Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Makrofajlar hemen hemen tüm hastalıklarda önemli bir rol oynarken, kendi fenotip düzenleyen moleküler mekanizmalar hala tam olarak sökülmüş değildir. Makrofajlar yüksek heterojenlik gösterir ve mikroçevresinin cevaben farklı fenotipleri ¹ benimsemek. LPS (+ IFNy) klasik M1 veya _{M (LPS)} makrofajlar iltihabı teşvik ve mikrobiyal tehdit ² farklı türlerine karşı konakçıyı korumasına aktive araştırmaktı. Diğer M1 polarizasyon ortaya çıkarmak için uyaran olarak TNF ile tek başına ya da kombinasyon halinde IFNy kullanın. IL-4 ve / veya IL-13, alternatif makrofaj aktivasyonuna neden olur ve bu M2 veya _{M (IL-4) hücreleri} güçlü bir bastırma ve ³ devam eden bağışıklık tepkilerinin kontrol cihazları bulunmaktadır. Polarize makrofajlar LPS ile aktive makrofajlar M1 gelişmiş glikoliz ^4-6 metabolik anahtarı geçiren hücresel metabolizmanın farklı bir yönetmelik görüntüler. Bunun aksine, geliştirilmiş yağ asidi oksidasyon (FAO) ve mitokondriyal oxidative fosforilasyonu (OXPHOS), IL-4 ile uyarılan M2 makrofajlar ^7-9'da sürekli enerji sağlar. Böylece, değişmiş metabolizma bu doğru kutuplaşma ve inflamatuvar düzenlenmesi için bir ön koşul değil, sadece polarize makrofaj altkümelerini bir özelliği de olmasıdır. Önemlisi, glikoliz veya OXPHOS engellenmesi / FAO sırasıyla ^8,10, M1 veya M2 aktivasyonunu bozduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, makrofajlarda belirlenmesi metabolik değişiklikler polarizasyon durumu ve inflamatuar potansiyelinin değerlendirilmesi için bir araç olarak uygulanabilir.

Makrofaj metabolizmasını ölçen tutarlı bir tahlil bu nedenle ilaç, gen yıkmak olmadığını tahmin etmek için kullanılan olabilir veya diğer tedavi makrofaj kutuplaşma ve işlevini etkiler. Bu videoda, bir hücre dışı akı analizör naif, M1 ve M2 makrofajlar biyoenerjetik profillerini tanımlamak için kullanılır.

Bu el yazması ölçümünü sağlayan bir optimize edilmiş protokol detaylarıtüm ilgili glikoliz parametreleri (glikoliz, maksimal glikolizis ve glikolitik rezerv) ve bir tek deneyde mitokondriyal fonksiyon özellikleri (toplam solunum, bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi). Bu deney düzeneği kullanarak, biyoenerjetik hücreleri (transgenik ifadesinin veya farmakolojik tedavi yıkmak gibi geni) kontrol ve 'değiştirilemez' arasında mukayese edilebilir.

