi kovalent modifikasyon çıkarılmasını katalizler. Bu histon işaretleri özellikle çiçekli genlerin transkripsiyonel aktivitesini düzenleyen diğer kromatin remodeling kompleksleri, transkripsiyon faktörlerini veya transkripsiyonel makine bileşenleri işe özel etkileyiciler tarafından tanınır.

Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) in vivo DNA-bağlanma ilgi duyulan proteinler için (Şekil 1) belirlenmesini sağlar. Bu prosedür, DNA çapraz bağlantı belirli kimyasalların yeteneği proteinleri yararlanır. Elde edilen DNA-protein kompleksleri daha sonra özel antikor aga kullanılarak immunopresipite edilebilirinst, transkripsiyon faktörleri, kromatin bağlayıcı proteinler ya da özel bir değişiklik ve heterolog epitopları tercih proteine ​​bağlanmış (genel olarak "etiketi" olarak adlandırılır). Bu İmmüno-saflaştırılmış DNA, ilgi konusu özel dizilerin zenginleşmesine değerlendirmek için kantitatif PCR (qPCR) reaksiyonlarında şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgeleri ya da belirli genlerdeki histon işaretleri dağılımı 7,8 kurulabilir. Buna ek olarak, masif paralel sıralama sağlayan Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile birlikte, ChIP teknoloji transkripsiyon faktörlerinin bağlanma siteleri yanı sıra histon modifikasyonları meydana çıkarıyor Epigenomik manzara genom kimlik mümkün kıldı. Ayrıca, gen ekspresyonunun eşzamanlı analiz transkripsiyonel düzenleyici bağlanması ya da belirli histon bakışı depozisyon transkripsiyonel Activi orantılı olduğunu izlenmesine olanak verirgenlerin 9 ty.

Arabidopsiste ChIP protokollerin kullanılması transkripsiyonel düzenleyiciler çeşitli kromatin çiçeklenme usta genlerinin organizasyonu ve nasıl bu yapısal değişiklikler gen ifadesini etkileyen 5,6 üzerindeki etkisini değerlendirmek izin verdi. Önceki sonuçlar KISA GÜN İÇİNDE Arabidopsis odağı ERKEN cIVATALAMA (EBS) bu gen gösterisinde çiçeklenme ve çiçeklenme FT ana geninin upregülasyonu bir ivme çiçeklenme ve mutantlar bir bastıncısı gibi hareket ettiğini gösterdi. Buna ek olarak, FT-kaybı fonksiyonu mutasyonları tamamen FT ebs mutantlar erken çiçeklenme ve EBS 10 çiçeklenme bu ana geninin bastırılması için gerekli olduğu gerekli olduğunu belirten ebs mutant bitkilerin erken çiçek açan fenotip bastırmak 11. EBS özellikle histon H3 di- bağlamak ve inci de trimethylated bir PHD içeren proteinini kodlayanFT 12 kromatin aracılı bastırılması olarak EBS için bir rolü olduğunu düşündürmektedir e lizin 4 Kalıntı (/ 3 H3K4me2). ChIP yaklaşımının kullanılması Arabidopsis PHD içeren protein EBS 10,11 ifadesini 12 bastırmak için çiçek entegratör gen FT düzenleyici bölgeleri bağlar olduğunu göstermiştir. ChIP teknolojisi kullanımı yoluyla elde edilen ek veriler bu proteinin Arabidopsis gelişmenin ilk aşamalarında çiçeklenme bu ana geninin kromatin histon asetilasyon, aktif transkripsiyon bir damgasını düşük seviyelerde, korumak için gerekli olduğunu göstermiştir. Birlikte genetik ve gen ifadesi verileri Bu gözlemler, bu Arabidopsis PHD içeren protein çiçek entegratör geninin FT 12 ifadesini modüle etmek suretiyle çiçeklenme zamanı ince ayar merkezi bir role sahip olduğunu göstermektedir. Burada sunulan çalışma histonlarının analizi için değil, aynı zamanda diğer için değil, sadece yararlı optimize edilmiş bir yöntem sağlarkromatin proteinleri ilişkili ve artan verimlilik ve deneysel süreyi azalttı. Ayrıca, bu rapor ChIP protokollerin kullanımı Arabidopsis çiçeklenme başlangıcı ile ilgili gen ifadesinin kontrolü etkisi bu kromatin aracılı mekanizmalar kromatin modifikasyonları değişiklikler ve bitki genlerinin transkripsiyonel devletler arasındaki ilişkiye yeni anlayışlar sağladı ve nasıl nasıl gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bitki Materyali 1. Çapraz (1 saat)

