Yöntem makalesi

Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

DOI:

10.3791/53433

⸱

13 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobine güçlü bir şekilde reaktif olan iki IgG sınıfı monoklonal antikorun (mAb) gelişimini açıklar. Bu mAb'ler, deniz memelilerinin Mb'sini fok ve diğer hayvanlardan ayırt etmek için sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobinini (Mb) fokların ve diğer hayvanlarınkinden ayırt etmek için kullanılabilecek sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridinin geliştirilmesini açıklar. Şerit, deniz memelisi eti için hızlı ve yerinde tarama sağlayarak yasa dışı ticaretini ve tüketimini kısıtlar. Cetaceanların Mb'sine karşı reaktiviteye sahip iki monoklonal antikor (mAb) geliştirilmiştir. Çeşitli hayvanlardan alınan Mb antijenik reaktif bölgelerin amino asit dizileri, iki sentetik peptit (genel bir peptit ve spesifik bir peptit) tasarlamak ve daha sonra mAbs'yi (alt sınıf IgG1) yükseltmek için analiz edildi. mAb'ler indirekt ELISA, western blot ve dot blot ile taranan hibridomlardan seçildi. CGF5H9, tavşanların, köpeklerin, domuzların,, keçilerin ve deniz memelilerinin Mbs'sine özgüyken, tavukların, ton balığının ve fokların Mbs'sine zayıf veya hiç afinasyon göstermedi. CSF1H13, fokları ve deniz memelilerini güçlü bir afiniteye bağlayabilir, ancak diğer hayvanlara afinite göstermemiştir. Bu çalışmada dört familyadan (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae ve Kogiidae) deniz memelisi örnekleri kullanıldı ve sonuçlar, bu iki mAb'nin farklı deniz memelilerinden alınan Mbs'ye geniş bağlanma yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. Bu mAb'ler, sandviç tipi bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulandı. Birçok türü tanıyan CGF5H9, kolloid altın etiketliydi ve tespit antikoru olarak kullanıldı. Test bölgesi üzerine kaplanan CSF1H13, deniz memelisi ve fok balığı Mbs'nin varlığını tespit etti. Ton balığı, tavuk, fok, beş karasal memeli türü ve 15 deniz memelisi türünden alınan kas örnekleri üç nüsha halinde test edildi. Tüm deniz memelisi örnekleri pozitif, diğer tüm örnekler negatif sonuçlar göstermiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarihsel olarak deniz memelisi eti dünyanın birçok yerinde tüketilmiştir ve bu tüketim günümüzde de devam etmektedir1. Deniz memelilerinin trofik seviyesi nedeniyle, etlerinde yüksek düzeyde cıva ve diğer toksinlerin bulunduğu bilinmektedir2. Bu nedenle, deniz memelisi etinin tüketimi sadece hamile kadınlar gibi yüksek riskli gruplar için değil, aynı zamanda genel popülasyon için de bir sağlık sorununa yol açabilir3. Ayrıca, deniz memelisi etinin zoonotik veya potansiyel olarak zoonotik patojenlerle kontaminasyonu, işlenmesi ve depolanması sırasında da meydana gelebilir4. Deneyimli ajanların bile deniz memelisi etlerini yalnızca görünümlerine göre tanımlaması zordur. Bu nedenle, deniz memelisi etini diğer etlerden ayırt etmek için güvenilir bir bilimsel tanımlama yöntemi gereklidir. Bu, deniz memelisi eti tüketimini sınırlamaya yardımcı olacaktır.

Mevcut tür tanımlama yöntemleri arasında moleküler teknikler ve immünolojik yöntemler bulunmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve DNA dizilimi gibi moleküler teknikler, yalnızca çiğ etten5 ve ayrışmış numunelerden6 değil, aynı zamanda pişmiş sosis ve yem maddeleri7,8 gibi işlenmiş gıdalardan alınan numuneleri tanımlamak için de kullanılabilir. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi immünolojik yöntemler, örneğin domuz eti 9, sığır eti10 ve yayın balığı11'in et içeriğini tespit etmek için gıda üretiminde yaygın olarak uygulanır. Cetéan etinin tanımlanması için PCR tabanlı DNA analizi mevcuttur12 ve Japonya, Güney Kore, Filipinler, Tayvan, Hong Kong, Rusya, Norveç ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yasa dışı uluslararası deniz memelisi eti ticaretinin önlenmesine yardımcı olmuştur1. Bu yöntemler etkili ve güvenilirdir, ancak tamamlanması saatler veya günler alabilir ve zahmetli adımlar içerebilir. Cetean etlerinin tanımlanması genellikle moleküler tekniklere dayanmaktadır ve şu anda mevcut bir immünolojik yöntem bulunmamaktadır. Düzenleyici kurumlar için, deniz memelisi etlerini tanımlamak için sahada kullanılabilecek güvenilir ve hızlı bir tekniğin geliştirilmesi son derece arzu edilir.