1. Kültürleme ve Polarizasyon Kemik İliği-türevli Makrofajlar

1. Gün 0: ilgi 6-10 haftalık farelerden izole edin femur ve tibia kemikleri (bu deneyde C57BL / 6).
2. Kemiklerden kas dokusu çıkarın ve buz gibi soğuk PBS ile dolu bir 9 cm'lik petri tabağına kemikleri yerleştirin.
3. % 70 etanol ile dolu bir 9 cm Petri için kemik aktarın ve yavaşça 30 sn için plaka çalkalayın.
4. Buz gibi soğuk steril PBS ile dolu bir taze 9 cm Petri kabı kemikleri aktarın.
5. Steril makas ile her iki ucunda ve femur tibia kesin.
6. 10 ml'lik bir şırınga ve bir tane 25 G iğne kullanılarak 10 ml buz gibi soğuk PBS ile kemik steril yıkayın. 50 ml'lik bir tüp içinde kemik iliği toplamak.
7. 23 G iğne kullanarak yeni bir 50 ml tüp kemik iliği hücreleri aktarın.
8. 25 G iğne ile bu adımı yineleyin. Not: Bu adımlar hücre kümeleri ve kemik kalıntılarını çıkarmak için gereklidir.
9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
10. Sup atınernatant ve 40 ml hücre kültür ortamında (RPMI-1640 artı 2 mM L-glutamin,% 10 FCS, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve% 15 süzüldü L-929 hücre hücreleri tekrar süspansiyon ( ATCC CCL-1), L-929 hücre koşullu ortam yerine M-CSF (ya da seçenek olarak 10 ng / ml yeniden birleştirici M-CSF ihtiva eden -conditioned ortamı).
    Not: L-929 hücre klimalı ortamda nesil 2013 ¹¹ daha önce bu dergide ayrıntılı edildi
11. Kültür, 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde levha başına 20 ml kültür ortamı içinde iki adet 15 cm Petri kapları (makrofaj bu plastiğin ayrılmaz çünkü hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar kullanmayın) bir fare hücreleri.
12. 20 ml daha büyük hücre kültür ortamı çıkarmadan, 3. günde 10 ml taze kültür ortamı hücre ekleyin.
13. Aksi takdirde 6. günde 20 ml taze kültür ortamı ile her plakanın eski orta değiştirin yapışmayan hücreler de kaldırılır.
14. 8. Gün:
    1. Onlara 5 m kuluçka hücreleri Ayır_{(otoklavlanmış,} H2O içinde 135 mM potasyum klorid ve 15 mM sodyum sitrat), 37 ° C de 10 ml tuzlu su sitrat ve 10 ml PBS ile yıkayın. Hücre sayacını kullanarak günde 8 olgun, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDM) sayın.
    2. Görsel denetim veya flow sitometri ile Olgun oluşumunu (CD11b + F4 / 80 +) BMDM doğrulayın. 100 ul PBS içinde 20 dakika boyunca PBS içinde 1/100, anti-CD16 / CD32 ile Blok 10 ^{5 hücreleri,} oda sıcaklığında anti-CD11b-FITC ile 1/200 artı 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 ile inkübe yıkama ve flow sitometri ile analiz edin.
       Not:. Kültürleme fare kemik iliği kökenli makrofajlar Ying ve ark ¹¹ tarafından daha önce bu dergide detaylı olarak yayınlanmıştır.
15. Tohum 50.000 hücre 100 ul kültür ortamı içinde bir hücre kültürü mikrotablada oyuk başına (optimum hücre sayımları optimize edilmesi gerekir). Arka plan düzeltme kuyuları (A1, A12, H1, H12) hücreleri tohum ve bu kuyulardan sadece orta (hücre) koymayın İpucu:. Bir açı a at pipet tutunyarım en homojen hücre katmanı için kuyuların yan aşağı butik.
16. Hücreler, 1 saat için bir hücre kültürü kaputu oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Bu hücre dağılımı eşit teşvik etmek ve kenar etkilerini azaltacaktır. 37 ° C,% 5 CO _{2 inkübatör} bir mikroskop ve kültür kullanan uyumu izlemek.
17. Üç saat sonra kaplama, 10 ng / ml LPS, veya 20 ng / 24 st için hücreleri uyarmak ml IL-4, sırasıyla, M1 veya M2 makrofajlar üretmek için rekombinant fare. Bir kontrol olarak tedavi edilmemiş saf (M0) makrofajlar ekleyin. IL-6, IL-12 LPS ile indüklenen salgısının ölçülmesiyle doğru M1 ve M2 makrofaj kutuplaşma değerlendirilmesi, TNF (ELISA) ve IL-4 ile uyarılan arginaz-1 aktivitesi ve / veya NMR (CD206) ile MGL (CD301) yüzey ekspresyonu Daha önce ^3,11 açıklandığı gibi (flow sitometri).
    Not: Bu noktada, hücreler (önceden) diğer faktörler ile uyarılabilir ilgi veya makrofajlar farmakolojik bileşiklerle ile tedavi edilen. Yana, ayrı kuyuları arasındaki varyasyon subs olabilirtantial, bu durumda en az 4 ve ideal olarak 6 kuyu kullanılması tavsiye edilir.

