Yöntem makalesi

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller

19.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53429

⸱

21 Kasım 2015

 ,  ,  , 
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Bu makalede

Özet

Bağırsak epitel kök hücreler (ISCs) Paneth hücreleri ile iç içe. Bu hücreler ISCs destekleyen ve antibakteriyel koruma sağlamak ISC, soyunu ayırt edilirler. İşte biz Paneth hücrelerinin bağırsak epithelia sürdürmek çok önemli bir rol oynadığını kurmak için transgenik fare koşullu modellerini nasıl kullandıklarını göstermektedir.

Özet

7 gün - memeli bağırsak epitel yüzeyi her 3 yenileyen dinamik bir dokudur. Hızla Lgr5 geninin kendi ifadesi ile karakterize bağırsak kök hücreleri (ISCs) bisiklet nüfusu bu yenilenme sürecini belirlenen anlama. Bunlar yaralanma durumunda bunların yerine yeteneğine Bmi-1 ifadesi ile işaretlenmiş bir sakin kök hücre popülasyonu, tarafından desteklenmektedir. Bu nüfus arasındaki etkileşimi araştıran hastalığı ve kanser rollerini anlamak için çok önemlidir. ISCs bağırsak yüzeyindeki crypts içinde var, bu nişler epitel Yenileyici de ISC destekliyoruz. Bir önceki Lgr5 ISC'nin 'stemness' yakından komşu Paneth hücreleri varlığına bağlı olduğunu göstermiştir edildiği gibi, aktif ve pasif ISCs arasındaki etkileşim olasılığı, kovan içinde diğer farklılaşmış hücreleri içerir. Koşullu CRE-lox Fareyi kullanarakmodeller Paneth hücreleri varlığında veya yokluğunda aktif ISCs çoğunluğu silme etkisi test edilmiştir. Burada bağırsak karakterize ve taahhüt teknikler ve analiz Paneth hücrelerinin önemli hakaret aşağıdaki kurtarma yardım ISC niş içinde çok önemli bir rol oynadığını göstermektedir açıklar.

Giriş

Memeli bağırsak lümen yüzeyi projeksiyonları gibi kriptalarının ve parmak tekrar birimlerinden özellikleri, lümen içine çıkıntı villus olarak adlandırılan. 4 gün 1 - Bu yüzey, yaklaşık her 3 tam kendini yenileme uğrar epitel sürekli bir tabakadır. Bu dinamik Doku hızla kök hücreleri bisiklet nüfusu tarafından desteklenmektedir (ISCs, aynı zamanda kript baz kolon hücreleri olarak da bilinir) ilk olarak Lgr5 geni 2,3 kendi ifadesi ile tanımlandı. Bu hücreler Lieberkühn kript altındaki özel bir niş bulunmaktadır. Başlangıçta, ISCs hızla bisiklet vardı keşif kök hücre doğada sakin olduğunu hakim fikri ile uyumsuz oldu. O durgun etiket nüfus crypt tabanına göre 4 pozisyonunda hücreleri, istinat öne sürülmüştür Lgr5 + ISC tanımlanmasına Önceki, ISCs 1 idi. Son zamanlarda yapılan araştırmalar hşimdi öncelikle kader komşuları 4,5 düzenlenir her crypt ekipotent bisiklet ISCs bir havuz olduğunu göstererek bu gözlemleri barıştırdı. Halinde bunlar, bu normalde salgı soyu adadık ancak ISC nüfus 6 hasar görmüşse ISCs dönebilirsiniz durgun hücreleri tarafından değiştirilebilir kaybolur.

ISC komşuları ISCs veya kızları hücreler olabilir ya. ISCs çarpma ve hangi hatlar bağırsak lümen 1 epitel tabaka oluşturan özelleşmiş hücre tiplerine ayırt naif kızı hücreleri üretirler. Goblet, enteroendokrin, enterositler, püskül ve M hücreleri çeşitli emici ve düzenleyici işlevleri sağlamak lümen yüzeyine yukarı göç, ancak, Paneth hücreleri ISCs ile iç içe bulunmamakta crypt dibinde kalır. Son yıllarda ortaya konmuştur, bu naif kız çocuğu bir kısmınınbir salgı soy için mukadder er hücreleri yaralanma 6,7 üzerine bir ISC geri döndürme yeteneğine Lgr5 lo hücrelerini koruyarak hareketsiz etiket vardır.

Nedeniyle kript rejenerasyon önemi bir öncelik ISCs ve komşuları, özellikle Paneth hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamaya yerleştirildi. Paneth hücrelerinin ISCs 8 destekleyen niş önemli bir rol oynamaktadır. Bakterisit ürünlerinin yanı sıra Paneth hücrelerinin ISC yenileme veya farklılaşmasını düzenleyen yolları aktive sinyal molekülleri üretirler. Önceki çalışmalar onların kızları Paneth hücreleri 8 tarafından sağlanan temel niş sinyalleri için rekabet edebilecek ne zaman Lgr5 + ISCs sadece var olduğunu gösterdi. Bu çalışmalar, normal Lgr5 + ISCs üzerinde değil, onlar zarar ve bir Lgr5 lo nüfus ikmal gerektiren bir durumda Paneth hücrelerinin rolü incelenmiştir.

Biz transgenik fare modelleri 9,10 kullanılarak hücrelerin ve / veya genlerin işlevsel rolünü incelemek bağırsak biyoloji ve model hastalığını anlamak için. Sıkça bu modeller şartlı gen (ler) 9,10 değiştirmek için CRE-lox teknolojisini kullanmaktadır. Cre rekombinaz bakteriyofaj P1 izole integraz ailesinin bir site özgü rekombinaz olduğunu (rekombinasyon Nedenleri). Cre tanımlanan 34 bp arasındaki alana özgü rekombinasyon katalize ' Lox P 'siteleri (geçit P1 odağı χ). Fareler genetik Cre rekombinazın ifadesi üzerine eksize ilgi alanları kuşatan LoxP siteleri içerecek şekilde tasarlanmıştır. Bir hücre ya da gelişimsel belirli bir promotere Cre geni ekspresyonunu bağlama işleminin tahrip edici bir mekansal biçimde 9,10 yapılabilmesi için, bu oluşum safhasındaki ölümcül mutasyonlar aşılmasında özellikle yararlıdır sağlar. Ayrıca, bir alıcı yolu Cre ifade bağlayanBu yapay aktive edilebilir, zamansal değişiklikler izin verir.

Bu teknolojiyi kullanarak, biz bağırsak epitel CatnB genini 11 inaktive. β-katenin, CatnB gen ürünü, ISC homeostazı tabi doğal Wnt sinyal yolunun bir anahtar düzenleyicisidir. Bu stratejiyi kullanarak iki önceki çalışmalarda çelişkili sonuçlar 12,13 üretti. AEVR ve ark., 12 tarafından yapılan çalışmada, kök hücre ve bağırsak homeostazisinin kaybı gösterdi. İrlanda ve ark. Oysa 14 çalışma hücre canlılığında bir azalma, aşağıdaki kript-villus ekseni CatnB eksprese vahşi tip hücrelerden yeniden doldurulur olduğunu bildirdi. Bu çalışmalarda önemli fark bağırsak epitel Cre ifade etmek için kullanılan promotör oldu. AEVR ve diğ., Çalışma t tatbik edilmesiyle aktive edilebilir östrojen reseptörüne bağlanmış villin gen promotörü kullanılıramoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. Buna karşılık Ireland ve arkadaşlarının., Ksenobiyotik β-naphthoflavone (Ah-CRE) yanıt olarak Cre sentezlenmesini tahrik etmek için, sıçan sitokrom P450A1 (CYP1A1) geni promoter dizisi kullanılmıştır. Bu farklı sistemlere dair özellikler bu farklı gözlemler için hesap, iki hipotez oluşturulur. CatnB daha verimli ve böylece alt repopulation seviyelerine ISCs sayısını azaltarak, Ah-CRE kıyasla vil-Cre-ER T2 sistemi kullanılarak ISC silinir ilk. Alternatif olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda CatnB silme diferansiyel kaynaklanıyordu. Vil-Cre-ER T2 sistemi hedefleri Ah-CRE sistemi ise crypt ve villuslarının tüm epitel hücreleri yalnızca ISC niş ve crypt olmayan Paneth hücreleri hedefliyor. Bu sistemler Behav incelenmesi için ideal araçlar teminISCs ve ior ve Paneth hücreleri ile etkileşimi. İşte biz Paneth hücrelerinin yaralanma 17 bağırsak cevabı aracılık önemli bir rol oynadığını belirlemek için bu sistemlerin nasıl kullandığını dayalı birçok detaylı protokoller sunuyoruz.