İmmünokromatografik şeritler, sahada kullanıma uygun basit bir protokol ile hızlı sonuç üretme avantajı ile tespit araçları olarak kullanılır. İmmünokromatografik şerit ve ELISA'nın prensipleri çok benzerdir ve antikorları, antijenleri ve etiketleri içerir. İmmünokromatografik şeritlerin geliştirilmesinde kolloidal altın, karbon ve lateks gibi birçok farklı etiket kullanılmıştır. Şu anda, bu yöntem antibiyotikleri, toksinleri, bakterileri ve virüsleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır13, ancak etteki proteinleri tanımlamak için nadiren kullanılmaktadır14,15. Burada, deniz memelisi miyoglobinin (Mb) hızlı tespiti için bir yanal akış kromatografik enzim immünolojik testi öneriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Çalışma Ulusal Chiayi Üniversitesi, onay numarası Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından uluslararası kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi: cetacean örnek kullanımı Tayvan Tarım Konseyi (Araştırma İzni tarafından izin verildi 99022. 100M-02.1-Cı-99).

1. Kas Numune Hazırlama ve SDS-PAGE

Not: Deniz memelilerinin 16 türün, karasal memeli 5 türler de dahil olmak üzere 23 türe kas örnekleri, ton balığı ve tavuk Bu çalışmada (Tablo 1) kullanılmıştır. cetacean kas örnekleri mahsur kişiler, balıkçılık hedef dışı av ve müsadere elde edilmiştir. Tavşan, fare, köpek ve tavuk kas dokuları Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi'nden elde edilmiştir. sığır, domuz, kuzu ve orkinos örnekleri yerel bir süpermarketten satın alındı. Liman foku (Phoca vitulina kas örneği ) Farglory Ocean Park tarafından sağlandı. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE), kas örnekleri, farklı moleküler ağırlıklara sahip çözünebilir proteinlerin ayrılması için kullanılmıştır.

  1. kullanılana kadar -20 ° C'de tüm örnekler saklayın.
  2. -20 ° C'de ön-serin harcı. Sonra içine donmuş kas örnek 3 g koydu.
  3. Bir doku homojenleştirici kullanarak soğuk fosfat tamponlu salin içinde 10 ml (PBS) ile örnek homojenize edilir.
  4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de homojenize santrifüjleyin. süpernatantlar toplamak ve kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.
  5. (5 mi,% istifleme jeli (3.07 ml damıtılmış suya, pH 6.8,% 40 akrilamid 625 ul,% 10 amonyum persülfat (APS), 50 | il ve tetrametiletilendiamin 5 ul 4x üst jel tamponu 1.25 ml 5 hazırlanması TEMED)) ve 10 ml% 15 ayırma jeli (damıtılmış su 3.65 mi, 4 kere pH 8.8 alt jel tamponu, 2.5 ml% 40 akrilamid 3.75 mi,% 10, 100 ul APSve TEMED 4 ul).
    1. Elektroforez hücresinde, ikinci katılaşmasından sonra ayırma jeli (% 15 akrilamid) üzerine jel (% 5 akrilamid) istifleme dökün. istifleme jel jel tarak yerleştirin.
  6. Aşağıdaki koşullara göre PAGE gerçekleştirin: İlk çalışma koşulu: 100 volt, 20 dakika ve son durum: 120 volt, 40 dk.
  7. Jel renk eşit mavi olana kadar 30 dakika oda sıcaklığında Coomassie parlak mavisi ile jel leke.
    Not: Jel artık boya çözeltisi görünür olduğunda Boyama tamamlanır.
  8. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında asetik asit çözeltisi (% 10) ile destain. Bantları görünmeye başlayacaktır. Arka plan temizlenene kadar bir gecede 4 ° C'de lekenin devam edin.

