Yöntem makalesi

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/53424

⸱

28 Kasım 2015

 ,  , 
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spesifik metabolik yollar, makrofaj alt kümelerinin kritik ayırt edici özellikleri olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. LPS ile indüklenen klasik olarak aktive edilen M1 veya M (LPS) makrofajları proinflamatuar iken, IL-4 alternatif makrofaj aktivasyonunu indükler ve bunlar M2 veya M (IL-4) olarak adlandırılır ve inflamasyonun çözülmesini ve yara iyileşmesini destekler. Son kanıtlar, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonunun düzenlenmesinde metabolik yeniden programlamanın önemli rolünü göstermektedir.

Bu makalede, naif, M1 ve M2 polarize fare kemik iliği türevi makrofajların metabolik özelliklerini değerlendirmek için bir hücre dışı akı analizörü uygulanmıştır. Bu cihaz, glikolitik ve mitokondriyal oksidatif metabolizma ile ilişkili olabilecek hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için pH ve oksijen sensörlerini kullanır. Bu nedenle, hem glikoliz hem de mitokondriyal oksidatif metabolizma, tek bir tahlilde gerçek zamanlı olarak ölçülebilir.

Bu tekniği kullanarak, burada inflamatuar M1 makrofajlarının artmış glikolitik metabolizma ve azalmış mitokondriyal aktivite gösterdiğini gösteriyoruz. Tersine, anti-inflamatuar M2 makrofajları yüksek mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) gösterir ve gelişmiş bir yedek solunum kapasitesi (SRC) ile karakterize edilir.

Sunulan fonksiyonel test, belirli sitokinlerin, farmakolojik bileşiklerin, gen nakavtlarının veya diğer müdahalelerin makrofajın metabolik fenotipini ve inflamatuar durumunu nasıl etkilediğini araştırmak için bir çerçeve görevi görür.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar hemen hemen tüm hastalıklarda önemli bir rol oynarken, kendi fenotip düzenleyen moleküler mekanizmalar hala tam olarak sökülmüş değildir. Makrofajlar yüksek heterojenlik gösterir ve mikroçevresinin cevaben farklı fenotipleri 1 benimsemek. LPS (+ IFNy) klasik M1 veya M (LPS) makrofajlar iltihabı teşvik ve mikrobiyal tehdit 2 farklı türlerine karşı konakçıyı korumasına aktive araştırmaktı. Diğer M1 polarizasyon ortaya çıkarmak için uyaran olarak TNF ile tek başına ya da kombinasyon halinde IFNy kullanın. IL-4 ve / veya IL-13, alternatif makrofaj aktivasyonuna neden olur ve bu M2 veya M (IL-4) hücreleri güçlü bir bastırma ve 3 devam eden bağışıklık tepkilerinin kontrol cihazları bulunmaktadır. Polarize makrofajlar LPS ile aktive makrofajlar M1 gelişmiş glikoliz 4-6 metabolik anahtarı geçiren hücresel metabolizmanın farklı bir yönetmelik görüntüler. Bunun aksine, geliştirilmiş yağ asidi oksidasyon (FAO) ve mitokondriyal oxidative fosforilasyonu (OXPHOS), IL-4 ile uyarılan M2 makrofajlar 7-9'da sürekli enerji sağlar. Böylece, değişmiş metabolizma bu doğru kutuplaşma ve inflamatuvar düzenlenmesi için bir ön koşul değil, sadece polarize makrofaj altkümelerini bir özelliği de olmasıdır. Önemlisi, glikoliz veya OXPHOS engellenmesi / FAO sırasıyla 8,10, M1 veya M2 aktivasyonunu bozduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, makrofajlarda belirlenmesi metabolik değişiklikler polarizasyon durumu ve inflamatuar potansiyelinin değerlendirilmesi için bir araç olarak uygulanabilir.

