Yöntem makalesi

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

DOI:

10.3791/53456

⸱

2 Nisan 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo görüntüleme, hücresel ve hücre altı yapıların dinamik davranışlarına doğal bağlamlarında benzeri görülmemiş bir erişim sağlar. Memeliler gibi daha yüksek omurgalılarda bu tür görüntüleme deneylerinin yapılması genellikle incelenen sisteme cerrahi erişim gerektirir. Embriyonik ve larva zebra balıklarının optik erişilebilirliği, bu tür invaziv prosedürlerin atlatılmasına izin verir ve sağlam organizmada görüntülemeye izin verir. Gerçekten de, zebra balığı artık çoğalmadan göçe ve farklılaşmaya kadar çok çeşitli gelişimsel bağlamlarda in vivo mikroskopi kullanarak dinamik hücresel davranışları görselleştirmek için iyi kurulmuş bir modeldir. Daha yeni bir gelişme, mitokondriyal kaçakçılık ve sentrozom dinamikleri dahil olmak üzere hücre altı olayları incelemek için zebra balığının artan kullanımıdır. Bu hücre altı yapıların floresan proteinler tarafından genetik olarak etiketlenebilmesinin göreceli kolaylığı ve bunları görüntülemek için ışık mikroskobu tekniklerinin kullanılması, zebra balığını in vivo bir hücre biyolojisi modeline dönüştürüyor. Burada, organelleri floresan olarak etiketleyen, mitokondri ve sentrozomları spesifik örnekler olarak vurgulayan genetik yapılar oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Ekspresyonu belirli hücre tipleriyle sınırlamak ve geçici olarak eksprese eden ve stabil transgenik balıklar oluşturmak için protokoller sağlamak için iki parçalı Gal4-UAS sistemini birden fazla konfigürasyonda kullanıyoruz. Son olarak, hücre altı dinamiklerini görüntülemek için en uygun ışık mikroskobu yöntemlerini seçmek için yönergeler sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo görüntüleme en fizyolojik bağlamda hücresel davranışları doğrudan görselleştirme sağlar. Zebra balığı embriyolarının, onların hızlı ve dış gelişme ve floresan etiketleme izin genetik araçları zengin bir dizi şeffaflık tüm anahtar gelişimsel olayların dinamiklerini aydınlatmak için in vivo mikroskopi artan kullanımına katkıda bulunmuştur. Zebra balığı sinir sistemi gelişiminin görüntüleme çalışmaları, örneğin büyük ölçüde nöral progenitör hücrelerin davranışları ve sonraki göç, farklılaşma ve devre entegrasyonu 1-8 da dahil olmak üzere kendi döl kader bilgimizi genişletti var.

Sahne şimdi bu hücresel davranışları altında yatan hücre içi dinamiğini incelemek için ayarlanır. Nitekim, Zebra balığı zaten in vivo hücre biyolojisi araçları olarak istismar ediliyor. Golgi 15, mitokondri 9-11 görselleştirmek için artık mümkün 2,8,12-14 sentrozomMikrotübül 4 ve aktin 16 hücre iskeleti, 17 endozom-lann ve in vivo Zebra balığı embriyolarının diğer hücre içi yapılar arasında, 1,18 apikal membran komponentleri karmaşık. Şimdiye kadar, bu organellerin işlevi hakkında bilinenlerin çok kültürlü hücrelerde davranışlarını inceleyerek geliyor. In vitro çalışmalar, hücre biyolojisi içine muazzam bir fikir vermiştir ederken, kültür hücreleri tamamen in vivo durumun karmaşıklığını temsil etmemektedir ve bu nedenle zorunlu olarak işlev ve in vivo hücre içi organellerin dinamiklerini yansıtmak zorunda değildir. Zebra balığı embriyolar hücre içi dinamikleri incelenerek in vivo alternatif olarak uygulanabilir bir teklif.

Omurgalılar olarak, zebra balığı, memeli türlerde bulunan kişilerce homolog olan bir çok organ sistemini (örneğin, nöral retinanın) sahiptirler. Ayrıca, Zebra balığı embriyolar giderek insan hastalıkları 19,20 modellemek için kullanılmaktadır , centrosomal fonksiyonu (örneğin, mikrosefali 21 ve Leber'in konjenital amarozu 22) ve mitokondriyal fonksiyon (örneğin, Parkinson hastalığı 23, 10,24 ve Barth sendromu 25 tauopatıler) ile ilgili olanlar da dahil olmak üzere. hücresel ve hücre içi düzeyde in vivo görüntüleme bu durumlarda bu patolojik durumları altında yatan hücre biyolojisi daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Burada anlatılan yöntemlerin genel amacı in vivo ışık mikroskobu kullanarak Zebra balığı embriyolarının içinde organelleri ve diğer hücre içi yapıları araştırmak için kapsamlı bir rehber sunmaktır. In vivo hücre içi yapıları görselleştirme ve izleme dahil tüm iş akışı açıklanmıştır - genetik etiketleme yaklaşımlarından, geçici üreten ifade ve istikrarlı transgenik balık, ve nihayet geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmesi için. Bu yordam, her daedures sayıda zebrabalıkları laboratuvarlar tarafından kullanılır, açıklanan protokoller optimize edilmiş ve hücre içi yapıların dinamiklerini araştırmak için aerodinamik vardır. Burada açıklanan çalışmanın iki özel yönleri söz eder: İlk olarak, spesifik hücre tiplerinde genetik etiket organellere çoklu yapılandırmalarda Gal4 UAS sentezleme sisteminin kullanılması. İkinci olarak, in vivo görüntü hücre içi yapılara geniş alan ve konfokal mikroskopi doğrudan karşılaştırılması.

Zebra balığı genetik etiket organellerin ve diğer hücre içi yapılara güncel yaklaşımlar ya yapmak promotör elemanları doğrudan füzyon proteinleri 9,14,15. In vitro transkripsiyonu şapkalı RNA sonuçları ifadesini tahrik başlıklı mRNA 1,4,8 veya DNA bazlı yapıların kullanımı hızlı ve geniş anlatım, o ancak doku-spesifik değildir. başlıklı RNA seyreltilmiş veya düşer Buna ek olarak, ifade seviyeleri zamanla azalır. RNA Böylece kullanım bazlı(Post-gübreleme genellikle en fazla 3 gün) gelişiminde daha sonraki aşamalarında organel dinamikleri sınırlı incelemek için oluşturur.