2. Peptid Sentezi ve Tek klonlu Antikor Üretimi

  1. ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil hayvanlar, mühür ve 18 tür dahil olmak üzere, GenBank'tan Mb amino asit sekanslarını almakdeniz memelileri (Tablo 2).
  2. Uygun yazılım 16 kullanarak dizileri hizalayın:
    1. Hizala seçerek Hizalama Explorer'ı başlatın: başlatmak çubuğunda Hizalama kurmak / Edit; Yeni Hizalama Oluştur'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Bir iletişim soran görünecektir "Bir DNA veya protein dizi hizalama oluşturuyor musunuz?"
    2. "Protein" etiketli düğmesini tıklayın; Açık: Verileri seçmek Dosya seçin ve dizi dosyasından dizileri Al; Düzenle'yi seçin: Bir çoklu dizi hizalaması oluşturmak için veri seti her dizisi için tüm siteleri seçmek için Tüm menü komutunu seçin.
    3. Seç Hizalama: ClustalW algoritması kullanılarak seçilen dizileri veri hizalamak için ana menüden ClustalW tarafından hizalayın; Tamam düğmesini tıklatın Protein Kilo Matrix olarak "BLOSUM" i seçin.
  3. dizi hizalama analiz:
    1. 5 antijenik reaktif si odaklanıntes 17: Alanı 1 (AKVEADVA, 15-22), Alanı 2 (KASEDLK, 56-62), Alanı 3 (ATKHKI, 94-99), Alanı 4 (HVLHSRH, 113-119) ve site 5 (KYKELGY, 145- 151) ve deniz memelileri arasında muhafaza fragmanı bulmak. Bir * (yıldız; hizada konsensüs sembolü (Protokol 2.2.3)) tek, tamamen korunmuş kalıntısı pozisyonları gösterir. deniz memelileri aşağıdaki korunmuş parçaları bulundu: (siteyi 2 dahil) dizisi KASEDLKKHG ve dizi HVLHSRHP (hangi siteyi 4 içerir).
  4. ticari hizmetlerini kullanarak taşıyıcı protein olarak ovalbümin proteininin (OVA) ile sekans analizi ve konjugat göre aday dizisi fragmanları sentezlemek.
    1. Ayrışma peptidin önlemek için antijenik reaktif site N-terminali hidrofobik amino asitler (örneğin, metionin) ilave (örneğin, E-KASEDLKKHG).
    2. immünosit çekirdek bir antijenik yeri sergilemek için antijenik reaktif sitenin C-terminal uzatır. Bundan başka, konjugatKapı Cı-terminal sistein (Cys; C) eklenerek OVA peptid (örneğin, E-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. imünojen 1 ya da PBS içinde, her sentetik peptit, eşit hacimde (3 mL, nihai konsantrasyon 30-50 g / 100 ul) ile imünojen 2 tam olmayan Freund katkı maddesi için tam Freund katkı maddesi emülsiyon.
  6. deri altından 5 dişi BALB / c farelerinin her birine imünojen 1 (0.1 mg), inoküle.
  7. İki haftalık aralıklarla subkutan güçlendirici enjeksiyonları immünojen 2 kullanılarak beş kez gerçekleştirin ve her güçlendirici önce farelerden alınan kuyruk klip örnekleme test serumları toplamak.
  8. İlk tarama için, sera titresi belirlenir.
    1. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, reaksiyon tamponu ve kısım çözeltisi 50 ul 25 ml serbest peptidin 100 ug çözündürülür. Her kuyuya 10 ul birleştirme reajanı solüsyonu eklenir ve plaka karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
    2. , Kuyunun içeriğini kaldırdamıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkama ve bloke etme çözeltisi 200 ul ilave edilerek plaka engeller. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. içeriğini çıkarmak ve damıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkayın.