Makrofaj metabolizmasını ölçen tutarlı bir tahlil bu nedenle ilaç, gen yıkmak olmadığını tahmin etmek için kullanılan olabilir veya diğer tedavi makrofaj kutuplaşma ve işlevini etkiler. Bu videoda, bir hücre dışı akı analizör naif, M1 ve M2 makrofajlar biyoenerjetik profillerini tanımlamak için kullanılır.

Bu el yazması ölçümünü sağlayan bir optimize edilmiş protokol detaylarıtüm ilgili glikoliz parametreleri (glikoliz, maksimal glikolizis ve glikolitik rezerv) ve bir tek deneyde mitokondriyal fonksiyon özellikleri (toplam solunum, bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi). Bu deney düzeneği kullanarak, biyoenerjetik hücreleri (transgenik ifadesinin veya farmakolojik tedavi yıkmak gibi geni) kontrol ve 'değiştirilemez' arasında mukayese edilebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kültürleme ve Polarizasyon Kemik İliği-türevli Makrofajlar

  1. Gün 0: ilgi 6-10 haftalık farelerden izole edin femur ve tibia kemikleri (bu deneyde C57BL / 6).
  2. Kemiklerden kas dokusu çıkarın ve buz gibi soğuk PBS ile dolu bir 9 cm'lik petri tabağına kemikleri yerleştirin.
  3. % 70 etanol ile dolu bir 9 cm Petri için kemik aktarın ve yavaşça 30 sn için plaka çalkalayın.
  4. Buz gibi soğuk steril PBS ile dolu bir taze 9 cm Petri kabı kemikleri aktarın.
  5. Steril makas ile her iki ucunda ve femur tibia kesin.
  6. 10 ml'lik bir şırınga ve bir tane 25 G iğne kullanılarak 10 ml buz gibi soğuk PBS ile kemik steril yıkayın. 50 ml'lik bir tüp içinde kemik iliği toplamak.
  7. 23 G iğne kullanarak yeni bir 50 ml tüp kemik iliği hücreleri aktarın.
  8. 25 G iğne ile bu adımı yineleyin. Not: Bu adımlar hücre kümeleri ve kemik kalıntılarını çıkarmak için gereklidir.
  9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
  10. Sup atınernatant ve 40 ml hücre kültür ortamında (RPMI-1640 artı 2 mM L-glutamin,% 10 FCS, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve% 15 süzüldü L-929 hücre hücreleri tekrar süspansiyon ( ATCC CCL-1), L-929 hücre koşullu ortam yerine M-CSF (ya da seçenek olarak 10 ng / ml yeniden birleştirici M-CSF ihtiva eden -conditioned ortamı).
    Not: L-929 hücre klimalı ortamda nesil 2013 11 daha önce bu dergide ayrıntılı edildi
  11. Kültür, 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde levha başına 20 ml kültür ortamı içinde iki adet 15 cm Petri kapları (makrofaj bu plastiğin ayrılmaz çünkü hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar kullanmayın) bir fare hücreleri.
  12. 20 ml daha büyük hücre kültür ortamı çıkarmadan, 3. günde 10 ml taze kültür ortamı hücre ekleyin.
  13. Aksi takdirde 6. günde 20 ml taze kültür ortamı ile her plakanın eski orta değiştirin yapışmayan hücreler de kaldırılır.
  14. 8. Gün:
    1. Onlara 5 m kuluçka hücreleri Ayır(otoklavlanmış, H2O içinde 135 mM potasyum klorid ve 15 mM sodyum sitrat), 37 ° C de 10 ml tuzlu su sitrat ve 10 ml PBS ile yıkayın. Hücre sayacını kullanarak günde 8 olgun, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDM) sayın.
    2. Görsel denetim veya flow sitometri ile Olgun oluşumunu (CD11b + F4 / 80 +) BMDM doğrulayın. 100 ul PBS içinde 20 dakika boyunca PBS içinde 1/100, anti-CD16 / CD32 ile Blok 10 5 hücreleri, oda sıcaklığında anti-CD11b-FITC ile 1/200 artı 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 ile inkübe yıkama ve flow sitometri ile analiz edin.
      Not:. Kültürleme fare kemik iliği kökenli makrofajlar Ying ve ark 11 tarafından daha önce bu dergide detaylı olarak yayınlanmıştır.
  15. Tohum 50.000 hücre 100 ul kültür ortamı içinde bir hücre kültürü mikrotablada oyuk başına (optimum hücre sayımları optimize edilmesi gerekir). Arka plan düzeltme kuyuları (A1, A12, H1, H12) hücreleri tohum ve bu kuyulardan sadece orta (hücre) koymayın İpucu:. Bir açı a at pipet tutunyarım en homojen hücre katmanı için kuyuların yan aşağı butik.
  16. Hücreler, 1 saat için bir hücre kültürü kaputu oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Bu hücre dağılımı eşit teşvik etmek ve kenar etkilerini azaltacaktır. 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör bir mikroskop ve kültür kullanan uyumu izlemek.
  17. Üç saat sonra kaplama, 10 ng / ml LPS, veya 20 ng / 24 st için hücreleri uyarmak ml IL-4, sırasıyla, M1 veya M2 makrofajlar üretmek için rekombinant fare. Bir kontrol olarak tedavi edilmemiş saf (M0) makrofajlar ekleyin. IL-6, IL-12 LPS ile indüklenen salgısının ölçülmesiyle doğru M1 ve M2 makrofaj kutuplaşma değerlendirilmesi, TNF (ELISA) ve IL-4 ile uyarılan arginaz-1 aktivitesi ve / veya NMR (CD206) ile MGL (CD301) yüzey ekspresyonu Daha önce 3,11 açıklandığı gibi (flow sitometri).
    Not: Bu noktada, hücreler (önceden) diğer faktörler ile uyarılabilir ilgi veya makrofajlar farmakolojik bileşiklerle ile tedavi edilen. Yana, ayrı kuyuları arasındaki varyasyon subs olabilirtantial, bu durumda en az 4 ve ideal olarak 6 kuyu kullanılması tavsiye edilir.