Bu sınırlamalar ifade mekansal ve zamansal kontrolünün spesifik promotör unsurlar tarafından belirlenir, DNA konstruktları kullanılarak aşılabilir. DNA bazlı yapılar transgen sentezleme seviyelerine Gal4 UAS sistemi önemli gelişmeler bağlamında kullanıldığı zaman 26,27 görülmektedir. raportör genler Gal4-bağlanma yukarı aktivasyon sırasının (UAS) akış aşağısında klonlanmış ise, bu iki parçalı sentezleme sisteminde, hücre tipi özel promotör elemanları, bir transkripsiyonel aktivatör Gal4 ekspresyonunu tahrik. Uygun Gal4 sürücüleri UAS muhabir birleştirerek, ifadesi farklı promoterler arkasında belirli bir ifade şablonu, istenen her zaman haberci genlerin klonlanması için ihtiyaç engellemeyi, spesifik hücre tipleri ile sınırlı olabilir. Ayrıca, birden fazla UAS haberci genlerin ekspresyonu olabilirTek bir Gal4 aktivatörü ile tahrik. Gal4 UAS sistemi böylece hücre içi etiketleme için çok yönlü ve esnek genetik bir yaklaşım sağlar.

Geniş alan ve konfokal mikroskoplar çoğu laboratuarların workhorses. Geniş alan sistemleri, tipik olarak bir ışık kaynağı olarak bir ark lambası kullanmak ve hafif yolunun sonuna yerleştirilir hassas bir kamera ile yayılan ışığı algılar. dışı odaklanan ışık kalın örneklerde bir odak bilgi gizler gibi bu görüntüleme yöntemi, tipik olarak, ince numune ile sınırlıdır. Konfokal mikroskoplar bunların odak (yani, "optik kesit") 28 üzerinden köken olanlar üzerinde odak düzlemi kaynaklanan sinyalleri lehine inşa edilir ki geniş alan sistemlerden farklıdır. optik olarak kısımlara elde etmek için, bir iğne deliği nokta ışık kaynağı için bir konjügat pozisyonda emisyonu yolu yerleştirilir. Lazer ışığı kaynakları olarak kullanılmaktadır ve sinyal foto-çoklayıcı tup (PMT) ile tespit edilir. Pratik olarak, bir lazerkiriş numune üzerinde nokta-nokta ve her nokta (piksel) floresan emisyon PMT tarafından tespit edilir kaydırılan.

Burada görüntü hem mikroskopi yöntemleri doğrudan bir karşılaştırma sağlamak için geniş alan ve konfokal mikroskopi her ikisini de kullanarak zebrafish embriyolar yaşayan aynı hücre içi yapılar. Bu tür karşılaştırmalar sağlama temel amacı, eldeki belirli bir soru için en uygun mikroskopi tekniği seçimi için kurallar sunmaktır.

mitokondri ve sentrozom Gal4 UAS tabanlı genetik etiketleme gösteren Burada anlatılan yaklaşımları kullanarak. Bu organeller her görüntüleme yönteminin uygunluğunu göstermek için geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanılarak sinir sistemi ve kas hücrelerinde farklı hücre tipleri içinde görüntülenmiş. Burada açıklanan yöntemler kolayca yaşayan zebrafish embriyo diğer organelleri ve hücre içi yapıları araştırmak için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Yukarı Bavyera (Münih, Almanya) hükümeti, yerel yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

1. Etiketleme Organeller ve diğer Subselüler Yapılar

NOT: Burada genetik muhabir floresan etiketi sentrozomlar, mitokondri ve hücre zarları tarif olduğunu oluşturur.

  1. Floresan sentrozom ve mitokondri etiketlemek füzyon proteinleri üretmek için klasik klonlama yöntemleri 29 kullanın. Bu cetn4-YFP oluşturmak için sarı floresan proteini gibi bir floresan protein 2 (FP) ile çerçeve zebra balığı centrin4 (cetn4) kodlama dizisini klonlama. Böyle mitoCFP 9-11 oluşturmak için Mavi floresan protein olarak çerçeve bir FP ile sitokrom c oksidaz alt birimi VIII mitokondriyal hedefleme dizisi Clone.
  2. zebraf spesifik hücrelere (cetn4-YFP ya mitoCFP) füzyon proteinlerinin ekspresyonunu sınırlamak içinISH embriyo (örneğin nöronlar ve kas hücreleri) bipartit Gal4 UAS sentezleme sistemi 26,27 kullanımı. Önce bir UAS raportör yapıyı oluşturmak. Gal4 bağlayıcı UAS kasetin aşağı bir UAS ifade vektörü içinde füzyon proteini, klonlamak için geleneksel yöntemleri kullanın sazan 26,27,30 ve minimal promotör (E1B bazal promotör (varyantları 14x UAS 1x aralığı, Tartışma bakınız) cetn4-YFP ve UAS: gen βactin) ve UAS oluşturmak mitoCFP.
    NOT: UAS muhabiri hazırlamak için ek elemanlar klonlanmış gereken kararlı transgenik hat üretimi için inşa (aşağıda 3'e bakın)
  3. sentrozom ya da mitokondri etiketli hangi hücresel içeriği görselleştirmek için UAS muhabiri olan hücre zarları hekimleri tarafından etiketli inşa oluşturur. Hedef çerçeve, bir FP (palmitoillenme alanlarına ihtiva eden) zebra balığı GAP43 ilk yirmi amino asidi Clone bu AP hücre zarı (memFP) 31,32 için.
  4. Obtain, sürücü konstruktları ve transgenik çizgiler, hücre tipi özel yükseltici elemanları kopyalama aktivatörü Gal4 VP16 27 Gal4FF 33 veya KalTA4 30 ekspresyonunu tahrik.
  5. UAS haberci (nöronlar ve kas hücreleri gibi) istenen özel hücre tipine ifade sınırlamak için, uygun bir sürücü yapısı ile inşa birleştirin. Bunu yapmak için Gal4 sürücüsü co-enjekte ve (ayrıntılı talimatlar aşağıda 2 bakınız) balık ifade geçici oluşturmak için UAS muhabiri döllenmiş yumurta tek hücreli aşamada oluşturur. Alternatif olarak, (ayrıntılı talimatlar aşağıda 3'e bakınız için) UAS muhabiri istikrarlı transgenik çizgi oluşturmak ve her iki transgenlerin taşıyan yavrular üretmek için bir Gal4 sürücü istikrarlı transgenik hattına çapraz.
    NOT: bir GAL4 sürücüsü stabil bir transgenik çizgiden ve bir GAL4 sürücü fertiliz içine inşa döllenmiş yumurta içine UAS raportör yapı / s enjekte edilmesi de mümkündürBir UAS muhabiri stabil bir transgenik çizgiden ed yumurta.
  6. A. Çoklu, ayrı UAS muhabiri yapıları (örneğin, UAS: mitoCFP ve UAS: memYFP co Gal4 UAS sistemi kullanarak birden çok farklı füzyon proteinleri birlikte ifade etmek için, aşağıdaki konfigürasyonlarda birinde bir Gal4 sürücü ve UAS muhabiri / sn kullanın bir Gal4 sürücü yapısıyla -injected) 10, tek bir muhabir B. Çoklu UAS kasetleri (örneğin, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C Çift yönlü UAS muhabiri (örneğin UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Şekil 1).

