Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobine güçlü bir şekilde reaktif olan iki IgG sınıfı monoklonal antikorun (mAb) gelişimini açıklar. Bu mAb'ler, deniz memelilerinin Mb'sini fok ve diğer hayvanlardan ayırt etmek için sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobinini (Mb) fokların ve diğer hayvanlarınkinden ayırt etmek için kullanılabilecek sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridinin geliştirilmesini açıklar. Şerit, deniz memelisi eti için hızlı ve yerinde tarama sağlayarak yasa dışı ticaretini ve tüketimini kısıtlar. Cetaceanların Mb'sine karşı reaktiviteye sahip iki monoklonal antikor (mAb) geliştirilmiştir. Çeşitli hayvanlardan alınan Mb antijenik reaktif bölgelerin amino asit dizileri, iki sentetik peptit (genel bir peptit ve spesifik bir peptit) tasarlamak ve daha sonra mAbs'yi (alt sınıf IgG1) yükseltmek için analiz edildi. mAb'ler indirekt ELISA, western blot ve dot blot ile taranan hibridomlardan seçildi. CGF5H9, tavşanların, köpeklerin, domuzların,, keçilerin ve deniz memelilerinin Mbs'sine özgüyken, tavukların, ton balığının ve fokların Mbs'sine zayıf veya hiç afinasyon göstermedi. CSF1H13, fokları ve deniz memelilerini güçlü bir afiniteye bağlayabilir, ancak diğer hayvanlara afinite göstermemiştir. Bu çalışmada dört familyadan (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae ve Kogiidae) deniz memelisi örnekleri kullanıldı ve sonuçlar, bu iki mAb'nin farklı deniz memelilerinden alınan Mbs'ye geniş bağlanma yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. Bu mAb'ler, sandviç tipi bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulandı. Birçok türü tanıyan CGF5H9, kolloid altın etiketliydi ve tespit antikoru olarak kullanıldı. Test bölgesi üzerine kaplanan CSF1H13, deniz memelisi ve fok balığı Mbs'nin varlığını tespit etti. Ton balığı, tavuk, fok, beş karasal memeli türü ve 15 deniz memelisi türünden alınan kas örnekleri üç nüsha halinde test edildi. Tüm deniz memelisi örnekleri pozitif, diğer tüm örnekler negatif sonuçlar göstermiştir.
Giriş
Tarihsel olarak deniz memelisi eti dünyanın birçok yerinde tüketilmiştir ve bu tüketim günümüzde de devam etmektedir1. Deniz memelilerinin trofik seviyesi nedeniyle, etlerinde yüksek düzeyde cıva ve diğer toksinlerin bulunduğu bilinmektedir2. Bu nedenle, deniz memelisi etinin tüketimi sadece hamile kadınlar gibi yüksek riskli gruplar için değil, aynı zamanda genel popülasyon için de bir sağlık sorununa yol açabilir3. Ayrıca, deniz memelisi etinin zoonotik veya potansiyel olarak zoonotik patojenlerle kontaminasyonu, işlenmesi ve depolanması sırasında da meydana gelebilir4. Deneyimli ajanların bile deniz memelisi etlerini yaln....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik Beyanı: Çalışma Ulusal Chiayi Üniversitesi, onay numarası Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından uluslararası kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi: cetacean örnek kullanımı Tayvan Tarım Konseyi (Araştırma İzni tarafından izin verildi 99022. 100M-02.1-Cı-99).
1. Kas Numune Hazırlama ve SDS-PAGE
Not: Deniz memelilerinin 16 türün, karasal memeli 5 türler de dahil olmak üzere 23 türe kas örnekleri, ton balığı ve tavuk Bu çalışmada (Tablo 1) kullanılmıştır. cetacean kas örnekleri mahsur kişiler, balıkçılık hedef dışı av ve müsadere elde edilmiş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Monoklonal antikor özelliklerinin
Bu memeli Mb sırasıyla iki sentetik peptidler (MKASEDLKKHGNTVLC ve AIIHVLHSRHPAEFGC) tanıyan, iki IgG 1 mAb (CGF5H9 ve CSF1H13) geliştirildi ve bu memeli Mb hızlı tespiti için yapılan bir sandviç tipi koloidal altın immünokromatografik test şeridi oluşturmak için kullanıldı. Şekil 2, CGF5H9 yaklaşık 17 kDa'lık tahmini bir moleküler ağırlığında tek bir boyanmış bandın olarak, deniz memelileri ve diğer memeliler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
taşıyıcı proteine konjüge edilmiş sentetik bir peptidin kullanımıyla kognat proteine kıyasla önemli ölçüde daha etkilidir. mAb bilinen göreceli yerle epitopları kullanılarak geliştirilmiştir, çünkü sandviç temelli bir yöntem için, bu çalışmada iki mAb hedef antigen epitopu ile birbirlerinin etkileşime müdahale olası değildir. Ayrıca, doğal proteinin, sentetik peptit bağı ile bağışıklaştırılan farelerin antikor arasında tepkime nativ protein ve doğal proteinin 19 üretilen antikorun arasındaki reaktivite da.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Tayvan Deniz Memelileri Derneği, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Deniz Biyolojisi ve Deniz Memelileri Araştırma Merkezi, Farglory Okyanus Parkı ve Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi'ndeki meslektaşlarımıza örnek toplama için teşekkür ederiz. Bu proje, Tayvan Tarım Konseyi'nden (100AS-02.1-FB99) WCY'ye hibe ile finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fosfat tamponlu salin | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Sağlık Hizmetleri | 28-9031-34 | Protein G Sefaroz |
| IsoStrip Fare Monoklonal Antikor İzotipleme Kiti | Roche | 11493027001 | İzotipleme Şeritleri içeren spin kolonu, alt sınıfa ve hafif zincire özgü anti-fare-Ig antikorları ile önceden kaplanmıştır |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitroselüloz membran | Whatman | Z613630 | |
| Antikoru Engelleyici Çözüm | LTK BiyoLaboratuvarları | Numunelerde spesifik olmayan IgG'nin spesifik olmayan bağlanma etkileşimlerini en aza indirmek | |
| için BCIP/NBT fosfataz substratı | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Dedektörü HRP Microwell Kiti, Anti-Fare | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc İmmün Plakası MaxiSorp ELISA plakası | Termo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA okuyucu | Termo Elektron Corporation | 51118170 | |
| Kolloid altın (40 nm) çözeltisi | REGA Biyoteknoloji A.Ş. | 40-50 nm immünostrip, | |
| Sığır serum albümini | Gibco | 15561-020 | |
| Hızlı test, immno-strip yazıcı | REGA biyoteknoloji A.Ş. | AGISMART RP-1000 | Yalnızca araştırma ve geliştirme amaçlı küçük ölçekli immünoplast üretimi için uygundur |
| Şerit bileşenleri (NC membranlar, numune pedleri (# 33 cam, S & S), eşlenik pedler (#16S, S & S) ve emici pedler (CF6, Whatman)) | REGA biyoteknoloji A.Ş. | ||
| Freund' s adjuvan ve eksik Freund' s adjuvan | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | yağda su emülsiyonlarını üretmek için kullanılır |
| ; | SDS-PAGE Coomassie | ||
| SDS-PAGE jellerinde protein boyama | |||
| Laemmli numune tamponu ve β-merkaptoetanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | SDS-PAGE jellerine yüklemeden önce protein örneklerini seyreltin |
Kaynaklar
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implic....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