Hücre dışı Akı Testinin 2. Hazırlık

  1. Bir gün tahlil çalıştırmadan önce sensör kartuşu hidrat:
    1. Bir sonraki yarar plakasına ters sensör kartuşunu yerleştirin.
    2. Kalibrant çözeltisi 200 ul programı bir levhanın her bölmesine doldurun ve kalibrant çözeltisi sensörleri daldırılması programı plakası üzerine sensör kartuşunu indirin.
    3. Kalibrant çözüm düzey olmayan bir CO 2 37 ° C inkübatör O / N batmış sensörleri ve yer tutmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun.
  2. Analiz aşağıda belirtildiği gibi gününde deney ortamı hazırlayın:
    1. 37 ° C sıcak bir 50 ml XF taban ortamı.
    2. 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek için 500 ul 200 mM L-glutamin ekleyin.
    3. 1 N NaOH ile 7.4'e pH ayarlama ve 0.2 uM filtre ile sterilize ve 37 ° C'de deney ortamını tutun.
  3. Yavaşça polarize makrofajlardan hücre kültür ortamı çıkarın ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de saklayın (örneğin ELISA uygun makrofaj kutuplaşma incelemek için). , 100 ul deney ortamı ile hücreleri yıkayın kuyu başına 180 ul tahlil orta eklemek ve hücreler yıkanıp değil mikroskop altında doğrulayın. Deney döngüsünden önce 1 saat boyunca CO2 olmadan 37 ° C inkübatör hücre kültür plakası yerleştirin.
  4. 37 ° C'ye kadar, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, sıcak D kadar 10 x enjeksiyon bileşik karışımları A Hazırlama, 7.4 ve filtre ile sterilize pH ayarlamak.
    1. 10x hücre kültür havuzlarına nihai konsantrasyon, bu karışımlar içinde tüm bileşikleri yapmak ve her hücre tipi için, bu konsantrasyonlar optimize eder.
  5. Bağlantı noktaları A, B, C ve D, respe hazırlanan 10x enjeksiyon madde karışımlarının belirtilmedikçe hacim (Tablo 1) ile donatılmış yükleme kılavuzları kullanarak sensör kartuşunu doldurmactively.
Karışım / Enjeksiyon Bileşikler Cilt 10x Karışımı (ul) almak eklendi Cilt Analiz Ortamı (mi) Çalışması sırasında enjekte edilen hacim (ul) Deneyde nihai konsantrasyonu
A 2.5 M (% 45) glukoz 300 2.7 20 25 mM
B A oligomycin 5 mM (OM) 9 3,0 22 1,5 uM
C 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 uM
100 mM Sodyum Privat çözeltisi 300 1 mM
D 5 mM antimycin A (AA) 15 3,0 28 2,5 uM
5 mM rotenone (Rot) 7.5 1.25 uM