    3. İlk tarama için sera titresinin belirlenmesi için dolaylı ELISA (Protokol 5,1-5,7) gerçekleştirin. dalak koleksiyonu için en yüksek titre (en yüksek optik yoğunluk) ile fare seçin.
  9. Üç gün önce dalak koleksiyonuna, deri altı yüksek titreye sunan fare içine immünojen 1 0.1 mg aşılamak.
  10. MAb nesil 18 için hibridoma hücreleri elde etmek için fare miyelom hücreleri F0 (sp2 / 0-Ag14) ile seçilmiş aşılanmış farelerde ve sigorta dalak hücreleri toplamak.
  11. 14 gün füzyon sonra, dolaylı ELISA kullanılarak içermeyen sentetik peptid doğru hibridom üst fazları (Protokol 5,1-5,7) reaktivitesini tarama ile pozitif klonlar seçin.
  12. maximiz için oyuk başına uygun sayıda hücreleri sulandırmaksadece tek bir klon (seyreltme klonlama) içeren havuzlara oranını ing.
    1. Boş kalan de A1 hariç 96 oyuklu plaka içerisinde tüm oyuklara hücre kültür ortamının 100 ul ekle.
    2. de A1 hücre süspansiyonu 200 ul ekle. Sonra hızlı bir şekilde B1 A1 100 ul transferi ve hafifçe pipetleme karıştırın. Tüm sütun boyunca 2 dilüsyonları, ve bunun üstünde kuyuları ile aynı hacmi ile biter böylece daha sonra H1 100 ul atmak: Bu 1 tekrarlayın.
    3. 8 kanallı mikropipet ile sütun 1, orta ve ek bir 100 ul ekle. Daha sonra hızlı bir şekilde, aynı pipet kullanarak sütun 2'de kişilerce sütun 1 kuyuların herbirinden 100 ul transfer ve yavaşça pipetleme karıştırın.
    4. tüm plaka üzerinde 2 dilüsyonları: Aynı ipuçlarını kullanarak, bu 1 tekrarlayın. son sütunda kuyuların her birinden 100 ul atın.
    5. Her bir oyuğa 100 ul ortamı eklenerek 200 ul tüm oyuklara nihai hacim getirin. pla inkübeTe nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C ısıda.
    6. Her çukurun kontrol edin ve sadece tek bir koloni içeren tüm kuyuları işaretlemek. Tek klonlar içeren kuyuların>% 90 antikor üretimi için pozitif olana kadar iki veya daha fazla klonlama yürütmek.
  13. Western blot ve Dot blot (protokol 3,1-4,6) ile klonları taramak. Sonra daha büyük kaplara kuyulardan alt kültür koloniler mAb elde etmek için hücreleri genişletmek için. Genellikle, her klon 12 veya 24 oyuklu bir plaka içerisinde, tek bir kuyunun içine aktarılır.
  14. mAbs ve inek, keçi, domuz, köpek, tavşan, ton balığı, tavuk, mühür kas özleri ve western blot ve dot blot (protokol 3,1-4,6) dört temsilci cetacean türler arasındaki yakınlık ölçün.
  15. Assitler ikna etmek için farelerin periton içine (en fazla 3 x 10 6) seçilen hibridoma hücreleri aşılamak. Karın şişliği 7-10 gün hibridoma enjeksiyon sonrası içinde genellikle açıktır. bir hipodermik bir iğne kullanılarak sıvının toplama(Az 20 ölçü).
  16. Santrifüj asit sıvısı (10 dakika 10.000 xg) hücreleri ve enkaz kaldırmak için. 0.45 um'lik bir filtre ile filtrelenir. Protein G Sefaroz kolonuna örnek 1 ila 20 ml bağlama tamponu 15 mi, ve elüsyon tamponu 3 ila 5 ml ilave edilir. farenin asit sıvısı arıtılmış antikor içeren ayırma fraksiyonu toplamak.
  17. Üreticinin talimatlarını kullanarak Antikor İzotipleme Kiti ile antikor izotipini belirlemek.