  1. Arabidopsis deneyi kullanılan satırları büyütün (- WT - yabani tip mutantlar karşı, ve / veya etiket ifade çizgilerin karşı ilgi protein etiketli sürümünü ifade çizgileri herhangi proteine ​​erimiş değil) büyük Petri kapları üzerinde 12-18 gün (150 mm), MS-agar ortamı (1 L: 1x Murashige & Skoog tuzlan, 10 g sakroz, 0.5 g MES, pH 5.7 (KOH),% 1 agar) ile. Toprak ve vermikülit 1 karışımı: Alternatif olarak, 3 içeren tencere üzerinde bitkiler büyümek.
    DİKKAT! Formaldehit, cilt ile temasında ve yutulduğunda, inhalasyon yoluyla toksik ve uygun kişisel koruyucu donanımları giyen bir kimyasal kaputu ele alınmalıdır. 1.2 Adımları - 1.6 davlumbaz altında yapılmalıdır.
  2. Bir laboratuvar brülör ısıtmalı iğne ile 50 ml tüpler kapağındaki küçük delikler yapın. % 1 bir son konsantrasyona 1x PBS 40 mi tampon ekleme ve formaldehitin 1,08 mi (stok 37% szüm). Bu 50 ml tüpler içinde bitki maddesinin 1.5 g toplayın. Çapraz bağlama sırasında buz üzerinde tüpler tutun.
  3. Kapaklı 50 ml tüpler kapatın. Bir kurutucuda tüpleri yerleştirin ve vakum uygulanır. Vakum daha sonra, 10 dakika boyunca doku infiltrasyonu solüsyonu çalkalama önlemek için dikkatli bir şekilde vakum bırakın. Örneği karıştırın. İki kez tekrarlayın. Infiltrasyon sonra, bitki materyali gözlemlemek ve biraz saydam hale teyit ve tüp (Şekil 2) dibine batmaya eğilimindedir.
  4. 5 dakika boyunca vakum uygula 0.125 M bir son konsantrasyon elde etmek için 2 M Glisin 2,5 ml ilave edilir. Glisin formaldehid çapraz bağlanma yarışmalı bir inhibitörü olarak görev yapar.
  5. Kapaktaki delikleri kapalı 50 ml tüp tersini PBS formaldehit-glisin çözüm atın.
  6. Aşama 1.5'de tarif edildiği gibi, su ile yıkama çözeltisi atılması ile iki kez 1 x PBS ile ve bir kez küçük bitkileri durulayın. Bir kağıt havlu üzerinde kurutun ve sıvı nitroge dondurman.
    Not: Dondurulmuş doku hafta içinde -80 ° C'de muhafaza edilebilir.

Antikorların 2. Hazırlık (1 gün)

NOT: İmmünopresipitasyon için, bir protein ya da protein G, antikor ağır zincirinin sabit alanı için yüksek afinitesi olan bir bağlayıcı ile antikorlar ile konjuge manyetik boncuk kullanılması tavsiye edilir. DNA-protein kompleksleri, boncuklar-antikor konjugatları yüzeyine spesifik olmayan eklenebilir. Bu nedenle, bu spesifik olmayan bağlanma arka ölçmek için spesifik antikorlar olmayan kontroller gerçekleştirmek için gereklidir.