Tablo 1. Enjeksiyon karışımlarıdır.

Bir Ekstrasellüler Flux Analyzer kullanarak Polarize M1 ve M2 BMDM 3. Bioenerjetik Karakterizasyonu

  1. 2 dakika MIX ve 3 dakika TEDBİR süreleri ve (en azından) 3 mix ve hız ölçümleri tahlil sihirbazı ile bir deney şablonu oluşturma 4 enjeksiyonları her birinden önce (Tablo 1) ve son enjeksiyondan sonra döngüler.
    Not: Bu konsantrasyonlar, kemik iliği türevli makrofajlar ve RAW264.7 makrofaj hücre çizgileri için geçerlidir, ancak her hücre tipi için optimize edilmelidir. FCCP karışımı içinde ekleme piruvat maksimum solunum yakıt için gereklidir.
  2. Başlangıç ​​dibe iterek çalıştırmak başlatın ve aygıtın talimatları izleyin. Araç ilk yükhidrate problar ile tridge plaka aparatı ve bir sonraki yük hücresi levhası ile kalibrasyonu izin vermek.
  3. Deneyinden sonra dikkatlice analiz ortamı atılır ve satıcı tarafından detaylı olarak tarif edildiği gibi, hücre çoğalması test kiti kullanılarak ileride hücre normalizasyonu için -20 ° C'de analiz hücre kültürü mikroplak saklayın.
    1. Kısaca, damıtılmış su içinde B bileşeni 20 kat seyreltilmesi ile 1x hücre lisis tamponu hazırlamak ve bileşik 1x hücre lisis tamponu içinde bir 400-kat seyreltilir. , Oyuk başına 200 ul ekle oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmek ve ~ 180 nm eksitasyon ve 520 nm emisyon ~ maxima ile floresan ölçer.
      Not: yapışmayan hücreleri ile çalışırken veya kötü yapışma bir sorun, bu protokol, tüm deney ortamını atarak gerektirmediğinden doğrudan hücre çoğalma kiti alternatif olarak kullanılabilir ise. Ancak, bu doğrudan protokol bu laboratuarda kullanılan protokole göre biraz daha az duyarlıdır.
  4. Floresan ölçümünden sonra, normalleştirmekHer bir hücre sayısı ve tüm naif makrofaj kuyuların ortalama hücre sayısı 1 ile ayarlanmış olan bir oranı.
    (Örneğin, bir BCA deneyi kullanılarak) protein miktarının hücreleri sayısında normalize edilmesi için bir yol olarak kullanılabilir: edin. Bununla birlikte, elimizdeki bu deney hücre çoğalması test kiti ile karşılaştırıldığında daha az duyarlı idi.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre-dışı akı tahlili ve hücre ölçümü bittikten sonra, veri hücre sayımı için normalize edildi ve analiz edilebilir. Şekil 1A ve Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, tipik olarak bu ECAR ve OCR araziler verecektir.