Protokol

Kullanılan tüm malzeme ile ilgili bilgiler Tablo 1'de verilmiştir. Tüm hayvan deneyleri İngiltere'de Home Office projesi lisansı yetkisi altında gerçekleştirildi.

1. CatnB Silme Ah-CRE ve vil-Cre-ER T2 Sistemleri kullanılarak

  1. Ah-CRE + CatnB + / +, Ah-CRE + CatnB flox / flox, vil-Cre-ER T2 CatnB + / + ve vil-Cre-ER T2 CatnB flox 14 haftalık kohortlarını - 10 oluşturmak için fare suşları Çapraz / flox. Bir β gal leke aracılığıyla rekombinasyon görsel analiz için, kohortlar Rosa26R-lacZ muhabiri 17 içermelidir. Modifiye genlerin ve indüksiyon maddelerin kullanımı varlığı için kontrol ediniz kohort gerekli kohort büyüklüğü güç analizi kullanılarak tahmin edilmelidir.
  2. Β hazırlamak Ah-CRE transgenini teşvik etmek için;, Ya da 10 mg / ml 'lik bir çalışma çözeltisi elde mısır yağı içinde (TAM) tamoksifen vil-Cre-ER T2 transgen için -Naphthoflavone (BNF). NOT: acentalar, uygun kişisel korunma kullanarak davlumbaz dışarı tartılmalıdır.
  3. Bir su banyosu içinde BNF 99.9 ° C veya TAM boyunca 80 ° C de bir amber şişe ısı çözeltiler (BNF ışığa duyarlı).
  4. BNF, 100 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtılmış bir karıştırıcı transfer veya TAM 80 ° C ve 10 dakika için karıştırın.
  5. Çözülene kadar BNF 1,3-1,4 tekrarlayın için (> 1 saat sürebilir).
  6. Küçük sarı şişelerine (~ 5 mL) içine kısım daha sonra -20 ° C'de dondurun. Şişeler 3 donma / çözülme döngüsünden sonra atılmalıdır. Önceki çözülme maddeler kullanmayın ve çözümün dışına düşmüş, uygun sıcaklığa hazırlayabilirsiniz. Enjeksiyondan önce <37 ° C'ye kadar soğumasına izin verin.
  7. Bir 25 g fare approp 0.2 ml alır, örneğin 80 mg / kg bir dozda olan fareler karın içinden (İP) enjekteyaklaşımlarına yön indüksiyon ajanı. Ah-CRE için 4 gün boyunca günde bir enjeksiyon vermek vil-Cre-ER T2, 24 saat süre içinde üç enjeksiyon teslim.

Muhabir Görselleştirme ve İmmünohistokimya için Bağırsak 2. diseksiyonu (İHK)

  1. Etik onayı doğrultusunda önceden anestezi olmadan servikal dislokasyon kullanarak fare Euthanize. Bir yatar pozisyonda fare yerleştirin ve% 70 EtOH kullanılarak kürk ıslak, bir makas kullanarak orta hat boyunca uzunlamasına içi periton boşluğuna açılır.
  2. Bir forseps ile mide Güvenli ve yemek borusu bağlantı sever. Hafifçe karnına çekerek ekinde küçük bağırsağa kadar kaldırın. Hafifçe ekte çekerek anüs kalın bağırsak yukarı kaldırın.
  3. Bağırsak izole edildikten sonra mide ve eki çıkarın. Künt uçlu pipet ile bir şırınga kullanarak 1x PBS ile yıkayın bağırsak. NOT: Her bağırsak i olmalıdırmmediately aşağıda anlatılan alt akış uygulamalardan biri için işlendi.

Bağırsak 3. Formol Fixation

  1. Orta ve distal 3 eşit boyutlu bölümler ve etiket proksimal içine kızarmış bağırsak kesin. 1 cm'lik parçalar halinde her bölüm kesin. Cerrahi bant 2 cm x 2 cm küçük bir şerit atın. Bir piramit oluşumunda cerrahi bant ortasında üç beş 1 cm parçaları yerleştirin.
  2. Kapatın ve bir "günlük kazık" etkisi vermek için, uzunlamasına parçalar etrafında bant mühür. En az 10x, doku hacmine sabitleyici hacmi nötral tamponlu formalin sabitleştirici büyük bir fazlalık ihtiva eden bir düz dipli bir kap içinde doku yerleştirin. , Sabitleme için bir tüp içinde dokusunun aşırı miktarda koymaktan kaçının birden kaplara bölün: NOT.
  3. Önceden gömme ve kesit 24 saat - en az 18 boyunca 4 ° C 'de yer örnekleri. Nükleer β-katenin kaybını önlemek için, 24 saat ötesine düzeltmek yok.En az 10x doku hacmi,% 70 EtOH çok fazla miktarda ihtiva eden bir düz dipli bir kaba tespit transferi doku sonra.

Bağırsak 4. metakarn Fixation

  1. 300 ml MeOH, 150 ml kloroform ve 75 mi buzlu asetik asit birleştirerek metakarn fiksatif hazırlanması diseksiyonlu önce (4: 2: 1). Proksimal, orta ve distal 3 eşit büyüklükte bölüme kızarmış bağırsak kesin.
  2. Filtre kağıdı (15 cm x15 cm) ve springbow makas 'yüzüne tr' bu kadar açık kullanarak bir parça yan bağırsak tarafında her parça yerleştirin. Oda sıcaklığında 24 saat - 3 metakarn içeren bir cam tabak içine bağırsak ve filtre kağıdı yerleştirin. Tespit edildikten sonra bir forseps kullanarak bir bağırsak bölümünün sonunu pick up.
  3. Bir "swiss roll" oluştururlar ve hafifçe forseps açılması ve içinden bir 25 G iğne koyarak rulo sabitlemek için forseps etrafında bağırsak sarın. A la içeren bir düz dipli bir kap içinde doku yerleştirinnötr tamponlu formalin fiksatif rge fazlalığı, işleme devam etmeden önce, en az 1 saat boyunca doku ve mağaza hacmine sabitleyici en az 10x hacmi.

5. Tüm Dağı LacZ Görselleştirme (El Marjou ark Modifiye. 18)

  1. 10 mineral yağ ile erimiş ralwax birleştirerek balmumu tabak hazırlayın: 1. 15 cm petri içine dökün ve soğumaya bırakın. Tablo 1 gereğince X-gal Fiksatif hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
  2. Bütün bağırsak çıkarın ve 25 ml buz gibi soğuk X-gal fiksatif ile yıkanarak bölüm 2. Fix bağırsak başı olarak, buz gibi soğuk 1x PBS ile ile yıkayın.
  3. 5 eşit parçaya (plaka başına 5 maksimum) - makas kullanılarak 3 içine bağırsak kesti. Balmumu plakası üzerine her bölüm yerleştirin ve bölüm biraz mezenterik hattı en üstte ile gerilir böylece her ucu aşağı pin; herhangi bir aşırı mezenterin kırpın. Bir springbow makas kullanarak uzunlamasına bağırsak kesip yol boyunca dışarı pin.60;
  4. Bölümler kapak ve 4 ° C'de en az 1 saat boyunca bırakmak için X-gal sabitleyici ile plaka boyayın. 25 ml'lik bir pipet kullanarak, X-gal Fiksatif çıkarın ve 1 x PBS'de 30 ml ile bir kez yıkanır. Ideal olarak sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika, - 30 DTT demucifying çözeltisi 30 ml Kapak bölümleri.
  5. 25 ml'lik bir pipet kullanılarak demucifiying çözüm çıkarın ve 1 x PBS'de 30 ml plaka sel. Bir pastör pipet kullanarak mukus kaldırmak için plaka 1x PBS ile bağırsak bölümleri yıkayın.
  6. X-gal leke 30 ml ile 25 ml pipet ve sel ile 1x PBS çıkarın. Sallanan bir platform üzerinde hafif bir çalkalama ile karanlıkta, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
  7. Arka plan rengi hala beyazsa bölümleri, mavi / yeşil leke geliştirdik gecede inkübasyon kontrolünden sonra, taze boyama çözeltisi ilave edildi ve boyama geliştirir kadar izlenebilir. NOT: Kesitler daha sonra lekeli sonra başka boyama teşebbüs edilebilir.
  8. X-gal leke çıkarmak1x PBS, 30 ml ile 25 ml bir pipet ve sel plakası kullanılarak ve yavaşça sallanarak 3 dakika boyunca bırakın. Pimleri çıkarın ve forseps ile, bir bağırsak bölümünün sonunu pick up. Bir "Swiss roll" oluştururlar hafifçe forseps açılması ve içinden bir 25 G iğne koyarak rulo sabitlemek için forseps etrafında bağırsak sarın.
  9. En az 10x doku hacmine sabitleyici hacmi nötral tamponlu formalin sabitleştirici büyük bir fazlalık ihtiva eden bir geniş ağızlı düz dipli bir kap içinde doku yerleştirin. Önceden gömme ve kesit için en az 24 saat süre ile 4 ° C 'de yer örnekleri.