  1. Her bir immüno-çökeltme için, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde manyetik boncuk 15 ul hazırlar. Boncuk tanelerin miktarının, immüno-çökeltme ve ayrıca antikorlar üzerinde kullanılır kromatin miktarına bağlıdır.
  2. Tu kordonlara Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) seyreltme tamponu 1 ml ilave dönmesiyle karıştırın ve 1.5 mL bir mikrosantrfuj koyun yıkamakManyetik bir raf olması. Boncuklar mıknatıs eklemek izin yaklaşık 1 dakika bekleyin. Rafa hala 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler ile pipetleme süpernatant kaldırmak. İki kez tekrarlayın.
    Not: boncuk ve antikor (Ab) ve bir ikinci antikor, sadece herhangi bir manyetik boncuk (No-Ab) kontrolü ile bir: İki immüno setleri ihtiyaç vardır her bitki soyundan için.
  3. ChIP seyreltme tamponu 200 ul boncuk tekrar. (Tam seyreltme her Ab için farklıdır ve deneysel olarak optimize edilmesi gereken ya da ticari antikorların durumunda, üretici talimatları takip) her bitki soyundan hazırlanan iki tüpün birine özgü Ab gerekli miktarını ekleyin. Immunoprecipitation için bu örneği kullanın. Negatif kontrol olarak kullanılacak diğer bir tüp için spesifik IgG miktarını kullanın.
  4. Antikor boncuk eklemek izin 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin.

3. Kromatin Ekstraksiyon (4 saat)

  1. Toz homojen ve hafif yeşil bir hale gelene kadar havan ve tokmak kullanılarak iyice sıvı azot içinde dondurulmuş bitki materyali öğütün. Yeni 50 ml tüp toz aktarın.
  2. Davlumbaz altında 3.6, iş - adımların 3.2. Ekstraksiyon tamponu 1 30 ml (EXB 1) ekleyin ve doku tozu emmek için iyice karıştırın. Bu adımından, sürekli 4 ° C'de örnekleri tutmak. Dondurulmuş doku ve sıvı azot kalanlar tamponu donmasına neden olur. Tüpleri 4-5 kez, her 2 dk tersini tamamen donmuş doku çözülme emin olun.
  3. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de, yeni bir 50 ml tüp ve santrifüj içine 22-25 um gözenek boyutuna sahip olan bir filtre doku içinde geçirilerek bulamaç temizleyin.
    Not: Bu adımda, çekirdekler ve tüm organellerin pelet olacaktır. EXB 1 yüksek yoğunluklu sağlamak ve organel yapısı aksamaması için yeterli sakaroz içerir.
  4. Yavaşça dekantasyon yoluyla süpernatant kaldırmak. Bu sta atge, yaklaşık 2 ml yeşil pelet gözlemlemek.
  5. EXB 5 ml pelletini pellet 2. Tekrar süspansiyona, bu noktada zor olacaktır. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
    NOT: EXB 2% 1 Triton X-100, açık kloroplastları daldı ve klorofil kaldırmak yardımcı içerir.
  6. Ekstraksiyon Tampon 3 (EXB 3) 300 ul pelletini.
  7. Temiz mikrofuge'de tüp içinde, EXB 3. 600 ul adım 3.6 den yeniden süspanse pelet alın ve dikkatli bir şekilde temiz EXB 3 üstüne onu katman ekleyin.
  8. 4 ° C'de 16,000 x g'de 1 saat boyunca spin.
    NOT: Bu adım örnek deterjan çıkarmadan yardımcı olur.
  9. Bir pipet ile aspire süpernatantı. Yavaş yavaş Sonication verimliliğini etkileyebilecek olan kabarcık oluşumunu önlemek için yukarı ve aşağı pipetleme sonication tampon 300 ul nükleer pelletini. Dikkatle tüm süspansiyon dışarı pipet ve temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp transfer.
    NOT: BuTampon çekirdekleri parçalanması ve kromatin serbest bırakmak için, SDS içerir.
  10. Çekirdekleri parçalanması ve rastgele küçük parçalara kromatin makaslama süspansiyon sonikasyon. (Malzemeleri / reaktiflerin Tablo l'de tarif edilen uygun sonikasyon cihaz için 4 ° C sıcaklıkta 30 sn ayarlar AÇIK / KAPALI 30 saniye 20-30 döngü) 200-800 bp arasındaki parçalar halinde zenginleştirilmiş kromatin oluşturmak sonikasyon koşullarını kullanarak. Sonike kromatin 2 ul (Şekil 3) yüklenmesi, bir agaroz jeli 13 elde edilen DNA fragmanlarının elektroforetik ayrılmasıyla sonikasyon kontrol edilmesi.
    DİKKAT! Ultrason cihazı ses geçirmez bir kabin içinde yer almayan durumunda sonication adımı sırasında kulak koruyucu ekipman giymek emin olun.
    Önemli adım! Kromatin parçalanma ölçüde sonication donanımına bağlıdır. Sonikasyon koşulları uygun DNA boyutlarda zenginleştirme elde etmek için ayarlanmalıdır. GörmekKromatin parçalanma nasıl optimize bir örnek için Şekil 3.
  11. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de çözeltinin bir kez dönerler. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp pipetleme süpernatant aktarın. Pelet atın. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant 1/10 atın -20 ° C'de Giriş ve dondurularak olarak işaretleyin.
  12. % 0.1 son konsantrasyona SDS seyreltilmesi için fiş seyreltme tampon çözeltisi ile kromatin 10x seyreltin.
    Not: Örnekler dondurulmuş ve birkaç hafta -20 ° C'de saklanabilir.