Glikoz (A) 'lerin enjeksiyonundan sonra, ECAR artış glikoliz hızını temsil eder. Oligomycin (B) ile ATP sentaz inhibisyonu sonra ECAR ek artış glikolitik rezerv ve kapasite (Şekil 1A) hakkında bilgi sağlar. OCR değerlerini analiz ederken, enjeksiyon (B) oligomycin mitokondriyal ATP sentezi için kullanılan oksijen tüketiminin hesaplanmasını sağlar. FCCP (C) mitokondriyal solunum koparan ve ilgili OCR ölçümleri maksimal ve yedek solunum kapasitesi hakkında veri elde. Son olarak, rotenone enjeksiyonu (Rot) ve antimycin A (AA) mitokondriyal kompleks I engellemek ve III ve artık OCR olmayan mitokondriyal oksijen eksilerini temsilumption (Şekil 1B).

figure-results-1
Şekil 1: XF Ekstrasellüler akı deneyinde elde edilen Metabolik parametreler. (A) hücresel glikoliz ardından parametreleri (mph / dk) ECAR değerlerinden hesaplanır: glikoliz, maksimum glikolitik kapasite ve glikolitik rezerv. Bazal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi: (pmol / dk) (B) OCR ölçümleri mitokondriyal fonksiyon sonraki temel parametrelerini hesaplamak için kullanılır. Gluc = glükoz; OM = oligomycin A; FCCP = karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon; AA = antimycin A; Rot = Rotenone bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

Çalıştırdıktan sonra, ECAR ve OCR ölçümleri 1 tilaşağıdaki gibi ECAR ölçümlerinden her bir kuyunun l 15 Excel'e ihraç edilebilir ve aşağıdaki glikolitik parametreler hesaplanabilir:

Sigara glikolitik asitlenme = ort. ECAR (1,2,3)

Glikoliz = ort. ECAR (4,5,6) - ort. ECAR (1,2,3)

Maksimum glikolitik kapasite = ort. ECAR (7,8,9) - ort. ECAR (1,2,3)

Glikolitik rezerv avg =. ECAR (7,8,9) - ort. ECAR (4,5,6)

OCR oranlarından sonraki metabolik özellikleri tespit edilebilir:

Sigara mitokondriyal solunum = ort. OCR (13,14,15)

Bazal solunum = ort. OCR (4,5,6) - ort. OCR (13,14,15)

ATP üretimi = ort. OCR (4,5,6) - ort. OCR (7,8,9)

Proton kaçak =ort. OCR (7,8,9) - ort. OCR (13,14,15)

Maksimum solunum = ort. OCR (10,11,12) - ort. OCR (13,14,15)

Yedek solunum kapasitesi (SRC) = ort. OCR (10,11,12) - ort. OCR (4,5,6)

figure-results-2
Şekil 2:. Naif metabolik özellikleri (M0), LPS (M + -1) ve IL-4 (M2) polarize makrofajlar 8 ayrı kuyuların ortalama (SEM) her bir ölçüm, ortalama ve standart hata için sunulmuştur. (A) Hücre dışı asitlenme oranları (MPH / dak ECAR) ve (B) oksijen tüketimi oranları (OCR, pmol / dk) farklı şekilde polarize (M1 ve M2) ve naif makrofajlar (M0) için ölçülür. (CyQUANT ile ölçülen) ve saf makrofajlar ortalama hücre sayısı, 1. ayarlandı Tüm ölçümler hücre sayımı için normalize edildijection A = glükoz; B = oligomycin; C = FCCP; D antimycin A + rotenone =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, LPS ile makrofaj aktivasyonu glikolitik metabolizma artışa yol açar. Şekil 2B'de oksijen tüketimi oranlarına (OCR) bakarken, LPS ve IL-4 ile tedavi edilmiş makrofajlar arasındaki farklar çok daha belirgindir. Maksimal oksidatif metabolizması yüksek M (LPS) ile bastırılır olsa da, bu, IL-4 M2 makrofajlar, bazal ve özellikle de maksimum solunum indükler. Bir artmış glikolitik M (LPS) makrofajlar oldukça benzersiz ve M (IFNy) makrofajlar glikolizi geliştirmek göstermek yok çünkü ille M1 makrofajların karakteristik olmadığına dikkat edilmelidir.