Bağırsak adlı Crypts 6. Ekstraksiyon

  1. Bölüm 2. temiz bir diseksiyon yüzeyinde bağırsak başına bir forseps ve makas takılı yağ / mezenterin kaldırmak kullanma gibi, ince bağırsağın ilk 20 cm izole edin. Bir springbow makas uzunlamasına bağırsak açmak kullanma.
  2. F, bir mikroskop kapak slayt kullanmairmly villus ve mukus kaldırmak için bağırsak lümen kazıyın. Bir makas kullanılarak penisilin (100 U / ml) ve streptomisin (100 U / ml) ile desteklenmiş ~ 5 mm parçalar halinde kesilir ve bağırsak 25 mi 1 x HBSS ile 50 ml'lik bir tüp içine aktarılır.
  3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 70 mikron hücre süzgecinden geçirerek örnekleri antibiyotik içeren ortamları çıkarın.
  4. 10 ml 1x HBSS içeren taze bir 50 ml tüp içine bağırsak bölümleri yerleştirin ve kapağını kapatın.
  5. Yavaşça iki kez ters ve 70 mikron hücre süzgecinden geçerek 1x HBSS çıkarın. Dahası 6.4 ve 6.5 üç defa tekrarlayarak bağırsak parçaları yıkayın ve son kısım nispeten açık olduğundan emin olun.
  6. EDTA (8 mM) / 1x HBSS 10 ml ihtiva eden bir taze 50 ml tüp doku aktarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Kuvvetlice (20 - 30x) sallayın veya girdap, EDTA (8 mM) / 1x HBSS içeren taze 50 ml tüp 70 mikron hücre süzgeç ve transfer doku parçaları geçer. NOT:Atılması veya villus epitel analizi gerekiyorsa muhafaza edilebilir ya geçen akış.
  7. , 30 dakika boyunca buz üzerinde doku parçaları inkübe kuvvetlice örnek sallamak (20 - 30x) ya da girdap. Bir 70μm hücre süzgecinden örnekleri geçirin ve bu crypts içerdiğinden akışını aracılığıyla saklayın.
  8. 1x HBSS 10 ml içeren yeni bir 50 ml'lik tüpe doku parçaları aktarın. Kuvvetlice (20 - 30x) sallayın veya girdap, 70 mikron hücre süzgecinden geçerek akışını korumak. Bağırsak parçalardan kriptalarının maksimum iyileşme sağlamak için bir kez daha tekrarlayın. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj fraksiyonları akışını birleştirir. Süpernatantı dökün ve kript pelet saklayın. Not: peletler kültürlemek için hemen kullanıldı (varsa) veya önce, standart DNA / RNA / ekstraksiyon prosedürleri -80 ° C'de saklanabilir.

7. Standart immünohistokimyasal Görselleştirme

  1. 5 u Cutpoli-L-lisin (PLL) slaytlar üzerine parafine gömülü doku kesitleri m. Not: B-katenin antikoru ile boyanma için standart bir protokol, aşağıda verilmiştir, diğer antikorlar için parametreleri Tablo 2'de verilmektedir.
  2. Taze ksilen içeren slayt banyolarında 2x 3 dk yıkar De-mum. Taze içeren kayıcı banyoları içerisinde 3 dakika boyunca slaytlar geçirilmesiyle rehidrate: 1x PBS içine% 100 EtOH (2x),% 95 EtOH ve 70% EtOH ve son olarak.
  3. 20 dakika antijenleri almak için sitrat tamponu (pH 6) ve ısı 99,9 ° C ihtiva eden bir slayt banyosuna yerleştirin kayar. Slaytlar soğumaya bırakıldı ve daha sonra 5 dakika boyunca 1xTBS / T ihtiva eden bir slayt banyosunda 3x 5 dakika yıkama izin verin. Hemen bir PAP kalemle doku etrafında çizin, son yıkama slaytları çıkarın ve (damıtılmış H 2 O), ticari bir peroksidaz blok veya% 1.5 H 2 O 2 ile bölümü kapsamaktadır.
  4. Oda sıcaklığında (RT) 20 dakika süreyle inkübe edilir, sonra 5 dakika için taze 1x TBS / T ihtiva eden kayıcı banyolarında 3 kez yıkayın. Yıkama işleminden sonra(NRS) oda sıcaklığında 30 dakika için birincil antikor spesifik olmayan hidrofobik bağlanmasını bloke için / 1xTBS / T,% 5 normal tavşan serumu içinde, bir pipet kullanılarak, kapak bölümleri ing.
    1. % 5 NRS 200: 1 oranında sulandırılmış B-katenin primer antikor bir Pasteur pipeti ve kapak bölümü ile NRS bloğunu çıkarın. Yıkama / T taze 1xTBS içeren slayt banyoları 3x 5 dakika boyunca kayar. Not - Diğer antikorlar seyreltme ve özgüllük için optimizasyon gerektirir. Bir antikorun özgünlüğünü sağlamak için, uygun olan herhangi bir antikoru ve izotip kontrol lekeleri yapılmalıdır. Bir izotip kontrolü konakçı türünün ve birincil antikor izotipine göre ayarlanmaktadır.
  5. Ya da ticari bir HRP tespit kiti ile veya uygun bir floresan etiketli sekonder antikor (Tablo 2) ile görselleştirme. Not: - 15 sn genellikle yeterlidir gelişme uzunluğu 10 β-katenin için, her bir antikor için farklıdır. Bir antikor ilk est için gelişimini optimize etmek içindaha sonra, bir pozitif kontrol slayt kullanılarak pozitif hücrelerin görselleştirmek ve gereken zaman uzunluğu, sonraki tüm slaytlara bu geçerli ablish.
  6. Yıkama taze TBS / T içeren slayt banyoları 3x 5 dakika boyunca kayar. ~ 45 saniye boyunca bir slayt banyosu içeren haematoxylin daldırarak slaytlar Counterstain (floresan ikincil antikorlar etiketli kullanarak eğer gerekli değildir). Temiz bir slayt banyosu içine slaytlar koyun ve tamamen yıkanmış değil haematoxylin sağlanması ~ 1 dakika süreyle akan musluk suyu ile durulayın.
  7. Alkoller artan konsantrasyonları içeren slayt banyoları geçerek slaytlar dehydrate; 1x 70% EtOH 30 saniye,% 95 EtOH içinde 1x 30 sn,% 100 EtOH içinde 2x 30 sn yıkama, ksilen içinde 2 x 2 dk.
  8. Dağı ticari bir montaj medya kullanarak bir lamel altında kayar. NOT: floresan etiketli antikor kullanılarak Eğer çekirdeğini etiketlemek için DAPI içeren bir medya ile monte edin.