İlgi Protein ve DNA Rescue 4. immünopresipitasyonu (1 gün, 3 saat)

  1. Aşama 2.2 'de tarif edildiği gibi, antikorun fazlasının ayrılması için fiş seyreltme tamponu 1 ml aşama 2,4 üç kez Ab ile kaplanmış boncuk yıkayın. ChIP seyreltme tamponu 200 ul içinde süspanse. İzole kromatin 50 ul ekleyin. 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin.
    NOT: dikkat yoğunluğu kontrolmicrovolume UV-Vis spektrofotometre içinde kromatin üzerinde. İzole kromatin 50 ul DNA fazla 10 ug içermelidir.
  2. 4 ° C adımlar 4,2-4,5 işler için. Aşama 2.2 'de tarif edildiği gibi Düşük Tuz yıkama tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın.
  3. Yüksek tuz yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın.
  4. LiCİ Yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın.
  5. TE tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın. Son yıkamadan sonra, tam bir pipet ile aspirasyon yoluyla tüp içinde sol TE tampon kaldırmak için emin olun.
  6. GİRİŞ örnekleri (adım 3.9) çıkartın. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Transfer INPUT 5 ul ve ChIP örnekleri ile olduğu gibi devam ediyor. % 5 kenetleme iyon değişim reçinesi 200 ul ekleyerek çapraz bağlantıyı ters döndürecek ve her 2-3 dakikada çalkalama 95 ° C'de 10 dakika inkübe edilir. 30 saniye için 16,000 xg'de Spin ve dikkatli bir şekilde pipetle yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine süpernatant aktarın.
    NOT: tra ikenters çapraz bağlamak için ditional metod, bu sebepten, bir protokolü gün daha kısa hale etkin decrosslinking ve 10 dakika DNA'nın elüsyonu sağlar NaCI, 95 ° C de bir kenetleme iyon reçinesi ile kuluçkalama ile O / N inkübasyon içerir.
  7. Proteinaz K 2 ul (10 mg / ml) ilave edin ve 30 dakika proteinleri sindirimi ve DNA serbest bırakmak için 37 ° C'de inkübe edin.
  8. 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe ederek reaksiyonu durdurun.
  9. Hızla 30 saniye boyunca 16.000 xg'de spin ve pipetleme yeni bir tüp süpernatantı aktarın.
  10. DNA, standart DNA fragmanları saflaştırma kiti kullanılarak izole temizleyin.
    NOT: Üreticinin talimatlarına göre hareket edin.
  11. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kiti DNA bağlanma sütun aktarın. Sütunun merkezine DNase içermeyen su 20 ul ilave edilmesi ve 60 saniye boyunca 16,000 x g'de eğirme ile saflaştırılmıştır DNA Zehir. Nokta durdurma: Örnekler birkaç hafta -80 ° C'de saklanabilir.

5. qPCR immünopresipitasyona DNA'daki Siteleri Bağlama Bolluk Ölçme (4 saat)

Not: Çökelen kromatin izole edilmiş DNA birleşmesinden oluşan ilgilenilen proteine ​​bağlanması ile toplam kromatin yonga-ed edilmiş olan DNA fragmanları belirlemek için analiz edilmesi yer alır.