Genel olarak, bu, hücre dışı akı analizi tha göstermektedirLPS ile aktive makrofajlar görüntüleme glikolitik metabolizma geliştirilmiş herhangi bir fazlalık solunum kapasiteye sahip değildir, oysa t, M2 makrofajlar gelişmiş oksidatif metabolizması ile karakterize edilir ve özellikle de yüksek bir yedek solunum kapasiteli (SRC) IL-4 ile uyarılan.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarımızda amacı makrofaj kutuplaşma ve fonksiyon ateroskleroz ve diğer inflamatuar koşulları 12 sonuçlarını iyileştirmek için nihai hedefi ile nasıl etkilenebileceği anlamaktır. Makrofaj polarizasyon değerlendirmek için, bir tipik haliyle, LPS (+ IFNy) bağlı ve M1 ve M2 marker genleri (qPCR) gen ekspresyonu, IL-4 ile uyarılan ölçen ELISA ile IL-6, IL-12, TNF ve NO salgılanmasını (belirler ve Griess tepkimesi) ve IL-4 ile uyarılan CD71, CD206, CD273 ve CD301 yüzey akış sitometrisi ile ifade () ve arginaz aktivitesi 3,13 inceler. Buna ek olarak, (DII oxLDL alımı, LipidTOX nötral lipid boyama ile) ve köpük hücre oluşumu deneylerinde (floresan lateks boncuk ve / veya pHrodo E.coli) ile fagositoz deneylerinde (Annexin-V / PI boyaması) apoptoz deneyleri için yapılabilir makrofaj işlevini 14 değerlendirir. Ayrıca, hücre dışı akı analizi Biyoenerji polarize mac profillerini ölçmek için yapılabiliryeni ve alternatif fonksiyonel okuma olarak rophages.

Bu el yazması makrofaj kutuplaşma onların enerji kaynağı olarak artan glikoliz geçiş LPS makrofajlar ile metabolik yeniden programlama uyardığını göstermektedir. Bunun aksine, IL-4 ile uyarılan M2 makrofajlar ATP ana kaynak olarak mitokondriyal oksidatif fosforilasyon kullanın. Önemlisi, metabolik yeniden programlama sadece M1 ve M2 polarize makrofajlar özel gereksinimleri için gerekli enerjiyi sağlar. Nitekim, metabolik değişiklikler makrofaj fenotip 10,15,16 doğrudan düzenleyicileri metabolit konsantrasyonları etkiler. Ama aynı zamanda farklı makrofaj polarizasyon durumlarının bir sürücü (Şekil 2'de burada görüldüğü gibi) ve bu yeni bilgi son birkaç yıldır sırasında immunometabolism araştırma alanının hızlı büyümesini destekledi Dolayısıyla, makrofaj metabolizma sadece bir özelliğidir.

Ancak, makro metabolik profillerin sağlam ölçümlerifajları zor kaldı ve sınırlamaları vardı. Bu çalışmada, bir hücre dışı akı analizör sağlam gerçek zamanlı olarak glikoliz, glikolitik rezerv, maksimal glikolitik kapasite olmayan glikolitik asitlenme, bazal ve maksimal solunum, ATP üretimini, yedek solunum kapasitesi, proton sızıntısı ve non-mitokondrial solunum ölçmek için uygulanan makrofaj az bir miktarda uygulanır.