figure-protocol-1
Gal4 UAS sistemi kullanarak füzyon proteinleri-express co 1. Stratejileri Şekil.
(A) çok sayıda, ayrı UAS odaklı Cephe: birden fazla füzyon proteinlerinin birlikte ifadesi, çeşitli konfigürasyonlarda UAS raportör kasetleri kullanılarak elde edilebilirructs, (B) tek bir yapı ya da (C) tek bir yapı üzerinde iki yönlü UAS kaset üzerinde birden fazla UAS kasetleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Balık ifade Geçici üret

NOT: Aşağıdaki önce yayınlanmış protokoller 34,35 bir uyarlamasıdır. Temel bir enjeksiyon ayar 12X bir büyütmede aralığı yukarıya Stereomikroskopta bir mikropipet tutucu bir mikromanipülatör ve hava basınç kaynağı içermelidir. zaman 2,1-2,5 öncesinde hazırlayın:

  1. Yumurta mikroenjeksiyon odaları hazırlamak için, su içinde bir% 1.5 çözeltisi (ağırlık / hacim) agaroz hazırlayın. agaroz tamamen eriyene kadar su ve mikrodalga agaroz toz ekleyin. Bu çözeltiye sahip bir petri kabı (100 x 15 mm) doldurun.
    1. Agaroz çözüm appr soğumaya izin veroximately 45 o C, erimiş agaroz yüzeyi üzerine (6x 50 mm, 1.5 mm, 1 mm, derin, geniş ve 3 mm aralıklı, uzun sırtlar ile 40 mm x 66 mm), bir plastik mikroenjeksiyon kalıp yerleştirme dikkat değil çekmeden önce arayüzde kabarcıklar tanıtmak.
    2. Agaroz setleri sonra, 4 o CO / N mağaza. Dikkatlice spatula kullanarak kalıp çıkarmak. 4 o C'de, bir defada birden fazla mağaza mikroenjeksiyon odaları hazırlayın ve birkaç hafta boyunca tekrar tekrar kullanın.
  2. Uzun bir sap 36 ile cam enjeksiyon kılcal oluşturmak için bir mikropipet çektirmesi kullanın.
    Not: Enjeksiyon kılcal üretmek için kullanılan özel ayarlar ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Enjeksiyon kılcal vaktinden çekilir ve kullanımdan önce depolanabilir.
  3. üreticinin kılavuzuna göre bir spektrofotometre kullanılarak mikroenjeksiyon için plazmid DNA (Gal4 sürücü ve UAS muhabiri yapıları) konsantrasyonunu ölçün. tedbir60, 260 nm ve 280 nm'de (A260 / 280) absorbans oranı. nükleaz içermeyen su içinde 100 ng / ul nihai konsantrasyona kadar DNA seyreltilir.
    NOT: ~ 1.8 A A260 / 280 oranı saf DNA anlamına gelir. Enjeksiyon için kullanılacak plazmid DNA saflaştırılması (silis bazlı bağlayıcı matris göre), ticari bir kit kullanılarak düşünün. Plazmid DNA, toksisite önlemek için yüksek kalitede olmalıdır.
  4. , (30x stoklar 0.33 ul) Danieau çözeltisi (5 ng / ml ila 20 bir son konsantrasyon için 100 ng / ul stok 0.5 ila 2.5 ul), DNA birleştirerek fenol kırmızısı (0.25 ul 10 ul enjeksiyon karışım hazırlayın 10 ul toplam hacmine bağlı) ve nükleaz içermeyen su.
    NOT: Ampirik uygun ifadeyi veren DNA'nın konsantrasyonunu belirlemek. Gal4 sürücü ve UAS raportör plazmid birlikte enjekte edilmesi gerekir. Sadece Gal4 sürücü veya UAS muhabiri plazmid vahşi tip döllenmiş yumurta içine enjekte edildiğinde hiçbir ifade doğmak olacaktır. t Ancak varsaO yumurta bir veya birkaç UAS muhabiri plazmidler yeterli enjeksiyonu sonra Gal4 sürücü hattı vardır döllenmiş. UAS raportör hattı microinjecting Tersine, sadece Gal4 sürücüsü plazmid enjekte edilmesi gerekmektedir. Fenol Kırmızısı büyük enjeksiyon görselleştirmek için yardımcı olabilir Son olarak, aynı zamanda, bir flüoresan bileşiği, kendisidir. yeterince bu zamana kadar seyreltilmiş olabilir gibi görüntüleme 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) önce planlanan nedenle, Fenol Kırmızısı görselleştirme hekimlerini belirsiz olabilir.
  5. enjeksiyonlar önce akşam planlanan erkek ve damızlık dişi zebrafish (genellikle 5 ila 10) birçok çiftleri ayarlanır. bir ızgarah alt ve erkek ve kadın balık ayırmak için çıkarılabilir bölücü içeren bir ekleme ile üreme tankları kullanın.
    NOT: Erkek ve kadın Zebra balığı genellikle vücut şekli ile ayırt edilebilir. kadın bir ventral çıkıntılı karın sergileme eğiliminde iken Erkekler ince olma eğilimindedirler. Erkekler ayrıca sarı-kırmızı col sahip olma eğilimindedironların ventral karın alanda oring.
  6. DNA enjeksiyonları hemen önce, erkek ve dişi çiftleşmek için izin bölücüler çıkarın. Yaklaşık 15 bölücü çıkardıktan sonra 30 dakika kadar, tankın alt kısmındaki yumurta kontrol edin. Yeni bir üreme tankına bir balıkçı ağı kullanılarak yetişkin balık aktarın.