Hücre dışı Akı Testinin 2. Hazırlık

1. Bir gün tahlil çalıştırmadan önce sensör kartuşu hidrat:
   1. Bir sonraki yarar plakasına ters sensör kartuşunu yerleştirin.
   2. Kalibrant çözeltisi 200 ul programı bir levhanın her bölmesine doldurun ve kalibrant çözeltisi sensörleri daldırılması programı plakası üzerine sensör kartuşunu indirin.
   3. Kalibrant çözüm düzey olmayan bir CO ₂ 37 ° C inkübatör O / N batmış sensörleri ve yer tutmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun.
2. Analiz aşağıda belirtildiği gibi gününde deney ortamı hazırlayın:
   1. 37 ° C sıcak bir 50 ml XF taban ortamı.
   2. 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek için 500 ul 200 mM L-glutamin ekleyin.
   3. 1 N NaOH ile 7.4'e pH ayarlama ve 0.2 uM filtre ile sterilize ve 37 ° C'de deney ortamını tutun.
3. Yavaşça polarize makrofajlardan hücre kültür ortamı çıkarın ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de saklayın (örneğin ELISA uygun makrofaj kutuplaşma incelemek için). , 100 ul deney ortamı ile hücreleri yıkayın kuyu başına 180 ul tahlil orta eklemek ve hücreler yıkanıp değil mikroskop altında doğrulayın. Deney döngüsünden önce 1 saat boyunca _CO2 olmadan 37 ° C inkübatör hücre kültür plakası yerleştirin.
4. 37 ° C'ye kadar, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, sıcak D kadar 10 x enjeksiyon bileşik karışımları A Hazırlama, 7.4 ve filtre ile sterilize pH ayarlamak.
   1. 10x hücre kültür havuzlarına nihai konsantrasyon, bu karışımlar içinde tüm bileşikleri yapmak ve her hücre tipi için, bu konsantrasyonlar optimize eder.
5. Bağlantı noktaları A, B, C ve D, respe hazırlanan 10x enjeksiyon madde karışımlarının belirtilmedikçe hacim (Tablo 1) ile donatılmış yükleme kılavuzları kullanarak sensör kartuşunu doldurmactively.

Tablo 1. Enjeksiyon karışımlarıdır.

Bir Ekstrasellüler Flux Analyzer kullanarak Polarize M1 ve M2 BMDM 3. Bioenerjetik Karakterizasyonu

1. 2 dakika MIX ve 3 dakika TEDBİR süreleri ve (en azından) 3 mix ve hız ölçümleri tahlil sihirbazı ile bir deney şablonu oluşturma 4 enjeksiyonları her birinden önce (Tablo 1) ve son enjeksiyondan sonra döngüler.
   Not: Bu konsantrasyonlar, kemik iliği türevli makrofajlar ve RAW264.7 makrofaj hücre çizgileri için geçerlidir, ancak her hücre tipi için optimize edilmelidir. FCCP karışımı içinde ekleme piruvat maksimum solunum yakıt için gereklidir.
2. Başlangıç ​​dibe iterek çalıştırmak başlatın ve aygıtın talimatları izleyin. Araç ilk yükhidrate problar ile tridge plaka aparatı ve bir sonraki yük hücresi levhası ile kalibrasyonu izin vermek.
3. Deneyinden sonra dikkatlice analiz ortamı atılır ve satıcı tarafından detaylı olarak tarif edildiği gibi, hücre çoğalması test kiti kullanılarak ileride hücre normalizasyonu için -20 ° C'de analiz hücre kültürü mikroplak saklayın.
   1. Kısaca, damıtılmış su içinde B bileşeni 20 kat seyreltilmesi ile 1x hücre lisis tamponu hazırlamak ve bileşik 1x hücre lisis tamponu içinde bir 400-kat seyreltilir. , Oyuk başına 200 ul ekle oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmek ve ~ 180 nm eksitasyon ve 520 nm emisyon ~ maxima ile floresan ölçer.
      Not: yapışmayan hücreleri ile çalışırken veya kötü yapışma bir sorun, bu protokol, tüm deney ortamını atarak gerektirmediğinden doğrudan hücre çoğalma kiti alternatif olarak kullanılabilir ise. Ancak, bu doğrudan protokol bu laboratuarda kullanılan protokole göre biraz daha az duyarlıdır.
4. Floresan ölçümünden sonra, normalleştirmekHer bir hücre sayısı ve tüm naif makrofaj kuyuların ortalama hücre sayısı 1 ile ayarlanmış olan bir oranı.
   (Örneğin, bir BCA deneyi kullanılarak) protein miktarının hücreleri sayısında normalize edilmesi için bir yol olarak kullanılabilir: edin. Bununla birlikte, elimizdeki bu deney hücre çoğalması test kiti ile karşılaştırıldığında daha az duyarlı idi.

Hücre-dışı akı tahlili ve hücre ölçümü bittikten sonra, veri hücre sayımı için normalize edildi ve analiz edilebilir. Şekil 1A ve Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, tipik olarak bu ECAR ve OCR araziler verecektir.