Bu nedenle, değiştirilmiş ve aşağıda üreticinin protokolleri geliştirilmiştir. Standart Mito Stres Testi (# 103015-100) glukoz ve piruvat ve 3 enjeksiyonları (OM, FCCP, AA / Rot) ile bir protokol ile orta kullanarak önerir. Biz, glukoz / piruvat-içermeyen ortam ile tahlil başlangıç ​​(Glikoliz stres testi # 103.020-100 gibi) port A bir birinci enjeksiyon olarak glikoz ekleyin ve bu şekilde de bağlantı noktası C'de FCCP uncoupler birlikte piruvat eklemek tercih tüm ilgili glikoliz parametreleri ECAR ölçümlerinin 1-9 ve mitochondri ilgili tüm bilgilere türetilmiştirOCR ölçümlerinden 4-15 den al fonksiyonu.

O ayrılması tekniğine maksimal solunum yakıt FCCP birlikte piruvat enjekte kritik olduğunu unutmayın. Bu kombine protokolü kullanılarak önce, bir de 2-Deoksi-D-glikoz (2-DG) başlangıç ​​değerleri (1-3) için tahlil sonra ECAR seviyelerini düşürdüğünü doğrulamalıdır ve kayıtlı ECAR oranları 06/04 gerçekten de bağlı olduğu glikoliz. Buna ek olarak, bir bu metinde geçen bileşik konsantrasyonları ve hücre sayıları, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar ve RAW264.7 makrofaj hücre çizgileri için geçerlidir ve diğer hücre tipleri için optimize edilmesi gerektiğini anlamak gerekir. Ayrıca, bir kemik iliği türevi makrofajlar oluşturmak için kullanılan M-CSF, bir M2 gibi anti-inflamatuar fenotipi teşvik olduğuna dikkat edilmelidir. Kemik iliğinden türetilmiş makrofajlardan sunulan sonuçlar bu nedenle hücre culturi sırasında M-CSF gerektirmeyen primer doku yerleşik makrofaj veya makrofaj hücre çizgileri ile yapılan ölçümlerin bütünüyle karşılaştırılabilir olmayabilirng.

Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol, makrofajların az miktarda gerektirir ve hızlı bir şekilde, hemen hemen bütün temel metabolik hücre özelliklerini içerir. Bu, diğer immünolojik tayinler ve biyoenerji profil oluşturma için kullanılan da hücreler de tahlil sonra amaçlı diğer için kullanılabilir gerçekleştirmek için yeterli artı hücrelere yol açar. Ayrıca, özellikle de 96 kuyucuklu plak format, aynı zamanda, gerçek zamanlı olarak birden fazla koşulları değerlendirmek sağlar. Yine de, tek tek oyuklara arasındaki farklılıklar önemli ve dolayısıyla durum başına en az 4 kuyu kullanımı çoğu zaman arzu edilir olabilir. Dikkate alındığında bu sınırlama, tarif dışı akı analizi hala 10'dan fazla deneysel koşullar çalıştırmanızı sağlar (n = 6), geleneksel tekniklerle çok daha fazla olduğu, bir kerede.