  7. (Örneğin, bir plastik çay-süzgeç) bir elek içine üreme tankının dışına yeni koydu döllenmiş yumurta içeren, su dökün. Danieau çözeltisi içeren bir sprey şişesi kullanılarak elek yumurta yıkayın. petri üzerine elek ters çevirin ve tüm yumurtaları (erişkin balık tipik olarak 50 ila 200 yumurta üreme başına çifti) kurtarmak için Danieau çözümü ile bir sprey şişesi kullanmayın.
  8. Bir Microloader pipet kullanarak, DNA enjeksiyon karışımı ile çekilmiş enjeksiyon kılcal geri doldurun. pe bir mikropipet oluşturmak için forseps kullanarak, bir stereomikroskopta görsel kontrol altında, bir micromanipulator sahibinin içine enjeksiyon kılcal monte edin ve ucu Döşemenetrate koryon ve hücre sitoplazma DNA uygun bir hacimdeki mümkün olurken.
    NOT: Enjeksiyon kılcal ucu ampirik olarak tespit edilmelidir kesilmiş ve yumurta enjekte ederken en iyi şekilde değerlendirilecektir hangi derecesi.
  9. Enjeksiyon için DNA miktarını belirlemek için, mineral yağ içinde, enjeksiyon çözeltisinin bir damla boşaltın. Bir kalibrasyon mikrometre kullanılarak damla yarıçapı (r) ölçün ve hacmini (4/3 π r 3) hesaplayın. Enjeksiyon basıncı ve / veya her bir püskürtme palsının süresini ayarlayarak hacmi modüle eder.
  10. Plastik bir pipet kullanarak, mikroenjeksiyon odasının siperlerde içine tüm toplanan yumurta (yukarıda 2.7 tipik 50-200) aktarın. Bir stereomikroskopta görsel kontrol altında, hücre sitoplazma (şeffaf) ve yumurta sarısı (yoğun, şeffaf olmayan) kolayca tespit edilebilir ve böylece yumurta yönlendirmek için forseps kullanabilir.
  11. Bir stereo görsel kontrol altındaMikroskop, enjekte edilen hacim (1 NL 2) hücre hacminin yaklaşık% 10'una karşılık gelir sağlamak için özen, döllenmiş yumurtanın hücre sitoplazması içine DNA enjekte edilir.
    NOT: Enjekte hacmi görselleştirme DNA çözüm yardımcıları Fenol kırmızı.
  12. Enjeksiyondan sonra, Danieau çözümünü içeren bir sprey şişesi ile onları yıkama enjeksiyon kalıp siperlerinden yumurta gevşetin. Daha sonra plastik bir transfer pipet kullanarak taze bir petri kabına yumurta transferi ve bir 28.5 o C inkübatör korumak.
  13. enjeksiyonlar mikropipet penetrasyon veya DNA karışımı sırasında sürekli fiziksel hasar sonucu ya yüksek ölüm oranlarına katkıda olup olmadığını belirlemek için kontrol olarak un enjekte yumurta koruyun.
    NOT: Yüksek mortalite oranları aşağıdaki enjeksiyonlar nedeniyle Contamina ile aşırı yüksek DNA konsantrasyonu ya da enjeksiyon hacimleri ve / veya plazmidler gibi birçok faktöre, bağlı olabilirNTS. düşük kaliteli DNA preparatlarından toksısıteyı önlemek için, (silis bazlı bağlayıcı matris göre), ticari kitler de kullanılabilir.
  14. enjeksiyonlar aşağıdaki Düzenli aralıklarla, döllenmemiş yumurta ve ölü veya hatalı embriyolar için ekran ve bu atmak için Stereomikroskopta kullanın.
    NOT: döllenmemiş olarak, döllenmeden sonra tek hücreli aşamada birkaç saat gibi görünen yumurta görmeyin. Böyle bir tehlikeye ön-arka gövde eksenleri olarak brüt anatomik defektler tarafından hatalı biçimlendirilmiş embriyolar belirleyin. Bir koryon içinde amorf malzeme embriyo gelişim aşamalarında ile devam öldü olmadığını göstermektedir. Microinjected edildi embriyolar gelişiminin normal ders anatomik atlaslar 37 danışmak tabi olmadığını tespit etmek için.
  15. Pigment oluşumunu engellemek için 10 ile 24 hpf arasında 1x 1-fenil 2-tiyoüre (1xPTU) içeren Danieau çözümü için bir plastik transfer pipet kullanarak embriyolar aktarın. Danieau çözümü cont embriyolar koruyunDeney süresince PTU Tahliye.
    Not: melanophores ek olarak, cilt yüzeyinde İridoforlar görüntüleme için sorunlu olabilir. PTU iridofor oluşumunu inhibe etmese de, bu Roy Orbison (Roy) halinde iridoforlardan sayılarında azalma ile mutan çizgileri vardır ve 38 kullanılabilir.
  16. Embriyolar yumurtadan sonra, chorions atmak ve Danieau çözümünü PTU içeren alışverişinde (genellikle ikinci veya üçüncü gün sonrası döllenme, 2 ya da 3 dpf üzerine).
    Not: Bu adımların embriyo orta kaliteli ve sağlıklı embriyoların canlılığı sağlamak için önemlidir.

3. Kararlı Transgenik Hatları oluşturun

Not: Kararlı transjenik etkin Tol2 transpozon sistemi kullanılarak elde edilebilir. ilgi dahilindeki transgen ihtiva eden bir Tol2 transpozon vektörüdür mRNA fertilize içine transposaz enzimi kodlayan ile birlikte enjektetek hücreli aşamada d yumurta. Enjekte mRNA 'dan türetilen transposase protein genomu 39 içine transpozon vektörü ve entegrasyondan transgen kasetinin eksizyonu katalize eder.