3. Western Blot

  1. BME 50 ul 2x Laemmli numune tamponu 950 ul karıştırılarak β-merkaptoetanol (BME) ihtiva eden 2 x yükleme tamponu hazırlayın. Poliklonal tavşan anti-insan Mb antikoru kullanıldığında 5 (evcil hayvanlar ve ton balığı) ve: 01:50 (, deniz memelileri ve mühür) ve 1: iyi sinyaller elde etmek için uygun oranda yükleme tamponu kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltin 1: 1 (domuz, tavşan, tavuk ve ton balığı), 1: 5 (inek, keçi ve köpek) ve 01:25 (deniz memelileri ve mühür) zamanntibody Hibridom yüzey arasındadır.
  2. 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısı örneği. moleküler ağırlık belirteçleri ile birlikte SDS-PAGE jel (% 4 akrilamit yığınlama ve% 12 akrilamid ayırma) oyuklarına Numuneleri. V sonra yaklaşık 1 saat içinde koşmak bitirmek için 150 V gerilimi artırmak 50 ° C'de 5 dakika boyunca jel çalıştırın.
  3. 15 dakika boyunca 1 x transfer tampon maddesi içinde jel yerleştirin. nitroselüloza ayrılan protein aktarın (NC) membranlar da PAGE ile ayrıldıktan sonra. Aktarım 60-90 dakika boyunca 100 V'ta yapılabilir.
  4. engelleme çözeltisi hazırlayın: 1X PBS,% 5 yağsız kuru süt ile% 0.1 Tween 20 ihtiva etmektedir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi 25 ml Carolina membran engeller. Tween 20 (PBST), 15 ml fosfat tamponlu tuzlu su ile her biri 5 dakika için üç kez yıkayın.
  5. Antikor Seyreltme tampon maddesi gece boyunca 4 ° C 'de% 5 engelleme çözeltisi ile seyreltildi, 10 ml membran ve primer antikor (assit sıvısı veya hibridom üst faz) inkübe edin.
  6. zarı yıkayınYine PBST ile e üç kez aşırı antikor temizlemek için.
  7. 1 ile alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'si ile membran inkübe: 1,250, oda sıcaklığında 1 saat süre ile hafif bir çalkalama ile engelleyici çözelti içinde.
  8. Yine zarın yıkanması ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat / p-nitro mavi tetrazolyum klorit içinde inkübe (BCIP / NBT) fosfataz alt-tabaka karışımı 10 ila 20 dakika süreyle renk gelişimi kadar.
  9. damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun.

4. nokta leke

  1. iyi sinyaller elde etmek için uygun bir oran ile PBST içinde% 5 sığır serum albumin (BSA), kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltilir: 1: evcil hayvanlar ve ton 5 ve 1:25 deniz memelileri ve conta için. Noktası zarı üzerine numune 5 ul. Çözelti yavaşça uygulayarak (genellikle 3-4 mm çapında) nüfuz bölgeyi en aza indirin.
  2. Oda sıcaklığında (zar kurutun, örneğin <30-60 dakika boyunca, bir laminar akış / em>), oda sıcaklığında, 1 saat süre ile Petri kabındaki çözüm engelleme ile bloke eder ve PBST ile yıkayın.
  3. primer antikor ile membran inkübe (mAb 1 ile hibridoma süpernatanından: 10,000 veya assit sıvısı ile 1: 5% engelleme çözeltisi içinde seyreltildi 100,000), oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
  4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 Bloklama çözeltisi, 1.250 1 alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'si) kullanımı PBST fazla antikor kaldırmak ve daha sonra sekonder antikor ile inkübe edilmesi her biri 5 dakika MEMBRAN üç kez yıkamak .
  5. Yine membran yıkayın ve renk gelişimi kadar 10 ila 20 dakika içinde BCIP / NBT fosfataz substrat karışımı içinde kuluçkaya yatmaktadır.
  6. damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun.

5. Dolaylı ELISA

  1. Yıkama tamponu (% 0.02 Tween 20 ile 0,002 M imidazol tamponlu tuz) hazırlayın. plaka yıkama ile 3 kere yıkayınHer bir sonraki aşamada (protokol 5.2-5.5) arasında tampon.
  2. kaplama tamponu kas süpernatanları (protokol 1.1-1.4) ve 01:25 seyreltme hazırlayın. Ceket 96-çukurlu bir ELISA gece boyunca 4 ° C'de 100 ul seyreltilmiş supernatantlar plaka ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile tampon (PBS içinde% 1 BSA) ile bloke ile bloke eder.
  3. İnceltilmiş tampon ile saflaştırılmış mAb 2.000 seyreltme ve her bir seyreltilmiş, mAb 100 ul 1 hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
  4. daha inkübasyon için: (seyreltilmiş tampon maddesi içinde 200 seyreltme 1) keçi anti-fare IgG yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş ekleyin.
  5. her bir (100 ul / çukur) peroksidaz substratı ilave edin ve 10-15 dakika inkübe edilir.
  6. Renk gelişimi gözlemlenir peroksidaz durdurma çözeltisi (100 ul / oyuk) enzim reaksiyonu durdurun.
  7. Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 450 nm'de optik yoğunluk okuyun.

Kolloidal Altın etiketli mAb 6. hazırlanması

Not: koloidal altın çözüm ve karışımın rengi her zaman kırmızı olmalıdır. Siyah çökelti fark edildiğinde pH, mAb konsantrasyonu, santrifüj hızını ayarlayın. 6.1 Adımları ve 6.2 optimizasyon adımlardır.