Belirli Intestina 8. histolojik Kimlikl Epitel Hücreleri

  1. Enterositler
    1. Tablo 2'de anlatılan villin antikor ve koşullara bölüm 7 kullanarak bölümleri hazırlayın.
  2. Entero-endokrin hücreleri (Grimelius 18,19 leke).
    1. Adımlar 7.1-7.2 izleyerek bölümleri hazırlayın. Yıkama 3 dakika boyunca ultra saf su içeren bir slayt banyosunda slaytlar. Isıtılmış gümüş çözeltisi (Tablo 1) ihtiva eden bir sürgü banyosuna slaytlar aktarın ve 3 saat süre ile 60 ° C'de inkübe edin.
    2. 3 dakika boyunca 45 ° C'de önceden ısıtılmış taze hazırlanmış düşürücü çözeltisi içeren bir slayt banyosuna (Tablo 2), gümüş solüsyonu ve bir yerden slaytlar çıkarın. Slaytları çıkarın ve 3 dakika taze ultra saf su içeren bir slayt banyosu içine yerleştirin. Takip bölümünden 7 7,6-7,8 adımları.
  3. Goblet hücreleri (Alcian Mavi leke).
    1. Alcian Bl içeren bir slayt banyosuna .. aşağıdaki adımlarla 7,1-7,2 tarafından Transferi slaytlar bölümleri hazırlayınoda sıcaklığında 5 dakika boyunca vi pH 2.5. 5 dakika - 3 çalışan bir musluğun altında bir pipet ve yer slayt banyosu ile Alsiyan mavi leke çıkarın. Adımlar 7.6-7.8 izleyin. Not: Alsiyan mavisi çözeltisi daha sonraki kullanım için muhafaza edilebilir.
  4. ISCs.
    1. ISCs bölüm 9 izleyin tespit etmek.
  5. Paneth hücreleri.
    1. Tablo 2'de tarif edilen lizozim antikor ve koşullar kullanılarak bölüm 7 aşağıdaki bölümleri hazırlayın.

Murin Bağırsak 19-21 ile in situ RNA Algılama 9.

  1. PLL slaytlar üzerine formalin sabit bağırsak (Bölüm 3) 5 mikron bölümleri yerleştirin. Olfm4 ifadesini 21 algılamak için bir doğrusallaştırılmış digoksigenin etiketli RNA probu hazırlayın. Dewax ve bölüm 7 Not başına bölümler rehidrate: Bu protokol, RNA probu bozulmasını önlemek için bir RNAse ortamda yapılmalıdır.
  2. T etrafında çizinBir PAP kalem ile sorunu reaktifleri en aza indirmek için. 30 dakika boyunca (damıtılmış H 2 O) 6% H2O 2 bir slayt banyosunda bölümleri inkübe edin. 3 dk ve ardından taze 1x PBS ile bir slayt banyosu içinde iki kez yıkayın. Buz üzerinde 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid ile Bir pipet kapak bölümünü kullanarak, 1x PBS atın ve.
  3. 3 dk ve ardından taze 1x PBS ile bir slayt banyosu içinde iki kez yıkayın. 3 dk ve ardından taze 1x PBS ile bir slayt banyosu içinde 5 dakika Wash ile Proteinaz K çözeltisi ile pipet kapak bölümleri kullanılması. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle% 4 paraformaldehid kapsayan bir pipet sonrası düzeltme bölümleri kullanma.
  4. DEPC bir slayt banyosunda yıkayın 2 dakika süreyle H 2 0 tedavi. Çalkalama ile 10 dakika boyunca asetik anhidrit çözeltisi bir pipet kapak bölümleri kullanılması. 1x tuzlu / 3 dakika ardından taze 1x PBS / 3 dakika bir slayt banyosu, içinde yıkayın. Alkoller artan konsantrasyonları içeren banyoları ile slaytlar geçirin; 1x 30 sn 70% EtOH, 1 x 30 sn% 95 EtOH, taze,% 100 2x 30 sn yıkama EtOH2x 2 taze ksilen dk ve kurumaya bırakın.
  5. Hibridizasyon tamponu içinde 100 ve 3 dakika için 80 ° ısıtılarak denatüre sonda: Olfm4 prob 1 seyreltin. Her bölüme sonda 100 ul uygulayın ve slayt dehidratasyonu önlemek için parafilm ile kaplayın. 65 ° C'de, karanlık ve nemli bir odada gece boyunca inkübe edin.
  6. 15 dakika boyunca 65 ° C'de 5 x SSC ile bir slayt banyosu içinde yıkayın. 65 ° C'de 30 dakika boyunca taze /% 50 formamid ile iki kez bir slayt banyosu içinde 5 x SSC /% 1 SDS bölümleri yıkayın. 10 dakika, 65 ˚C ilk ve oda sıcaklığında ikinci taze PBT slayt banyosunda iki kez bölümleri yıkayın. PBT 37 ° C'de 45 dakika boyunca 25 ug RNAse ihtiva eden bir pipet kapak bölümleri kullanılması. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBT slayt banyosunda bölümleri yıkayın.
  7. 65 ° C'de 30 dakika boyunca taze /% 50 formamid ile iki kez bir slayt banyosu içinde 5 x SSC bölümleri yıkayın. Engellemek için, karanlık, moi PBT ve mağaza% 10 koyun serumu ile bir pipet kullanarak kapak bölümleri3 saat - 2 için oda sıcaklığında st odası.
  8. 5 mg / ml fare bağırsak tozu içeren PBT içinde% 10 koyun serumu ile 500: 1 anti-digoksigenin antikor, alkalik fosfataz konjuge seyreltilmesi ile antikor hazırlayın. Sallanan bir platform üzerinde karanlıkta 4 ° C'de 3 saat süreyle inkübe edilir. Aşırı bağırsak tozu kaldırmak ve süpernatana PBT% 1 koyun serumunun 3x hacimlerini eklemek için aşağı doğru döndürün.
  9. Bir pipet slaytlar blok çıkarın ve her bir bölümdeki antikor çözeltisi 100 ul, parafilm ile kapatın ve gece boyunca 4 ° C de karanlık bir nem odasında inkübe edilir. 5 dakika boyunca taze PBT slayt banyosunda 3 × bölümleri yıkayın. Bölümleri 5 dakika boyunca taze NTMT tamponu ile bir slayt banyosunda 3 × yıkayın engellemek için.
  10. Yeterince güçlü bir renk gelişene kadar 72 saat - bir pipet BM mor her bölümü kapsayacak ve 24 RT'de karanlıkta inkübe kullanarak, görselleştirmek için. PBT kez slayt banyosunda bölümleri yıkayın ve 1 dakika boyunca eosin daldırarak counterstain. Remo5 dakika - 3 için akar su altında bir slayt banyosunda yıkama bölümleri tarafından aşırı eozin ettik. Ksilen slaytlar daldırın ve kurumaya bırakın. Ticari medyayı kullanarak bir lamel altında monte edin.

Bağırsak Epiteli 10. histolojik Karakterizasyonu

  1. PLL slaytlar üzerine sabit doku (bölüm 3 ve 4) 5 mikron bölümleri yerleştirin. ≥25 rastgele bütün (veya ≥50 yarısı), aşağıdaki parametrelerin her biri için, her kohort ≥4 farelerden kriptler analiz edin. NOT: tutarlılık (sadece proksimal ucunu kullanın) her bağırsağın aynı yerden crypts analiz korumak için.
  2. Standart H & E boyanan kesitler hücresel parametreleri (aksi belirtilmedikçe): Crypt sayı, yükseklik, apoptoz ve mitoz.
    1. Crypt sayısı.
      1. El bazal tabakada ile temas kriptalarının sayısını saymak için düşük güç büyütme (örneğin 4X veya 10X) kullanın. Kont ≥10 enine proksimal bağırsak mezhepEn az 4 farelerin iyonları.
    2. Crypt yüksekliği.
      1. Elle crypt / villus eksen (Şekil 3b) için crypt altından hücrelerin sayısını saymak için bir yüksek güç büyütme (örneğin 20X veya 40X) kullanın.
    3. Apoptoz 22, 23.
      1. Yöntem 1: el ile her crypt apoptotik hücre sayıları saymak için bir yüksek güç büyütme (. Örneğin 20X veya 40X) kullanın. Apoptotik hücreler, hücre büzüşmesi, kromatin yoğunlaşması, sitoplazmik kabarcıkların ve apoptotik cisimlerin (Şekil 3a) oluşumu ile tespit edilebilir.
      2. Yöntem 2: Bir IHC leke gerçekleştirin (bölüm 7) Kaspaz-3 manuel hücrelerin miktarının belirlenmesi için, her crypt pozitif hücrelerin sayısını yüksek büyütme ile (örneğin, 20X ya da 40X). Kullanarak, Tablo 2 tarif edilen koşullar kullanılarak. apoptoz yürütme aşaması.
    4. Mitoz.
      1. El ile her crypt mitotik hücrelerin sayısını saymak için bir yüksek güç büyütme (örneğin 20X veya 40X) kullanın. Mitotik hücre DNA örnekleri yoğunlaştırılır ve tipik olarak simetrik ve de (Şekil 3b) şekillendirilmişlerdir içerir.
    5. Çoğalma.
      1. Ki-67, Tablo 2'de tarif edilen koşullar kullanılarak bir IHC (bölüm 7) leke gerçekleştirin. El çoğalan kript hücrelerinin oranını ölçmek için pozitif hücrelerin sayısı.