  1. Transgen muhabiri kasetini Clone (örneğin, UAS: mitoCFP) Tol2 arasında 40 açıklandığı gibi şu anda zebrabalıkları toplumda kullanılan Tol2 vektörleri birinde terminal tekrarlar ters.
    Not: yükseltici elemanları ilgi alanı ile ilgili olmayan organ sistemlerinde AP ekspresyonunu tahrik eden bir seçilebilir kasetini içeren Tol2 vektörleri (örneğin, kalp 41 ya da lens 42) Gal4 transaktivasyon yokluğunda UAS raportör transgen hatları tarama için faydalıdır.
  2. (Silis bazlı bağlayıcı matris göre), ticari bir kit kullanılarak, enjeksiyon için kullanılmak üzere, plazmid DNA arındırmak. plazmid DNA toksisite önlemek için yüksek kalitede olduğundan emin olun.
  3. Bir kullanarak Tol2 transposaz kodlayan mRNA DeşifresiniBöyle PCS-TP 43 gibi uygun transkripsiyon vektörü. Kısaca, PCS-TP linearize ve şapkalı mRNA üretmek ve üreticinin protokolü takip etmek ticari kiti kullanın. RNases ile kirlenmesini önlemek için dikkat edin (örn pipet uçları ve tüpler RNAse ücretsiz kullanın). O C -80 ° C'de tek kullanımlık ve mağaza, 100 ng / ul'lik bir konsantrasyonda, RNA alikotu
  4. enjeksiyonlar sabahı, buz üzerinde transposaz mRNA bir kısım Çözülme. Transpozon DNA vektörünü (100 ng / | il 2 ul) karıştırın ve 1 mRNA (100 ng / | il 2 ul) transposaz: 1 oranında ve 10 ul toplam hacmi getirmek için RNaz içermeyen su, 6 ul ekle.
    Not: 20 ng bir konsantrasyon / ml her biri için tavsiye edilir, ancak en uygun konsantrasyon ampirik olarak belirlenmelidir. seyreltme için RNaz içermeyen su kullanın. DNA-RNA enjeksiyon karışımı ele eldiven kullanın ve m bozulmasını önlemek için enjeksiyon tüm dönem için buz üzerinde tutmakRNA.
  5. Yukarıdaki bölüm 2'nin ayrıntılı talimatlar kullanarak, tek hücreli aşamada döllenmiş yumurta içine DNA-RNA enjeksiyon karışımı enjekte edilir. Bir stereomikroskopta görsel kontrol altında transgenesis verimliliği en yüksek oranları için tek hücreli aşamada hücre sitoplazma hedef. Transgen ifadesi için ekrana hazır olana kadar 28.5 o C'de enjekte edilen embriyolar koruyun.
    NOT: PCR, daha önce 44 açıklandığı gibi Tol2 transpozazın verimliliği kontrol etmek için yapılabilir.
  6. flöresanlı bir mikroskop ve Okülerin kullanılarak transgenesis için bir petri ekran embriyolar.
    NOT: Seçilebilir kaset FP ifadesini görselleştirmek için mikroskop uygun filtre setleri kullanın (örneğin, kalp veya lens floresan) 2 ya da 3 dpf'e. (Kalp veya lens) ifadesi ile potansiyel transgenik embriyolar tespit ve yetişkinliğe bu embriyolar yükseltmek (F 0 nesil) kullanarak standartprotokolleri 45. 46 de tarif edildiği gibi alternatif olarak, PCR ile muhtemel transjenik embriyoları belirler.
  7. UAS muhabiri F kere 0 balık 2.5 olan - yaş 3 ay, F 1 nesil oluşturmak için yumurta elde etmek için transgenik olmayan vahşi tip balık onları (detaylar için 2.5 bakınız) çapraz. Alternatif olarak, bir F 1 nesil oluşturmak için bir Gal4 sürücü hattına UAS muhabiri F 0 balık çapraz. Son bahsedilen durumda, UAS odaklı transgen doğrudan ortada elde edilen embriyolar izlenebilir.
  8. Transgen veya seçilebilir kaset ifadesi için F 1 embriyo ekrana bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın.
    NOT: ifadesi daha sonra teyit edildiğinde transgen germline iletilecek söylenebilir. Transgenesis F 0 aşamada olmayan Mendel olduğunu. transgen ifade embriyo sayısı, bireysel clutche içinde büyük bir çoğunluğu küçük bir sayı değişebilirs. Farklı F 0 balık Transpozon entegrasyonu, farklı ekspresyonu ile sonuçlanan önemli ölçüde değişebilir. Bu nedenle ayrı alt hatları gibi farklı F 0 kurucularından F 1 balık korumak. F 1 balık transpozon entegrasyonları kararlı ve Mendel şekilde sonraki nesillere aktarır.
  9. Transgen taşıyıcılarını yeniden tanımlamak için ayrı tanklarda her bir F 0 balık koruyun.

4. Bir Dik Mikroskop üzerinde Görüntüleme Embriyolar hazırlayın

NOT: Burada anlatılan prosedürler uzun çalışma mesafesi su daldırma koni hedefleri ile dik mikroskoplar üzerinde görüntüleme için optimize edilmiştir.