  1. 5-9 arasında değişen pH değerleri ile, koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb (50 ug / ml, 3 ul) tespit saflaştınlmış ekleyin. İki saat süre ile kırmızı rengi tutan en az optimum pH değeri pH olarak kabul edilir. Not: Bu çalışmada, 0.1 M potasyum karbonat kolloid altın (40 mil), pH 8.0 (optimum pH) çözüm ayarlamak için kullanıldı.
  2. pH 8.0'da koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb tespit saflaştırılmıştır çeşitli bir miktar (500 mg / ml, 1-20 ul) eklenir. Not: Bu çalışmada, optimum konsantrasyonu 6 ng / ml (siyah tortu) 'dir.
  3. Yukarıdaki sonuçlara göre, arıtılmış, mAb damla damla kolloid altın çözeltisi 10 ml saptama 60 ug ekleyin. 10 dakika süre ile, oda sıcaklığında, karışımın hafifçe emülsifiye. ilankarışıma PBS içinde% 5 BSA çözeltisi (pH 7.4), 2 ml ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça emülsifiye D interferansı azaltır.
  4. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin karışımı.
  5. dikkatli bir şekilde konjüge edilmemiş antikor ile süpernatantı ve% 1 BSA ve% 0.1 Tween 20 içeren PBST ile 4 ml elde pelet askıya ve santrifüj ve süspansiyon birkaç kez tekrarlayın.
  6. 1 ml PBST son çökeltiler askıya alma ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.

Bağışıklık Strip 7. İnşaat

Not: Şekil 1, bağışıklık şerit tasarımı gösterir. Hazırlayın ve <(1 yıl) uzun süreli depolama ömrü için (% 20 Bağıl Nem düşük nem laboratuarı çevre durumda şeritler)> monte edin. pedleri ve zarın boyutları: Birleşmiş Yastığı, 300 mm x 10 mm, emici ped, 300 mm x 24 mm, Örnek Yastığı, 300 mm x 24 mm, NC membranı 300 mm x 25 mm, 300 çalışma alanınamm x 80 mm.

  1. Birleşmiş Yastığı, doyurulması ve sonra monte edilmeden önce 1 saat boyunca 37 ° C'de kurutmak için mikropipet ile adım 6.6 arasında kolloid altın etiketli mAB solüsyonu eklenir.
  2. Bir pipet ya da İmmunoStrip yazıcı kullanılarak Kuzey Carolina zar üzerinde mAb saptanması için kontrol alanının spesifik antijen yakalama test bölgesi üzerinde mAb (500 ug / ml) ve tavşan anti-fare IgG (500 ug / ml) dağıtın. bir girişimi engellemek için iki bölge arasındaki mesafeyi (> 5 mm) tutun.
  3. çift ​​taraflı bant ile çalışma alanında konjuge pad, emici ped ve NC membran yapıştırın.
    Not: yaklaşık 2 mm NC zarın her iki tarafındaki pedleri üzerinden geçin. Uygunsuz şerit inşaat tamamlanmamış bir testte neden olur.
  4. eşlenik pedi üzerinde numune pedi (2 mm) yerleştirin ve çalışma alanındaki yapıştırın.
  5. Bir kağıt kesici ile 6 mm çapında şeritler oluşturun. kurutucu ile alüminyum folyo çanta içinde şeritler paketleyin ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.

8. Çapraz reaktivite Testi

  1. 1.5 ml santrifüj tüpüne 1 ml PBS içeren (% 0.1 BSA) bambu çubuk kullanarak ya da çubuğu taşlama ham kas numunesi 0.03 g homojenize edilir.
  2. Test alanlara son tersi şeridi tutun ve 5-10 dakika süreyle numune içine numune pedi parçası daldırma ve doğrudan sonucu gözlemleyin.
    1. İsteğe bağlı: 500 ul süpernatant toplayın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
      Not: şerit doğrudan süpernatant içine batırılmış zaman sinyal açık değilse, bu adım önerilir.
  3. üç nüsha olarak çeşitli kas örnekleri test edin.
    Not: Burada orkinos, tavuk, mühür, deniz memelileri 15 tür ve karasal memeli 5 tür test.
  4. , Beş bağımsız müfettişler, yani beş kez 8.3 tekrarlayın sahip toplam 575 şeritler kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monoklonal antikor özelliklerinin