Glikoz (A) 'lerin enjeksiyonundan sonra, ECAR artış glikoliz hızını temsil eder. Oligomycin (B) ile ATP sentaz inhibisyonu sonra ECAR ek artış glikolitik rezerv ve kapasite (Şekil 1A) hakkında bilgi sağlar. OCR değerlerini analiz ederken, enjeksiyon (B) oligomycin mitokondriyal ATP sentezi için kullanılan oksijen tüketiminin hesaplanmasını sağlar. FCCP (C) mitokondriyal solunum koparan ve ilgili OCR ölçümleri maksimal ve yedek solunum kapasitesi hakkında veri elde. Son olarak, rotenone enjeksiyonu (Rot) ve antimycin A (AA) mitokondriyal kompleks I engellemek ve III ve artık OCR olmayan mitokondriyal oksijen eksilerini temsilumption (Şekil 1B).

Şekil 1: XF Ekstrasellüler akı deneyinde elde edilen Metabolik parametreler. (A) hücresel glikoliz ardından parametreleri (mph / dk) ECAR değerlerinden hesaplanır: glikoliz, maksimum glikolitik kapasite ve glikolitik rezerv. Bazal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi: (pmol / dk) (B) OCR ölçümleri mitokondriyal fonksiyon sonraki temel parametrelerini hesaplamak için kullanılır. Gluc = glükoz; OM = oligomycin A; FCCP = karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon; AA = antimycin A; Rot = Rotenone bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

Çalıştırdıktan sonra, ECAR ve OCR ölçümleri 1 tilaşağıdaki gibi ECAR ölçümlerinden her bir kuyunun l 15 Excel'e ihraç edilebilir ve aşağıdaki glikolitik parametreler hesaplanabilir:

Sigara glikolitik asitlenme = ort. ECAR (1,2,3)

Glikoliz = ort. ECAR (4,5,6) - ort. ECAR (1,2,3)

Maksimum glikolitik kapasite = ort. ECAR (7,8,9) - ort. ECAR (1,2,3)

Glikolitik rezerv avg =. ECAR (7,8,9) - ort. ECAR (4,5,6)

OCR oranlarından sonraki metabolik özellikleri tespit edilebilir:

Sigara mitokondriyal solunum = ort. OCR (13,14,15)

Bazal solunum = ort. OCR (4,5,6) - ort. OCR (13,14,15)

ATP üretimi = ort. OCR (4,5,6) - ort. OCR (7,8,9)

Proton kaçak =ort. OCR (7,8,9) - ort. OCR (13,14,15)

Maksimum solunum = ort. OCR (10,11,12) - ort. OCR (13,14,15)

Yedek solunum kapasitesi (SRC) = ort. OCR (10,11,12) - ort. OCR (4,5,6)

Şekil 2:. Naif metabolik özellikleri (M0), LPS (M + -1) ve IL-4 (M2) polarize makrofajlar 8 ayrı kuyuların ortalama (SEM) her bir ölçüm, ortalama ve standart hata için sunulmuştur. (A) Hücre dışı asitlenme oranları (MPH / dak ECAR) ve (B) oksijen tüketimi oranları (OCR, pmol / dk) farklı şekilde polarize (M1 ve M2) ve naif makrofajlar (M0) için ölçülür. (CyQUANT ile ölçülen) ve saf makrofajlar ortalama hücre sayısı, 1. ayarlandı Tüm ölçümler hücre sayımı için normalize edildijection A = glükoz; B = oligomycin; C = FCCP; D antimycin A + rotenone =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, LPS ile makrofaj aktivasyonu glikolitik metabolizma artışa yol açar. Şekil 2B'de oksijen tüketimi oranlarına (OCR) bakarken, LPS ve IL-4 ile tedavi edilmiş makrofajlar arasındaki farklar çok daha belirgindir. Maksimal oksidatif metabolizması yüksek M (LPS) ile bastırılır olsa da, bu, IL-4 M2 makrofajlar, bazal ve özellikle de maksimum solunum indükler. Bir artmış glikolitik M (LPS) makrofajlar oldukça benzersiz ve M (IFNy) makrofajlar glikolizi geliştirmek göstermek yok çünkü ille M1 makrofajların karakteristik olmadığına dikkat edilmelidir.

Genel olarak, bu, hücre dışı akı analizi tha göstermektedirLPS ile aktive makrofajlar görüntüleme glikolitik metabolizma geliştirilmiş herhangi bir fazlalık solunum kapasiteye sahip değildir, oysa t, M2 makrofajlar gelişmiş oksidatif metabolizması ile karakterize edilir ve özellikle de yüksek bir yedek solunum kapasiteli (SRC) IL-4 ile uyarılan.

Bu maddeye ücretsiz erişim Seahorse Bioscience tarafından desteklenmektedir.