  1. 60 ° C'lik bir erime sıcaklığı (Tm) ve% 30 -80% bir GC içeriğine sahip ilgili genomik bölgelere tasarım primerleri. Kromatin sonikasyon ile parçalanır olarak, amplifiye edilen dizideki uzunluğu 150-200 nükleotidleri (Tablo 1) daha uzun olmamalıdır.
    NOT: Primer tasarımı için yararlı bir araç Primer 3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Primer tasarımı için ek kurallar 14,15, önceki raporlarda 8 mevcuttur.
  2. Primerlerin özgü olduğundan emin olmak için bir patlama programı kullanın (özellikle destekleyiciler dizilerinin bağlama benzer TF paylaşabilirsiniz) ve astar verimliliği usin testig giriş DNA (adım 4.9) suda 01:10 dilüsyonları. Genomun belirli bölgeleri diğerlerinden daha iyi saflaştırılmıştır edilecektir. Bu PCR primerleri tasarlamak ve seyreltilmiş giriş DNA onları kontrol etmek önemlidir.
  3. Her reaksiyon için bir PCR tüpü içinde su ve pipet ile seyreltilmiş DNA 5 ul saflaştırılmış DNA 1:10 seyreltin.
    NOT: DNA, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler duvarları ekleyebileceğiniz gibi yalnızca gerektiğinde miktarını seyreltin. Çoklu çözülme-donma döngüleri ekli DNA moleküllerinin sayısını artırmak. Giriş, her primer çifti, büyütme için, Ab-Chip ve Resim-Ab ChIP analiz edilmesi yer alır.
  4. PCR karışımı tamamlamak için, 1x nihai bir konsantrasyona kadar SYBR Green PCR ana karışımı ekleyin ve her bir primerden 0.5 uM. DNaz içermeyen su ile 20 ul kadar doldurun.
  5. SYBR Green PCR master mix üreticisinin talimatları takip ederek qPCR reaksiyonu gerçekleştirin.

6. Veri Analizi

NOT: ex arasındaChIP-verileri analiz yollarını ğu iki en yaygın kullanılmaktadır. Bunlardan ilki, aynı zamanda 'no-antikor kontrole göre' göreceli zenginleşme ',' arka plan üzerinde sinyal 'olarak adlandırılan veya kat zenginleştirme yöntemidir. İkinci yöntem "girdi%" olarak adlandırılır.