Genel olarak, bu makalede ilgili tüm glikoliz ve mitokondriyal param ölçme izin veren kolay ve tekrarlanabilir fonksiyonel tahlil sağlarpolarize makrofaj alt gruplarında eters. Bu teknik makrofaj fonksiyonu değerlendirmek için ve makrofaj adlı (metabolik) fenotip üzerindeki farklı manipülasyonlar etkisini (örn gen yıkmak, yeni ilaçlar, vs.) değerlendirmek için bir gelecek uygulama olarak hizmet verebilir. Bu haliyle, hücre dışı akı veriler makrofaj aktivasyon durumu derinlemesine tanımlamasının yapılmasına diğer deneylerde ile bağlantılı olarak kullanılabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu maddeye ücretsiz erişim Seahorse Bioscience tarafından desteklenmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan Van den Bossche, Hollanda Kalp Vakfı'ndan (2013T003) Junior Postdoc bursu ve ZonMW'den (91615052) VENI hibesi aldı. Menno de Winther, Hollanda Kalp Vakfı'nın (2007T067) Yerleşik Araştırmacısıdır, Hollanda Kalp Vakfı hibesi (2010B022) tarafından desteklenmektedir ve AMC bursuna sahiptir. Ayrıca Hollanda Kardiyovasküler Araştırma Girişimi, Hollanda Üniversite Tıp Merkezleri Federasyonu, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü ve Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi'nin "Ateroskleroz için en iyi kanıta dayalı farmasötik hedeflerin oluşturulması" (CVON2011-19) GENIUS projesine verdiği desteği de kabul ediyoruz. Açık erişimli yayını mümkün kıldığı için Seahorse Bioscience'a teşekkür ederiz. Yazarlar, Denizatı analizörü ile ilgili önceki tüm yardımları için Riekelt Houtkooper ve Vincent de Boer'e (Genetik Metabolik Hastalıklar Laboratuvarı, Akademik Tıp Merkezi, Amsterdam, Hollanda) teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
23G ve 25G iğnelerBecton Dickinson# 300800 ve # 300600Yıkanmış kemik iliğine
10 ml şırıngaBecton Dickinson# 307736Kızarmış kemik iliği
için Petri kaplarıGreiner# 639161Kemik iliği hücrelerini kültürlemek için
CyQUANT Hücre Proliferasyon Test kiti ve nbsp;Moleküler Problar#C7026Daha sonraki bir zaman noktasında hücre ölçümü için (yalnızca yapışık hücreler için çalışır)
CyQUANT Doğrudan Hücre Proliferasyon Test kiti & nbsp;Moleküler Problar# 35011Testten hemen sonra hücre ölçümü için (yapışmayan hücreler)
XFe< / sup>96 hücre kültürü mikroplakasıDenizatı Biyobilimi# 101085-004Hücrelerin kültürlendiği ve testin yapıldığı 96 kuyulu plaka
rekombinant fare interlökin-4 (IL-4)Peprotech# 214-14-Bmakrofaj aktivasyonunu
indüklemek için kullanılırlipopolisakkarit (LPS)Sigma#L2637Proinflamatuar uyaran
Denizatı Sensör Kartuşu Denizatı Biyobilimi#102416-100pH ve O2 ölçümü için probları içerir
Denizatı XF Kalibrasyonu Denizatı Biyobilimi#100840-000Probları gece boyunca nemlendirmek için gerekli 
XF baz orta Denizatı Biyobilimi#102353-100pH değişikliklerinin verimli bir şekilde ölçülmesini sağlayan tamponsuz ortam
L-glutaminYaşam Teknolojileri#25030-081
D-(+)-GlikozSigma#G8769Hücrelere eklendikten sonra glikolizi yakıtlar
oligomisin ASigma#75351Mitokondriyal ATP sentazı inhibe eder
FCCP( Karbonil siyanür 4-(triflorometoksi)fenilhidrazon)Sigma#C2920Mitokondriyal solunumu ayırır
100 mM Sodyum Piruvat çözeltisiLonza#BE13-115EGlikolize ihtiyaç duymadan maksimum mitokondriyal solunuma izin verir
Antimisin ASigma#BE13-115EA8674Mitokondri kompleksi III'ü inhibe eder
RotenoneSigma#BE13-115EA8674R8875Kompleks I'i inhibe eder. mitokondri
Casy Hücre SayacıRoche Teşhis# 05 651 697 001Hücreleri saymak için alet
anti-CD16 / CD32eBioscience# 14-0161Fc reseptör blok akış sitometrisi
anti-F4 / 80-APC-eFluor780 eBioscience# 47-4801Makrofajları lekelemek için antikor
, anti-CD11b-FITCeBioscience# 11-0112Makrofajları lekelemek için antikor
Alternatif

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

M1 Makrofaj PolarizasyonuM2 Makrofaj PolarizasyonuGlikolitik MetabolizmaMitokondriyal Oksidatif MetabolizmaOksijen T ketim H zEkstrasell ler Asidifikasyon H zYedek Solunum KapasitesiGer ek Zamanl Metabolik Analiz

İlgili makaleler