Sonuçlar

Ah-CRE ISC Rekombinasyon Verimliliği karşılaştırılması ve Vil-Cre-ER T2 Sistemleri

Hasar Aşağıdaki bağırsak, ISCs içinde rekombinasyon verimliliği gerekli karakterizasyonu repopulating olarak, Paneth hücrelerinin rolünü değerlendirmek için bu CRE-lox sistemlerinin kullanılması. Rosa26R-lacZ koşullu muhabiri kullanarak biz ince bağırsak (Şekil 1a) 'de% 100 rekombinasyon ~ orada iki sistemde de 3 gün indüksiyon (dpi) sonrası ortaya koymuştur. QPCR rekombine alel mevcudiyeti ölçülmesi sistemleri arasında Cre ifade kalıpları farklılıklardan eleştirilmiştir edildi. Vil-Cre-ER T2 sistemi nedeniyle epitheli daha büyük bir oranda ekspresyonuna Ah-CRE sistemi ile karşılaştırıldığında rekombine alelin mevcudiyetinde bir 3.53 kat artış göstermiştir16. Bunun üstesinden gelmek için bize doğrudan sistemlerini karşılaştırmak için izin farklı bir strateji benimsemiştir. Biz farklı indüksiyon rejimlerine ile fareler neden olduğu ve bu noktada LacZ pozitif kriptler ve villus ISC rekombinasyon olayı temsil 30 dpi çözünürlükte analiz. Bu yaklaşımı kullanarak aldığı gösterilmiştir vil-Cre-ER T2 kadar büyüktür başlangıç ​​rekombinasyon seviyelerine rağmen ISCs eşdeğer sayıda rekombine her iki sistemde de, (24 saat içerisinde 80 mg / kg IP teslim) verici ajan 3 enjeksiyon bölgesi Sistem 16 (Şekil 1b-d). Bundan başka, yeniden birleştirilen kript ekstrakte edilmiş DNA kullanılarak, rekombine alelleri için qPCR potansiyel nedeniyle Ah-CRE sistemi kullanılarak gözlenmemiştir Paneth hücreleri rekombinasyon için vil-Kretase ER T2 sistemi kullanılarak rekombinasyon anlamlı olmayan bir artış olduğunu gösterdi, (Şekil 1d). Dahası, epitel hücre tipleri için boyama indi vermediCate farklılaşma desen herhangi bir değişiklik incelenmiştir her hücre tipi için temsili görüntüleri Şekil 2e-2H'de gösterilmektedir.

Bağırsak Epiteli Karakterizasyonu CatnB Silme aşağıdaki

Crypt Kaybı Kantitasyonu

Bu Cre sistemlerinde rekombinasyon kinetik Karakterizasyonu ISCs eşdeğer sayıda recombined zaman fare bağırsak analiz etmemizi sağladı. LacZ muhabiri kullanarak her iki sistem 3 dpi (Şekil 2a) de recombined (mavi) hücreleri tam kaybı gösterdi. Daha önce üç gün CatnB silindikten sonra bildirildiği gibi vil-Cre-ER T2 fareler crypt / villus eksen 13,16,24 (Şekil 2b-d) tamamen imha gösterdi oysa Ah-CRE fareler, kısmi kript kaybı gösterdi.

Epitel repopulation Dinamikleri

Birden parametre teknikleri, biz özelliği, yukarıda kullanarak bu gözlemi anlamak için bize sağlamaktır. Parametreleri ve hücre tipleri temsili görüntüleri 7 protokolleri kullanılarak analiz - 10 'da verilmektedir (Şekil 3a ve 3b). Kısaca, kript kaybı her iki sistemde (Şekil 3e) görüntülenen apoptoz yüksek seviyeleri ile tutarlıdır. Ancak mitoz, nükleer silahların yayılması, crypt hücresel yüksekliği, crypt ve anlatım (gösterilmemiştir) veri Ah-CRE sistemi un-recombined ISCs (Şekil 3c) tarafından muhtemelen nedeniyle kaybolmuş türlerin yeniden için geri verebilir belirtti. Yalın karşılaştırıldığında, vil-Cre-ER T2 epitel hücreleri crypt (Şekil 3d) istinat rağmen kurtarmak için başarısız oldu.

Crypt içindeki hücre fenotipleri Karakterizasyonu

Ah-CRE farelerin kriptler vil-Cre-ER T2 değil biz CatnB silinmesi sonra epitel hücreleri üç gün karakterize oysa yeniden doldurmak nedenini anlamak için. In situ hibridizasyon (bölüm 9) ve IHC analizi (bölüm 7, 8 ve 10) 'de kullanımıyla çok vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox farelerde kript hücreleri proliferatif olmayan olduğunu göstermiştir ISC işaretleyici Olfm4 ekspresyonunu yoksun Ah-CRE farelerde kriptalarının (Şekil 4c & f) benzemez. İlk karakterizasyon crypts rekombinasyon eşdeğer olduğunu göstermiştir gibi biz Paneth hücrelerinin rolünü incelemek için ilerledi. Bu β-katenin kaybetmiş hangi hücrelerin tespit etmek CatnB ve Lyz1 karşı çift floresan IHC yapıldı ve Paneth hücreleri (Şekil 5a-5c) olup olmadığı. Daha önce biz d açıklandığı gibitüm kript hücreleri vil-Cre-ER T2 sistemi kullanılarak hedef aldığını emonstrated. Buna karşılık Ah-CRE sistemi Paneth hücreleri ve villus epitel bağışladı. Daha fazla Paneth hücreleri sadece vil-Cre-ER T2 sistemi (Şekil 5d & 5e) kullanarak CatnB silindikten sonra apoptozise gözlendi idi.

figure-results-1
Şekil 1: Ah-CRE ve Vil-Cre-ER T2 Sistemleri kullanılarak Bağırsak Epiteli içinde Özgünlük ve Cre / Füme Rekombinasyon Etkinliğinin Karşılaştırılması (a):. Wholemount küçük (SI Ah-CRE LacZ haberci ifadesinin Görselleştirme; * uzak ucu) ve büyük (LI, bir vahşi tip fare * uzak ucu). (b): 1 dpi recombined CatnB flox alel için QPCR gösteren kat değişikliğinin sonuçları Ah-CRE CatnB flox / flox (BNF kaynaklı) farklı indüksiyon rejimleri karşılaştırmak ve vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox (TAM kaynaklı ); * P <0.05 (Mann-Whitney [2-kuyruk] kontrol ile karşılaştırıldığında). (c) - (e).:. Wholemount ince bağırsak gösteren LacZ pozitif crypt 30 dpi Paneli (b) - (e) Parry ve arkadaşları 16 değiştirilmiş bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Ah-CRE ve Vil-Cre-ER T2 Karşılaştırılması İnce barsak Epiteli de Şartlı silme CatnB (a) sistemler:. 3 gün boyunca Ah-CRE CatnB flox / flox LacZ + farelerde recombined hücrelerin Wholemount ince bağırsak gösteren kayıp. (b): 3 gün CatnB silindikten sonra kript kaybı miktarının belirlenmesi; * P <0.05 (Mann-Whitney [2-kuyruk] kontrol ile karşılaştırıldığında). (c & d): CatnB silindikten sonra crypts kaybını gösteren formalin sabit bağırsak Enine H & E bölümleri. (e) - (h) kontrol farelerinden elde edilen hücre tiplerine örnek: (e) ve entero-endocriine hücreleri, (f), goblet hücreleri, çekirdek B-katenin ve (h) sahip bir ISC (→) gösteren (g) CatnB IHC Paneth Hücreler. Panel (b) Parry ve ark. 16 güncellenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