  1. transgen ifadesi için embriyolar taranması için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın.
    NOT: Bir UAS muhabiri transgen ifadesi kullanılan özel Gal4 sürücü hattı bağlıdır. İstenilen exp dayalı görüntüleme deneyleri için seçin embriyolardışarı yansıması modeli.
  2. 1x propiltiourasil'in 1x Tricaine ile Danieau en tampon içeren ayrı bir petri plastik bir pipet kullanarak seçilen embriyolar aktarın.
    NOT: etiketleme (bir organ sisteminde sadece bir kaç hücreleri) agaroz embriyolar monte seyrek olduğunda (4.3 bakınız - aşağıya 4.7) yüksek büyütme hedefleri ile bir geniş alan mikroskobu kullanılarak transgen ifadesi için ve ekranı (aşağıda 5.1 bakınız). Tricaine balık anesthetizes saniye içinde etkili olmalıdır. Balıkların hareket etmesi değilse Tricaine bozulmuş olması muhtemeldir. Bu bozulma olası nedenleri 47 ışığa duyarlı olan Tricaine kötü depolama içerir.
  3. % 0.7 bir son konsantrasyona Danieau tamponu içinde düşük erime noktalı agaroz tozunun çözülmesiyle balık gömmek için agaroz hazırlayın. Kısım (1 mi) ve kullanımı için hazır olana kadar, 40 ° C de bir ısı blokunda tutun.
    NOT: Yüksek concentratAgaroz iyonları (% 1,5 kadar) aynı zamanda balık yerleştirmek için kullanılabilir.
  4. 1 ml kana Tricaine bir 20x stokunun 50 ul ve PTU bir 50x stok solüsyonu 20 ul ekleyin, düşük erime agaroz ve tüpün yan dokunarak iyice karıştırın. ısı bloğuna tüp dönün. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, yavaşça agaroz seyreltilmesi önlemek için mümkün olduğu kadar az bir sıvı aktarma agaroz içine birkaç (1-10) anestezi embriyolar pipetle.
  5. Bir plastik pipet transferi, bir cam alt petri agaroz küçük bir miktarı ile, tüm embriyolar kullanılması.
  6. nispeten hızlı çalışma, yansıması yapısına bağlı olarak, istenilen yönde embriyoları yerleştirmek için forseps kullanabilir.
    NOT: kendi tarafında Orient embriyolar retina veya Rohon-Sakal (RB) duyusal nöronlar görüntülü olmalıdır eğer.
  7. agaroz en az 15 dakika boyunca katılaşmaya izin verin. Agaro gömülü embriyolar kapsayacak 1xPTU ve 1xTricaine içeren Danieau en tampon eklemese. Görüntünün hazır olana kadar 28.5 o C'de bir inkübatör agaroz gömülü embriyoları içeren çanak yerleştirin.

5. Görüntüleme Hücresel ve Hücre alt yapıları Geniş alanı veya Konfokal Mikroskobu kullanılarak

NOT: Geniş alan mikroskopisi ve nokta-tarama konfokal mikroskopi görüntü floresan etiketli Zebra balığı embriyolarının için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir Tablo 1 ana avantajları ve her iki sistemin dezavantajlarını özetlemektedir.. Mikroskop aşamasında bir ısıtma odası kullanarak görüntüleme deney boyunca 28.5 O ° C'de, yukarıda 4'te tarif edildiği ve muhafaza da mikroskop her iki biçimi için, embriyolar agaroz monte edilmiştir. Önemli olarak, agaroz gömülü embriyolar ile bulaşık sıcaklık dalgalanmaları z-boyutunda sürüklenme yol gibi görüntüleme başlamadan önce 28.5 o C dengelenmeye bırakılır. Severa üzerinde (uzun süreli görüntüleme deneyler yaparkenl saat), tampon buharlaşmayı azaltmak için petri yemek üzerine pleksiglas kapak yerleştirin.

Geniş alan Nokta-tarama konfokal
Maliyet Nispeten ucuz Pahalı (yakl. 5x daha fazlası)
Fotoğraf-beyazlatma Düşük Yüksek. Örnek odak düzlemi üstünde ve altında lazer ışığına maruz bırakılır.
Fotoğraf-toksisite Düşük Yüksek (yukarıdaki Fotoğraf-beyazlatma bakınız)
Toplama hızı Hızlı Yavaş
Xy Çözünürlük Abbe kanunu Abbe kanunu (app geliştirilebilir% 40 çok küçük bir iğne deliğini kullanarak; in. Ancakçoğu ayarlar bu) küçük pratik uygulaması vardır
optik kesit yoksul Evet (iğne deliği büyüklüğü ile ayarlanabilir)
doku penetrasyonu Yüzeysel yapılara sınırlı (örneğin, Rohon-Sakal hücreleri veya kas lifleri) Embriyonun yüzeyinden 100 mm