  1. Kat zenginleştirme yöntemiyle veri analizi.
    1. QPCR reaksiyonundan sonra elde edilmiştir örnekler isimleri ve ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun.
    2. Her numune için, ham Ct değerine karşılık gelen hiçbir-Ab kontrolü için elde edilen ham Ct değeri çıkarılır. NOT: Bu matematiksel işlemden sonra, No-Ab numunesi için Ct değeri 0 eşit olur.
    3. Tabanı 2 ve adım 6.1.2 (Tablo 2) 'de elde edilen negatif geri kalanına eşit üs (güç) ile üs işlemiyle kat zenginleşme hesaplayın.
      zenginleştirme kat = 2 - (Ct (örnek) - Ct (No-Ab))
      NOT: Bu metho içinded ChIP-ed numunesinde belirli bir DNA fragmanı bolluğu Resim-Ab kontrol Bu fragmanın bolluk ile karşılaştırılır. Bu yöntemin varsayım plan sinyalinin seviyesinin farklı primer setleri, örnekler ve çoğaltma deneylerde tekrar olmasıdır. Ancak, bu'noise' sinyal seviyeleri primer setleri, örneklerin ve deneyler arasında değişir.
  2. Giriş yöntemi% oranında Veri analizi.
    1. Numuneler isimleri ve qPCR reaksiyonundan sonra kendileri için elde edilmiş ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun.
    2. Bir girdi olarak alınmıştır toplam ekstre kromatin fraksiyonu logaritma tabanı 2 değeri çıkartılarak giriş örnekleri için ham Ct değerlerini ayarlayın.
      NOT: Toplam kromatin% 10, bu protokolde bir girdi olarak çekildiği gibi çıkarılır değer, 3.32 eşittir Bu protokolde. Log 2 (10) 3.32 eşittir.
    3. 100 ile b üstel işlem değeri çarpılarak giriş% hesaplayınase 2 ve örnek (Tablo 3) ham Ct değerleri çıkarılır düzeltilmiş giriş değerleri geri kalanı eşit üs (gücü).
      Girişinin% = 100 * 2 (düzeltilmiş girişi - Ct (örnek))
      NOT: Bu prosedür ile toplam izole kromatin (giriş örnek) için ChIP-ed örneğindeki spesifik DNA bolluk arasındaki ilişki hesaplanır. Çip veri analizi ile ilgili daha fazla detay Haring ve arkadaşları. 8 bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sekiz temel adım büyüyen ve bitki malzemesi, kromatin çapraz bağlanması, kromatin izolasyon, kromatin parçalanması, DNA arasındaki komplekslerin seçici izolasyonu hasat içeren in vivo protein-DNA etkileşim tanımlanması için bu yonga protokolde saydı edilebilir immüno-protein sindirimi, DNA saflaştırma ve qPCR analizi (Şekil 1), ilgi konusu bir protein. ChIP protokolünde çok önemli bir aşaması, bir çapraz bağlanma reaksiyonunda DNA-protein etkileşimlerinin fiksasyondur. Tipik haliyle, formaldehi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan ChIP protokolü Arabidopsis bitkileri, in vivo proteinler ve özel DNA dizileri arasındaki etkileşimi analiz etmek için tekrarlanabilir ve güçlü bir tekniktir. Ilgi proteinlerin için bağlayıcı siteleri başarılı bir kimlik ilgili etkileşimler aslında yer alıyor bitki organları ya da gelişimsel aşamaları yeterli bir seçim gerektirir. Buna ek olarak, bitki malzemesinin, uygun bir tespit ve sonikasyon ile kromatin optimal kesme elde etmek için kritiktir. Seçilen protein / etiket etkin immüno-çökeltme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, bu dergide yayınlanan bazı verilerin, burada Şekil 4'te açıklanan temsili sonuçları detaylandırmak için kullanılmasına izin verdiği için The Plant Cell'e teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, AB 7FP Marie Curie-Başlangıç Eğitim Ağı EpiTRAITS (Hibe Anlaşması 316965) ve İspanyol Ministerio de Economìa y Competitividad (BIO2010-15589 ve BIO2013-43098-R hibeleri) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MESSigmaM8250
MS (Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı)SigmaM5524
Formaldehit %37 SigmaF8775-25Çeker ocak altında kullanın
Proteaz inhibitörü karışımı cOmplete ULTRA Tabletler, Mini, EDTA içermeyen, EASYpackRoche5892791001
Bioruptor Standart sonikasyon cihazıDiagenodeB01010002 (UCD200TO)
GlisinSigma50046
QIAquick PCR Arıtma KitiQiagen28104
Protein A veya protein G ile birleştirilmiş Dynabeads manyetik boncuklarLife Technologies10003D/10001DÜreticinin kontrol edin Antikor afinitesi için s kılavuzu
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Yüzey Fact-Amps Deterjan ÇözeltisiYaşam Teknolojileri85112
(fare, sıçan, tavşan ve hellip;)-IgGDiagenodeC15400001, C15420001, C15410206
Manyetik raf - DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9/14ac poliklonal antikor - Premium DiagenodeC15410200-10
Chelex 100 ReçineBio-Rad142-2832
Proteinaz KLife Technologies17916
Anti-Myc Tag Antikor, klon 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Yeşil IMaster Roche 4707516001

Kaynaklar

  1. Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
  2. Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
  3. Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
  4. Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
  5. He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
  6. Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
  7. Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).
  9. Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
  10. Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
  11. Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
  12. Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998(2012).
  15. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  16. Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
  17. Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
  18. Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
  19. Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).
  20. Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
  21. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  22. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  23. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
  24. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  25. Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Arabidopsis ThalianaTranskripsiyon Faktörü BağlanmasıHiston Modifikasyon AnaliziÇapraz Bağlama ProsedürüSonikasyon FragmantasyonuManyetik Boncuk İmmünopresipitasyonuqPCR KantifikasyonuFT Gen Regülasyonu
Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.