gether.within sayfa "her zaman" => figure-results-3
Şekil 3: Fenotip başlangıçlı Karakterizasyonu İnce barsak Epiteli içinde ISCs Benzer Sayılarla Şartlı Silme CatnB için Ah-CRE ve Vil-Cre-ER T2 Sistemleri (a & b) H & E lekeli formalin sabit bölümler crypt yerini gösteren kullanırken. yükseklik ([), bir apoptotik (←) ve mitotik hücre (↓). Üç zaman noktasındaki (dpi) (c) kript yüksekliği, (d) mitoz ve (e) apoptoz yabani tip (mavi) ve CatnB flox (turuncu) fareleri arasındaki kript başına hücre ortalama sayısının nicelleştirilmesi (Hata çubukları standart sapmayı belirtir ). Panel (c) - Parry ve arkadaşları 16 değiştirilmiş (e).3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4:. Ah-CRE ve 3 gün CatnB Ah-CRE kullanarak (AC) ya da silinmesi ardından İnce barsak Epithelia Epitel kript hücrelerinde Şartlı Silme CatnB için Vil-Cre-ER T2 Sistemleri kullanılarak ISC Özelliklerinin Karşılaştırılması mevzusundan CRE-ER T2 (df) sistemi. (a & d) crypt kaybı alanlarını gösteren H & E bölümü; (b & d) vil-Cre-ER T2 kullanılarak proliferatif hücrelerin Ki-67 İHK tasviridir kaybı; (c & f) Olfm4 yerinde Ah-CRE kullanılarak fonksiyonel ISCs varlığını gösteren. Panel (a) -. (f) Parry ve arkadaşları 16 değiştirilmiş bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: CatnB Silme Vil-Cre-ER T2 ve Ah-CRE Sistemleri kullandıktan sonra Paneth Hücrelerinin Karakterizasyonu (AC):. Paneth hücresi (kırmızı), B-katenin (yeşil) ve çekirdeği gösteren kriptalarının İmmünofloresan görüntüleri (mavi ), zarla bağlanmış β-katenin gösterir ok; Apoptotik hücreler Paneth gösteren Kaspaz-3 için (de) IHC vil-Cre-ER T2 sistemi için (e) 'de Ah-CRE (d)' de mevcut değildir fakat bulunmaktadır. Panel (a) - (e) 'den modifiye edilmişParry ve arkadaşları 16. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Asetat tamponu * * 100 ml yapmak için: 4,8 mi 0,2 M asetik asit, 45.2 ml 0.2 M sodyum asetat, 50 ml damıtılmış su
Asetik asit Fisher Scientific C / 0400 / PB17
Asetik anhidrid Sigma A6404
Asetik anhidrid çözeltisi * * 0,1 M trietanolamin hidroklorür içinde 2 M asetik anhidrit
Alcian Mavi Sigma A5268
Alsiyan Blue PH 2.5 * * 500 ml yapmak için: 15 ml asetik asit, 5 g Alcian Mavi ve 485 ml damıtılmış su
anti-digoksigenin antikor, alkalik fosfataz konjuge Abcam ab119345
B (P) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF bileşik çözeltiden düşecek şekilde bir çözüm çok soğumasına izin vermeden enjekte edilir. Çözelti yeniden kullanılabilir - deposu kullanımlar arasında, -20 ° C 'de iki kez, daha fazla yeniden ısıtma gerekmez.
Bloxall Vektör Labs SP-6000
Mor BM Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Sığır serum albumini
Kloroform Fisher Scientific C / 4920/17
Sitrat Tampon / Antijen Maskesi Kaldırma Çözeltisi Vektör Labs 'H-3300
Mısır yağı Sigma C8627
Demucifiying Çözelti * * 50 ml gliserol, 50 ml Tris 0.1 M pH8.8, 100 ml EtOH, (su içinde% 0.9 NaCI) 300 ml tuzlu su, DTT 1.7 g: 500 ml için. Demucifying çözelti, önceden yapılan depolanmıştır ancak DTT inkübasyon (340 mg / 100 mi) ilave edilmeden önce kaçınılmalı edilebilir.
DEPC ile işlenmiş su Life Technologies 750.023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5 M
Etanol Fisher Scientific E / 0650DF / 17
Filtre kağıdı Whatman 3000917
Formaldehit Sigma F8775
Formalin Sigma SLBL11382V Nötr tamponlu formalin
Formamid Sigma F5786
Glutaraldehid Sigma G6257
H2O 2 Sigma 216.763
Hematoksilen Raymond A Kuzu 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2)
Hibridizasyon tamponu * * 5 x SSC,% 50 formamid, 5% SDS, 1 mg / ml heparin, 1 mg / ml sığır karaciğeri tRNA
Hidrokinon Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroksidaz Vektör Labs SK-4105
Immpress HRP anti-fare IgG Kiti Vektör Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Tavşan IgG Kiti Vektör Labs MP-7401
Bağırsak doku tozu * * 5, yetişkin farelerin ince bağırsak birleştirildi ve buz gibi soğuk PBS minimum hacimde homojenleştirildi. Buz içinde soğutulmuş aseton 4 hacim, iyice karıştırıldı ve 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edildi homojenize bağırsak, ilave edildi. Bu santrifüj edildi ve pellet buz soğuğu aseton kullanılarak yıkanır. Bu da santrifüj edildi ve elde edilen pelet, filtre kağıdı üzerine yayılır ve kurumaya bırakılır. Bir kez tamamen malzeme, bir havan ve tokmağı kullanarak ince bir toz halinde öğütülmüştür kurutun.
K-ferrisiyanür Sigma P-3667
K-ferrosiyanür Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Metakarn * * % 60 metanol:% 30 kloroform:% 10 Asetik asit
Metanol Fisher Scientific M / 4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal keçi serumu Vektör Labs S-1012 NGS
Normal tavşan serumu Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCI, 100 mM Tris HCI, 50 mM MgCI2,% 0.1 Tween 20, 2 mM Levamisole
PAP kalem Vektör 'H-400
Paraformaldehit Sigma P6148
PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7.5,% 0.1 Tween 20
Penisilin / Streptomisin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Fosfat tamponlu tuz (10x) Fisher Scientific BP3994 1x yapmak için damıtılmış su ile seyreltilmiş, 1:10
PLL slaytlar Sigma P0425-72EA Poli-L-lisin mikroskop dilimleri
Proteinaz K Sigma P2308
Proteinaz K solüsyonu * * 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 200 ug / ml'de Proteinaz K ile seyreltilir.
Ralwax BDH 36154 7N
Redüktör Çözümü * * 1 g hidrokinon, 5 g sodyum sülfit ve 100 ml damıtılmış su: 100 ml yapmak için
RnazA Sigma R6148
Tuzlu * * Damıtılmış su içinde% 0.9 NaCl
SDS Sigma I3771
Koyun serumu Sigma S3772
Gümüş nitrat Sigma S / 1240-1246
Gümüş çözeltisinin * * 10 ml asetat tamponu, 87 ml distile su, 3 ml% 1 gümüş nitrat: 100 ml yapmak için
Sodyum asetat Fisher Scientific S / 2120/53
Sodyum klorit Sigma S6753 NaCl
Sodyum sülfit Sigma 239.321
SSC Sigma 93.017 20x tuzlu sodyum sitrat
Cerrahi bant Fisher Scientific 12960495
Tamoksifen Sigma T5648 TAM, bileşik çözeltiden düşecek şekilde çözüm çok soğumaya izin vermeden enjekte. Çözelti yeniden kullanılabilir - deposu kullanımlar arasında, -20 ° C 'de iki kez, daha fazla yeniden ısıtma gerekmez.
TBS / T Hücre Sinyal # 9997
Triethanolamin hidroklorür Sigma T1502
Tris-HCl Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vektör Labs 'H-5000
Vectashield Hardset DAPI ile Orta montaj Vektör Labs 'H-1500
ABC Kit Vectastain Vectya Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal sabitleştirici * * % 2 formaldehit, 1xPBS içinde% 0.1 glutaraldehit
X-gal leke * * X-gal leke; 50 ml B çözeltisi (0.214 g MgCI2, 0,48 g K-ferrisiyanür 500 ml PBS içerisinde 0.734 g K-ferrosiyanür) 'de 200 ul X-gal (A). Çözelti B, 4 ° C'de önceden Oin hazırlanır ve saklanabilir
Ksilen Fisher Scientific X / 0200/21