Bu memeli Mb sırasıyla iki sentetik peptidler (MKASEDLKKHGNTVLC ve AIIHVLHSRHPAEFGC) tanıyan, iki IgG 1 mAb (CGF5H9 ve CSF1H13) geliştirildi ve bu memeli Mb hızlı tespiti için yapılan bir sandviç tipi koloidal altın immünokromatografik test şeridi oluşturmak için kullanıldı. Şekil 2, CGF5H9 yaklaşık 17 kDa'lık tahmini bir moleküler ağırlığında tek bir boyanmış bandın olarak, deniz memelileri ve diğer memelileri te...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

taşıyıcı proteine ​​konjüge edilmiş sentetik bir peptidin kullanımıyla kognat proteine ​​kıyasla önemli ölçüde daha etkilidir. mAb bilinen göreceli yerle epitopları kullanılarak geliştirilmiştir, çünkü sandviç temelli bir yöntem için, bu çalışmada iki mAb hedef antigen epitopu ile birbirlerinin etkileşime müdahale olası değildir. Ayrıca, doğal proteinin, sentetik peptit bağı ile bağışıklaştırılan farelerin antikor arasında tepkime nativ protein ve doğal proteinin 19 üretilen antikorun arasındaki reaktivite da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tayvan Deniz Memelileri Derneği, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Deniz Biyolojisi ve Deniz Memelileri Araştırma Merkezi, Farglory Okyanus Parkı ve Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi'ndeki meslektaşlarımıza örnek toplama için teşekkür ederiz. Bu proje, Tayvan Tarım Konseyi'nden (100AS-02.1-FB99) WCY'ye hibe ile finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfat tamponlu salinAMRESCOJ373
Protein G HP SpinTrap GE  Sağlık Hizmetleri28-9031-34Protein G Sefaroz
IsoStrip Fare Monoklonal Antikor İzotipleme KitiRoche11493027001İzotipleme Şeritleri içeren spin kolonu, alt sınıfa ve hafif zincire özgü anti-fare-Ig antikorları ile önceden kaplanmıştır
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Nitroselüloz membranWhatmanZ613630
Antikoru Engelleyici Çözüm LTK BiyoLaboratuvarlarıNumunelerde spesifik olmayan IgG'nin spesifik olmayan bağlanma etkileşimlerini en aza indirmek
için BCIP/NBT fosfataz substratı KPL50-81-00
Protein Dedektörü HRP Microwell Kiti, Anti-FareKPL54-62-18
Nunc İmmün Plakası MaxiSorp ELISA plakasıTermo  Fisher ScientificEW-01928-08
Multiskan  EX ELISA okuyucu Termo  Elektron  Corporation51118170
Kolloid altın (40 nm) çözeltisi REGA Biyoteknoloji A.Ş.40-50 nm immünostrip,
Sığır serum albüminiGibco15561-020
Hızlı test, immno-strip yazıcıREGA biyoteknoloji A.Ş.AGISMART RP-1000 Yalnızca araştırma ve geliştirme amaçlı küçük ölçekli immünoplast üretimi için uygundur
Şerit bileşenleri (NC membranlar, numune pedleri (# 33 cam, S & S), eşlenik pedler (#16S, S & S) ve emici pedler (CF6, Whatman))REGA biyoteknoloji A.Ş.
Freund' s adjuvan ve eksik Freund' s adjuvan Sigma-AldrichF5881, F5506yağda su emülsiyonlarını üretmek için kullanılır
;SDS-PAGE Coomassie
SDS-PAGE jellerinde protein boyama
Laemmli numune tamponu ve β-merkaptoetanolBio-Rad1610737, 1610710SDS-PAGE jellerine yüklemeden önce protein örneklerini seyreltin
için uygundur, , Akrilamid immünojenleri, jel tamponu, amonyum persülfat (APS), tetrametiletilendiamin (TEMED) parlak mavi R-250 Bio-Rad 1610436 için Protech Jel hazırlama

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Colloidal Gold Immunochromatographic Test StripCetacean Myoglobin DetectionMonoclonal Antibody DevelopmentPeptide Sequence AnalysisWestern Blot AnalysisDot Blot AnalysisIndirect ELISA ScreeningMuscle Sample HomogenizationNitrocellulose Membrane AssemblyRapid Field Detection

İlgili makaleler