Geniş alan ve nokta-tarama konfokal mikroskobu Tablo 1. Genel karşılaştırma

  1. Geniş alan mikroskopisi
    NOT: Burada kurallar uzun çalışma mesafesi su daldırma koni hedefleri ile dik geniş alan mikroskobu kullanarak zebrafish embriyolar görüntüleme için verilmektedir. Mikroskop soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış ve farklı flüorofor görselleştirmek için filtre setleri çoklu kanalların hızlı elde edilmesi için otomatik bir filtre tekerleği üzerine monte edilir.Görüntü edinimi μManager, açık kaynak kodlu bir yazılım paketi mikroskopi 48 tarafından kontrol edilir. RB duyu nöronlarında mitokondri görüntülenmesi için spesifik bir örneği temin edilmiştir. RB hücreler genetik olarak YFP hedeflenen membran kullanarak etiketli ve mitokondri (yukarıda 1.1 bakınız) CFP-etiketli vardır.
    1. Düşük erime kendi tarafında Dağı embriyolar agaroz yukarıda 4'te tarif edildiği gibi.
    2. Monte edilmiş balık ile çanak görüntüleme başlamadan önce mikroskop sahnede bir ısıtma odasında 28.5 o C gelmesini sağlayınız.
    3. düşük bir büyütme su daldırma-koni hedefi kullanın ve görüntü embriyonun yüzeyindeki bir alanı seçmek için mikroskop Okülerin bakmak.
      Stabil bir transgenik MitoFish raportör hattı, Tg (UAS E1B: mYFP, mitoCFP) ise: mde6, örneğin Huc bir sürücü hattı ile bağlantılı olarak kullanılır: Not Gal4 o zaman en RB nöronlar etiketli ve yoğun mes olarak görünürembriyo yüzeyi üzerinde nörit milleri H-çalışır. DNA mikro-enjeksiyon seyrek etiketleme elde etmek için kullanılır yapılarını (örneğin, duyu: mitoCFP ve UAS: UAS ile Gal4-VP16 MA-YFP), ekran embriyolar çift etiketli hücreleri tanımlamak için.
    4. mikroskop yazılımı (μManager 1.4) açın ve Kamera ayarları "altında. faiz (şimdiki örneğin YFP veya CFP) dalga boyu için doğru filtre setleri tanımlamak için" Yapılandırma ayarları "altında Aydınlatma ''" tıklayın "pozlama süresini giriniz uygun bir görüntü elde etmek için gerekli.
      NOT: "Aydınlatma Ayarları" önceden ayarlanmış yazılımının kurulumu sırasında kullanıcı tarafından ve μManager açarken yüklenir. yazılım filtre tekerleği kontrol etmek için yapılandırılmamış değilse, elle uygun konuma taret filtre tekerleği hareket ettirin.
    5. 40-100X büyütme arasında değişen uzun çalışma mesafesi su daldırma-koni hedefine değiştirin. seçmekEn yüksek sayısal açıklık (NA) sahiptir ve chromatically düzeltilir amaç (apochromat).
    6. görüş alanını seçmek için "Canlı" tıklayın: kök akson de RB nöron, görüntü mitokondriyal taşıma durumunda, hücre gövdesinden veya periferik çardak yayılan.
      NOT: Embriyonun kuyruk yüzgeci kat RB nöronların periferik milleri görüntü için ideal bir fırsat düz ve bu nedenle geniş alan mikroskobu ile tek bir çerçeve üzerinde yakalanabilir görüş geniş bir alan sağlar. Kuyruk yüzgeci kat petri altına paralel olacak şekilde, kesin bir dille yan mümkün olduğunca embriyo monte etmek önemlidir.
    7. bir görüş alanı seçtikten sonra, ImageJ menüsünde "dikdörtgen seçim" butonuna tıklayın ilgi alanları (ROI) bir bölgesini tanımlamak ve μManager penceresinde "ROI" tıklayın. görüntüleme için ROI seçtikten sonra, "Dur" linkine tıklayın ve ta için "Kaydet"ke YFP kanalının bir görüntü nevrit / s yerel morfolojisi kaydetmek için.
    8. Görüntü mitokondriyal taşıma tıklayın "Çok D ACQ." düğmesine basın. Ek pencere ( "Çok boyutlu Toplama") gözlemlemek ve zaman noktalarının sayısını yanı sıra, bu pencerede zaman noktaları arasındaki aralığı seçin. 0,3-1 Hz kare hızları kullanın. mümkün olduğunca veri noktaları gibi birçok toplamak için en az 10 dakika süreyle kayıtları yürütmek.
    9. "Çok boyutlu Toplama" penceresinde, ve maruz kalma süresi (bu örnekte mitokondri için CFP), "Kanallar" linkine tıklayarak ekleyebilir ve görüntüleme için dalga boyu tanımlar. Mitokondriyal ulaşım görüntüleme için 400 msn aşağıda maruz kalma süreleri tutun.
    10. otomatik olarak 'Dizin root' belirtilen belirli bir klasördeki dosyaları kaydetmek için, "seçeneği Çok boyutlu Toplama" penceresinde "Görüntüleri Kaydet" butonuna tıklayın. tim başlatmak için sağ üst köşedeki "Edinme" üzerine tıklayınE-lapse görüntüleme.
    11. time-lapse kayıt z boyutta herhangi bir sürüklenme telafi etmek için ise odağı manuel olarak yeniden ayarlayın.
      NOT: RB nöronlar mitokondriyal taşıma sürece 4 olarak saat görüntülü olabilir bu parametreleri kullanarak.
  2. mikroskopisi
    NOT: Burada kurallar dik Olympus FV1000 konfokal mikroskop ve uzun çalışma mesafesi su daldırma koni hedefleri ile görüntüleme için verilmektedir. mikroskop çok kanallı görüntüleme için izin birden fazla lazer çizgileri ve çeşitli dedektörler (konvansiyonel Proje Yönetim Ekipleri ve daha duyarlı galyum arsenit fosfür dedektörleri) ile donatılmıştır. Özel Referans Olympus Fluoview yazılımına yapılır. Ancak, burada tarif edilen görüntüleme parametreleri için diğer konfokal sistemlere kolaylıkla devredilecek olmalıdır.
    1. Yukarıda 4'te tarif edildiği gibi agaroz organ / yapısına uygun bir yönlendirme düşük erime Mount embriyolar, görüntülenecek.
    2. Monte balık ile çanak görüntüleme başlamadan önce mikroskop sahnede bir ısıtma odasında 28.5 o C gelmesini sağlayın.
    3. dik konfigürasyonda konfokal mikroskoplar uzun çalışma mesafesi su daldırma-koni hedeflerini kullanın. alınabilir floresan sinyallerin miktarını maksimize etmek ve en iyi çözme gücüne sahip NA mümkün olan en yüksek olan hedefleri seçin. Birden fazla kanaldan toplama görüntüleri chromatically düzeltilmiş hedefleri (apochromat) seçtiğinizde.
    4. mikroskop yazılımını açın ve mikroskop Okülerin yoluyla ilgi bölgeyi tanımlamak için sırasıyla ya iletilen ya da floresan ışık kullanmak "Trans lambası" veya "Epi Lamba" üzerine tıklayın.
    5. görüntü yığınlarını elde etmek için aşağıdaki tarama parametrelerini ayarlamak için yazılımı kullanın:
      1. "Toplama Ayarı" penceresinde görüntüleme için seçilen hedef açılan dow görünen hedefi eşleştiğini doğrulayınMevcut hedeflerin n menüsü.