Tablo 1: Materyaller ve Metotlar

RT'de d> 1/200, 30 dakika
Hedef beta-katenin Lizozim Ki67 Kaspaz-3 Villin
Birincil Ab Ticaret kaynağı Transduction Labs Neomarkers Vektör Labs R & D Systems Santa Cruz
Katalog Numarası 610.154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672
İlköğretim Ab kaldırdı Fare (mAb) Rabbit (pAb) Fare (mAb) Rabbit (pAb) Keçi (pAb)
Antijen alma Kaynar su banyosu / Sitrat Tampon Kaynar su banyosu / Sitrat tamponu Kaynar su banyosu / Sitrat tamponu Kaynar su banyosu / Sitrat tamponu Kaynar su banyosu / Sitrat tamponu
Peroksidaz bloğu Bloxall ya da% 2 H2O 2, 45 saniye Bloxall veya% 1.5 H2O 2, 30 dakika Bloxall veya% 0.5 H2O 2, 20 dak Bloxall ya da% 2H2O 2, 45 saniye Bloxall ya da% 3 H2O 2, 20 dak
Serum bloğu % 1 BSA, 30 dakika % 10 NGS, 30dk % 20 NRs, 20 dakika % 10 NGS, 45 dakika 10% NRs, 30 dakika
Yıkama tamponu PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T
Birincil Ab Koşulları 1/300, oda sıcaklığında 2 saat 1/100, 1 saat oda sıcaklığında 1/50, 1 saat oda sıcaklığında 1/750, o / n 4 ° C 'de 1/500, 1 saat oda sıcaklığında
İkincil antikor Immpress HRP anti-fare IgG Kiti Immpress HRP Anti-Tavşan IgG Kiti Biyotinile edilmiş tavşan anti-fare Biyotinile edilmiş Keçi anti-Tavşan Biyotinile edilmiş tavşan anti keçi
İkincil Ab Koşulları Oda sıcaklığında 1 saat Oda sıcaklığında 30 dakika RT'de 1/200, 30 dakika RT'de 1/200, 30 dakika
Sinyal büyütme N / A N / A ABC kiti ABC kiti ABC kiti
Sinyal algılama ImmPACT DAB Peroksidaz ImmPACT DAB Peroksidaz ImmPACT DAB Peroksidaz ImmPACT DAB Peroksidaz ImmPACT DAB Peroksidaz
Floresan antikor Alexafluor 488 Alexafluor 594 N / A N / A N / A
İmmünofloresan Özellikleri Uyarma Max 488 / Emisyon Max 525 Uyarma Max 595 / Emisyon Max 617
Ortak Filtre Seti FITC Texas Red
İçerik "> Tablo 2: İHK Antikorlar ve Koşullar

Tartışma

Genler ve hücrelerin fonksiyonunu incelemek için koşullu CRE-LOX transgenik fareler kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu modeller belirlemek ve tanımlamak kök hücreleri 2,4-6 ve hastalık 25 rollerini anlamak için bağırsaklarda büyük bir başarı ile kullanılmaktadır. Tam bu modeller yararlanmak için doğru yorumlanmalıdır verileri sağlamak için sistemin kapsamlı bir karakterizasyonu gerektirir. Bu sistemlerin tam anlaşılması nedeniyle genleri nadiren yalnız hücre tipi veya konumu, biyolojik bilgi ve Cre ifadesini uyarmak için kullanılan sistemlerin verimsizlik eksikliği özgü olmasının elde etmek zordur. Burada açıklanan yöntemler deneysel tasarım ve mevcut bilginin uygulanması yoluyla bu sorunları aşmak nasıl gösterilmektedir. Burada sunulan genel ve muri araştıran herhangi araştırma için istismar edilebilir teknikler belirli bir araştırma soruyu cevaplamak için bu yöntemleri kullanmasına rağmenne bağırsak.

Bağırsak Doku Hazırlanması

Sağlam sonuçlar sağlamaya yönelik önemli bir adım kesinlikle uyulması zamanında bir şekilde ve tespit protokollerinde işlenmesi gereken doku hasat ve işleme. Hemen hemen tüm önemli konular aşağı doku kuruma ve / veya eksik fiksasyonu ile ilişkili eserler isnat edilebilir. Zamanlama doku mimarisi ve / veya nükleik asitlerin ve proteinlerin bozulmasını önlemek için çok önemlidir. Eksik veya overzealous tespit histokimyasal çözünürlük kaybına neden olabilir. Yeterli zaman veya fiksatif penetrasyon İHK analizi üzerine bir "gelgit işareti" olarak görülebilir bağırsak kriptlerin içinde çözünürlük kaybına neden olabilir izin vermek için çok kalın bölümlere bağlı Eksik tespit. Bundan başka, nükleer β-katenin hemen yanlısı sürece çekirdeğin dışına dağılacaktır gibi tespit, çok uzun süre uzatmak etmediğini önemlidirulaşıldığı ve formalin fiksasyonu aşağıdaki gömülü balmumu.

ISC Niche Paneth Hücrelerinin Rolü

Burada sunulan veriler etkili bir ISC kaybını takiben yetişkin bağırsakta kript rejenerasyonu Paneth hücrelerinin önemini göstermektedir. Ancak orada Ah-CRE o vil-Cre-ER T2 hedefleri ISCs nüfusu yedek ihtimalini kalmıştır. Tian ve diğ. 26 zarif Lgr5 hi ISCs Lgr5 lo karşılık ISCs nüfusu ile ikame edildiğini göstermiştir. Şimdi bu ISCs nedeniyle rezerv nüfus salgı hücre öncüleri 6,7 olarak tespit edilerek için Ah-CRE sisteminde bağışladı olduğu muhtemel görünüyor. ISC duruma dönmek için gerektiğinde bu salgı hücre öncüleri destekleyen olgun Paneth hücrenin önemi cevaplanması gereken kalır. Paneth hücrelerinin I teşkil gibiSC niş 8 ve onların hemşirelik işlevleri kendi öncüleri uzatmak olasıdır kalır kalori alımı 27 ve inflamasyon 28 ISC yanıtlarını düzenlenmesinde rol oynamaktadır.

Yeni Yaklaşımlar ve Teknoloji Etkili Model İnsan Kolorektal Kanser için

ISC keşfi şimdi Clarke ve diğerleri tarafından gözden 9 barsak biyoloji ve hastalık, gen ve hücre rollerini araştırmak için yeni fare modelleri oluşturmak için kullanılan genlerin belirlenmesine yol açmıştır. Bu teknik için tek sınırlama, Cre proteinini ifade etmek için genlerin tanımlanmasıdır. Şu ISCs rutin Lgr5 gen ekspresyon modeline göre koşullu transgenik fareler kullanılarak incelenmiştir. Lgr5 promoterinden Cre ifade Fareler aPC, en yaygın olarak kolorektal kanserde mutasyona uğramış gen (CRC silmek için kullanılmıştır), Orijin 25 hücre olarak ISC gösteren. Seçerek silme bu hücrelerde diğer CRC genleri hastalığın ilerlemesi içgörü sağlanması ve yayılır örneğin. PTEN 29. ISC işlevi ayrıntılı fikir özellikle ablasyon Lgr5 insan difteri toksini reseptörü kullanılarak farelerde hücrelerin -expressing tarafından alındığını (DTR) geninin Lgr5 içine lokusu 26 çaldı. Diğer stratejiler mutant proteinlerin 30 devam eden geri dönüşümlü ifadesini sağlayan Tet-O sistemi kullanın. Farklı hücreler 31 ve yerlerde 32,33 yılında gen (ler) değiştirmek için bu araçları kullanarak kanser başlatmak nasıl anlamak, ilerleme ve 34 metastaz için kullanılır. Alternatif uyuyan güzellik transpozon sistemi kullanılarak mutajenez ÇHS yeni sürücüleri tespitidir. Farelerde, teknikleri ve genetik değişim stratejileri sürekli gelişimi daha sabırlı, ilgili modeller geliştirmeye devam ediyor.

