Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Summary

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Abstract

Bir bitkinin hücre yüzeyi, çevresel ipuçlarını algılamak için kullandığı arayüzdür; zar trafiği ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi gibi hücre biyolojik değişiklikleriyle yanıt verir. Bu tür hücre içi olayların gerçek zamanlı ve yüksek çözünürlüklü görüntü analizi, bitki hücre biyolojisinin moleküler düzeyde anlaşılmasını artıracaktır. Değişken açılı epifloresan mikroskobu (VAEM), bitki hücresi yüzeyindeki floresan etiketli proteinlerin yüksek kaliteli, hızlandırılmış görüntülerini sağlayan yeni bir tekniktir. Bu makalede, VAEM numune hazırlama, VAEM optik sisteminin ayarlanması, film yakalama ve görüntü analizi için pratik prosedürler açıklanmaktadır. VAEM gözlemine bir örnek olarak, PATROL1 dinamikleri hakkında temsili sonuçlar sunulmaktadır. Bu, Arabidopsis thaliana'nın stoma kompleksindeki plazma zarlarına proton pompası verilmesinde rol oynadığı düşünülen stoma hareketi için gerekli bir proteindir. A. thaliana kotiledonlarındaki koruyucu hücrelerin ve yardımcı hücrelerin VAEM gerçek zamanlı gözlemi, floresan etiketli PATROL1 birkaç saniye boyunca plazma zarları üzerinde nokta benzeri yapılar olarak göründüğünü ve daha sonra kaybolduğunu gösterdi. VAEM film verilerinin Kymograph analizi, nokta benzeri yapıların varlığının zaman dağılımını ('kalma süresi' olarak adlandırılır) belirledi. VAEM'in kullanımı bu örnek bağlamında ele alınmıştır.

Introduction

Plazma zarı ve hemen bitişiğindeki sitoplazma da dahil olmak üzere bitki hücresi yüzeyi, bir bitki hücresinin hücre dışı ortamdan gelen biyotik ve abiyotik ipuçlarını algılamasının ve entegrasyonunun ana bölgesidir. Bu ipuçlarına yanıt olarak, plazma zarı proteinleri ve kortikal hücre iskeleti dahil olmak üzere hücre yüzeyi bileşenleri, saniyeler ila^1-4 dakika arasında bir zaman ölçeğinde dinamik değişikliklere uğrar. Bu nedenle, hücre yüzeyindeki floresan proteinlerin gerçek zamanlı ve yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi, bir bitkinin moleküler düzeyde çevresel ipuçlarına verdiği tepkileri aydınlatabilir.

Konfokal lazer tarama mi....

Protocol

Fidan 1. Hazırlık

1. Tohum sterilize edin.
   1. Ve 1 ul% 10 Triton X-100 500 ul steril su: 500 ul NaClO (% 5.0 mevcut klorin) eklenerek sterilizasyon solüsyonu hazırlayın.
   2. Yeri yaklaşık 10 transgenik A. Bir 1.5 ml tüp içine GFP PATROL1 ⁸ taşıyan thaliana tohumları.
   3. 1 ml% 70 etanol solüsyonu ekleyin ve beş kez ters yüz edilerek iyice karıştırın. 1 dakika boyunca bekletin.
   4. Tohumlar tüpün dibine çöker gözlemleyin. Temiz bir laminer akış kabininde, yavaşça bir mikropipet kullanılarak% 70 etanolü çıkarmak ve 1 ml sterilizasyon çözeltisi ilave edilir. Beş kez tersini İyice karıştırın ve 5 dakik....

Results

Bu video makalede, A. GFP-PATROL1 ve VAEM gözlem için protokollerde yer thaliana kotiledon stoma karmaşık hücrelerin sağlanmaktadır. Gökyüzü açılan montaj A. VAEM hazırlıkları hava kabarcıklarının oluşumunu azaltmaya yardımcı olabilir basit bir hazırlık yöntemi thaliana kotiledonları (Şekil 1). Giriş lazer ve / veya VAEM için numunelerin z-konumlandırma Overtilting belirsiz bir görüntü sağlayacaktır. Eğer bu gerçekleşirse, bu Epifloresans aydınlatma tarafından değerle.......

Discussion

Bu video makalede, protokoller izlenmesi ve Arabidopsis thaliana'nın stoma kompleksi üzerine GFP-PATROL1 noktaların dinamik davranışını ölçmek için verilmiştir. Burada gösterildiği gibi, VAEM gözlem bitki hücre yüzeylerinin canlı görüntüleme için güçlü bir araçtır. Son derece hassas EM CCD VAEM optik bir nispeten zayıf uyarım lazer kullanımına izin verir, çünkü GFP PATROL1 izlenmesi için kullanılan deney koşulları altında, bir video yakalama 1 dakika için kullanılan numune çok az floresan ışıkla ağartma var.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ters mikroskop	Olympus	IX-73
TIRF ünitesi	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objektif lensi	Olympus	UAPON 100 ve zamanları; OTIRF	NA = 1.49
Lazer açı kontrol kutusu	Chuo Seiki	QT-AK
Optik olarak pompalanan yarı iletken lazer	Tutarlı	Safir TM < / sup> LP USB 488-20 CDRH Lazer
510 – 550 nm bant geçiren filtre	Olympus	U-FBNA
EM CCD kamera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount kamera büyütme değiştirme ünitesi	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph yazılımı	Moleküler Cihazlar	MetaMorph sürüm 7.7.11.0
TIRF mikroskopi kılavuzu	Olympus	AX7385	Talimatlar: Toplam İç Yansıma Aydınlatma Sistemi (24 Ağustos 2012'de Japonya'da basılmıştır)
Daldırma yağı	Olympus	Daldırma Yağı Typr-F	ne = 1.518 (23 derece)