Yeni methods bağırsak epitel ve ISCs karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Akış kullanılarak elde edilebilir epitel hücre tiplerinin oranı karakterizasyonu sitometri Lektin ve CD24 35 farklı ekspresyonu göre. Potansiyel büyük anlayış ISC biyolojide kaydedilen ilerleme ve hastalık rolleri ex vivo organoid kültür sistemi kullanılarak 36 yapılacaktır. Bu sistem, bu çoğaltma ve fizyolojik olarak daha uygun bir şekilde ayırt 3B, kültür normal ve habis ISCs sağlar. Bu kişiselleştirilmiş tıp 37 önünü, in vitro hasta örnekleri üzerinde ilaçların doğrudan test sağlayacak umulmaktadır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar Mark Bishop, Mathew Zverev, Victoria Marsh-Durban, Adam Blackwood ve Sylvie Robine'e teşekkür eder. Bu çalışma, Cancer Research UK tarafından sağlanan bir program hibesi ile finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetat tamponu**100 ml yapmak için: 4,8 ml 0,2 M Asetik asit, 45,2 ml 0,2 M Sodyum asetat ve 50 ml damıtılmış su
Asetik asitFisher ScientificC/0400/PB17
Asetik anhidritSigmaA6404
Asetik anhidrit çözeltisi**2 M Asetik anhidrit 0,1 M trietanolamin hidroklorür
Alcian BlueSigmaA5268
Alcian Blue pH 2.5**500 ml yapmak için: 15 ml asetik asit, 5 g Alcian Blue & 485 ml damıtılmış su
anti-digoksijenenin alkalin fosfataz konjuge antikoruAbcamab119345
B(beta)-NaftoflavonSigmaN3633BNF, çözeltinin çok fazla soğumasına izin vermeden enjekte edin, çünkü bileşik çözeltiden düşecektir. Çözüm yeniden kullanılabilir – -20 & °C'de saklayın; C kullanımlar arasında, iki defadan fazla ısıtmayın.
BloxallVektör LaboratuvarlarıSP-6000
BM morRoche11442074001
BSASigmaA4503Sığır serum albümini
KloroformFisher ScientificC/4920/17
Sitrat Tamponu/Antijen MaskelemeÇözme Çözeltisi Vektör LaboratuvarlarıH-3300
Mısır yağıSigmaC8627
Ayrıştırma çözeltisi**500 ml için: 50 ml gliserol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml salin (suda %0.9 NaCl), DTT 1.7 g.  Mucikiye edici çözelti önceden yapılabilir ve saklanabilir, ancak DTT inkübasyondan hemen önce eklenir (340 mg / 100 ml).
DEPC arıtılmış suYaşam Teknolojileri750023
DTTSigma101509944
EDTASigmaO36900.5M
EtanolFisher ScientificE/0650DF/17
Filtre kağıdıWhatman3000917
FormaldehitSigmaF8775
Formalin SigmaSLBL11382VNötr tamponlu formalin
FormamidSigmaF5786
GlutaraldehyeSigmaG6257
H2< / sub>O2< / sub>Sigma216763
HematoksilenRaymond A Kuzu12698616
HBSSGibco14175-053HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hibridizasyon tamponu**  5&kez; SSC, %50 formamid, %5 SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml buzağı karaciğeri tRNA
HidrokinonSigmaH9003
ImmPACT DAB PeroksidazVektör LaboratuvarlarıSK-4105
Immpress HRP Anti-Fare IgG KitiVektör LaboratuvarlarıMP-7402
Immpress HRP Anti-Tavşan IgG KitiVektör LabsMP-7401
Bağırsak dokusu tozu**5 yetişkin farenin ince bağırsakları birleştirildi ve minimum buz gibi soğuk PBS hacminde homojenize edildi. Homojenize edilmiş bağırsağa 4 hacim buz gibi aseton ilave edildi, bu bağırsaklar iyice karıştırılarak 30 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Bu santrifüjlendi ve pelet buz gibi soğuk aseton kullanılarak yıkandı. Bu daha fazla santrifüjlendi ve elde edilen pelet filtre kağıdına yayıldı ve kurumaya bırakıldı. İyice kuruduktan sonra, malzeme bir havan tokmağı ve havan topu kullanılarak ince bir toz haline getirildi.
K-ferrisiyanürSigmaP-3667
K-ferrosiyanürSigmaP3289
LevamizolSigmaL0380000
Metakarn**%60 Metanol:%30 Kloroform:%10 Asetik asit
MetanolFisher ScientificM/4000/17
MgCl2SigmaM8266
Normal keçi serumuVector LabsS-1012NGS
Normal tavşan serumuDakoX0902NRS
NTMT**100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, %0.1 Tween20, 2 mM Levamisol
PAP kalemiVectorH-400
ParaformaldehitSigmaP6148
PBT**0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, %0.1 Tween 20
Penisilin / StreptomisinGibco15140-122100x çözünürlük.
Fosfat tamponlu tuzlu su (10x)Fisher ScientificBP3994yapmak için damıtılmış su ile 1:10 dilluted
SigmaP0425-72EAPoli-L-lizin mikroskobu slaytları
Proteinaz KSigmaP2308
Proteinaz k çözeltisi**Proteinaz K'yi 200 & mikroda seyreltin; 50 mM Tris, 5 mM EDTA'da g/ml.
RalwaxBDH36154 7N
Düşürücü Solüsyon*100 ml yapmak için: 1 gr Hidrokinon, 5 gr sodyum sülfit ve 100 ml damıtılmış su
RnaseASigmaR6148
Salin**Damıtılmış suda %0,9 NaCl
SDSSigmaI3771
Koyun serumuSigmaS3772
Gümüş nitratSigmaS/1240/46
Gümüş çözelti**100 ml yapmak için: 10 ml Asetat tamponu, 87 ml distile su, 3 ml %1 gümüş nitrat
Sodyum asetatFisher ScientificS/2120/53
Sodyum KlorürSigmaS6753NaCl
Sodyum sülfitSigma239321
SSCSigma9301720x salin sodyum sitrat
Cerrahi bantFisher Scientific12960495
TamoxifenSigmaT5648TAM, bileşik çözeltiden düşeceği için çözeltinin çok fazla soğumasına izin vermeden enjekte edin. Çözüm yeniden kullanılabilir – -20 & °C'de saklayın; C kullanımlar arasında, iki defadan fazla ısıtmayın.
TBS/THücre Sinyalizasyonu# 9997
Trietanolamin hidroklorürSigmaT1502
Tris-HCLInvitrogen15567-027
Tween20SigmaTP9416
VectaMountVektör LaboratuvarlarıH-5000
Vektör LaboratuvarlarıH-1500ile VectaShield Sert Montaj Ortamı
Vectastain ABC KitiVektör LaboratuvarlarıPK-4001
X-galPromegaV3941
X-gal sabitleyici**%2 formaldehit, 1x PBS X-gal boyasında %0,1 glutaraldehit
**X-gal boyası; 200 &# 956; l 50 ml çözelti B içinde X-gal (A) (500 ml PBS'de 0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferrisiyanür, 0.734 g K-ferrosiyanür).  Çözelti B önceden hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir; C
KsilenFisher BilimselX/0200/21
1x PLL slaytları *DAPI

Kaynaklar

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: http://www.molecularmovies.com/movies/view/96 (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Bağırsak Kök HücreleriBağırsak İzolasyonuDoku FiksasyonuSwiss Roll TekniğiROSA26 ReporterqPCR AnaliziKript RejenerasyonuKök Hücre Nişi
Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.