        NOT: Bu, belirli bir amaç için herhangi bir ön hesaplanan parametreler (örneğin, yan ve eksenel çözünürlük, konfokal diyafram vb boyutu) doğru tutun ve güvenilir kullanılabilir sağlamaktır.
      2. Görüntü spesifik floresan protein (ler) uygun lazer çizgisi / s, uyarma ve emisyon dikroik filtreleri seçin. "Görüntü Alma Denetimi" penceresinde "Boya Listesi" butonuna tıklayarak bu yapın ve uygun fluorofor / s seçin. Alternatif olarak, el ile bu parametreleri ayarlamak için "Işıklı ve renklendiriciler" butonuna tıklayın.
        NOT: "Boya Listesi" butonuna seçeneği seçildiğinde, yazılım otomatik olarak uygun lazer çizgileri, uyarma ve emisyon dichroic filtreleri seçer ve uygun konfokal diyafram boyutunu ayarlar.
      3. "Toplama Ayarı" penceresinde, "Zoom" faktörü ve "Boyut asp ayarlamakGerekli piksel boyutu elde etmek için taranan görüntünün vb oranı "(yani, 512x512, 1024x1024 vb) en iyi. görüntülü yapıları çözmek ve böylece Nyquist örnekleme kriterlerinin aşağıdaki hedefin yaklaşık yarısı teorik çözünürlük olmak piksel boyutunu ayarla . "görüntü Alma Denetimi" penceresinde bilgi için sembolü ( "i") ile butonuna elde edilen görüntü tıklama piksel boyutunu belirlemek için.
      4. "Toplama Ayarı" penceresinde mümkün olan en hızlı (2 us / piksel) bir tarama hızını ayarlayabilirsiniz.
      5. 2 3 genellikle yeterli bir Kalman hat ortalaması baz "Görüntü Alma Denetimi" penceresi tıklayarak noise.A faktörü azaltmak için.
      6. spektrumları örtüşen florofor görüntüleme zaman sıralı tarama modunu seçin. Bunu yapmak için, "Görüntü Alma Denetimi" penceresinde "Sıralı" ve "Hat" a tıklayın.
      7. tipik (ilgili lazer çizgisi / s gücünü ayarlayan% 5'in altında). özel değerler deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir.
      8. Her kanal için dedektör ayarlarını yaparken sürekli olarak seçili bölgeyi taramak için "x4 Odak" renkli "XY Tekrar" veya "Odak x2" veya tıklayın. "HV", "Kazanç" ayarlayın ve gri değerlerin yüksek dinamik aralığı vardır görüntüler elde etmek için her bir kanal için "Offset".
        NOT: Bu ayarlar için belirli değerler ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. "HV", duyarlılığını değiştirme "Offset" için dedektör voltajı ayarlayan dedektörün çıkış sinyalini ayarlar ve "Kazanç 'sabit bir faktör dedektör çıkış sinyali çarpar.
      9. Ctrl + H altında doymuş tanımlayan bir look-up tablosu (HiLo) üzerinden elde edilen görüntüleri görselleştirmek için (mavi görünür) ve genellikle kaçınılmalıdır her ikisi de aşırı doymuş piksel (kırmızı görünür). İlgili lazer lin güç çıkışını yeniden değerlendirmekE / s ve dedektör ayarları.
        NOT: Yüksek lazer gücü ve dedektörün "HV" yüksek düzeyde kullanılması daha sinyale yol açacaktır. Yüksek lazer gücü ancak artan ağartma ve foto-toksisite yol açacaktır. "HV" Artan artan gürültüye yol açacaktır. Bu nedenle, bir uzlaşma lazer güç ve fotoğraf zararı önlerken gürültü kabul edilebilir seviyeleri ile görüntüler elde etmek için "YG" ayarlarken bulunması gerekmektedir (ayrıca bakınız Tablo 1).
      10. ilgi alanının üst ve alt limitleri odaklanarak tanımlı ses görüntüleri toplayın. hacmin üst ve alt limitlerde z yığın penceresinin "End Set" ve "Başlat Seti" set düğmelerinde "Acquisition Ayarı" penceresi tıklama yansıması. Verilen amaca z çözünürlüklü yarısı bir adım boyutu seçin (z çözünürlüğü ise örneğin., 2 mikron 1 mikron tercih). objectiv z-çözünürlüğünü belirlemek içine "Görüntü Alma Denetimi" penceresinde bilgi için sembolü ( "i") ile butonuna tıklayın.
      11. görüntülü hücre içi yapının dinamiklerine uygun bir zamansal frekansta z-yığınları toplamak için bir zaman serisi ayarlayın. "TimeScan" alt penceresinde z-yığınları ( "Aralığı" ') elde edilmelidir frekansı ve görüntüler ( "Num") elde edilmelidir sayısını girin.
      12. z-yığın ve zaman serisi elde edilecek onaylamak için "Görüntü Alma Denetimi" penceresinde "Derinlik" ve "Zaman" düğmelerini tıklayın. Nihayet zaman atlamalı görüntüleri elde başlamak için "xyzt" butonuna tıklayın.
      13. görüntü alımı tamamlandıktan sonra, yazılım arayüzü üzerinde "Done Serisi" gözlemlemek. Bunun üzerine tıklayın ve bunlarla ilişkili görüntüleri ve meta verileri kaydetmek için "ÖİB" formatında görüntü kaydetmek.
        NOT: Görüntüler üzerinde elde edilengeniş alan mikroskobu ve konfokal mikroskop görüntülenmiştir ve FIJI, ücretsiz kamu malı görüntü işleme programı olarak yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada geniş alan ve görüntü mitokondri ve zebra balığı embriyolar yaşayan sentrozomlarda konfokal mikroskopi kullanımı doğrudan karşılaştırılır ve tezat olduğunu. incelenecek organel dinamiği olan hücrelerin bir konumda ve spesifik hücre içi olayların doğal frekansına bağlı olarak, genel olarak geniş bir alan veya konfokal mikroskopi ya daha iyi bir seçimdir. Bu embriyo yüzeyinde bulunan RB nöronlarda ve daha derin bulunduğu retina hücrelerinde organelleri görüntülenmiştir. Onların iki ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, floresan etiket mitokondri, sentrozom ve zebra balığı embriyoların in vivo spesifik hücre tiplerinin hücre zarlarına Gal4 UAS sentezleme sisteminin kullanışlılığını göstermiştir. Diğer, organellerin veya hücre içi yapıları etiket çoğu halojen füzyon proteinleri literatürde bulunabilir ve ilgili laboratuarda, ticari kaynaklardan veya ticari olmayan plazmid tevdi (ör Addgene) elde edilebilir. Yeni bir flüoresan füzyon proteinini tasarlamak için birçok parametre AP kullanılacak ve ilgi konusu prot...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.E., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Araştırma Eğitim Grubu 1373 ve Münih Teknik Üniversitesi Enstitüsü (TUM-GS) tarafından desteklenmektedir. G.P., TUM-GS tarafından desteklenmiştir. L.T. BIR EMBO bursu tarafından desteklenmektedir (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'nin zebra balığı üzerindeki çalışması, Sonderforschungsbereich "Nörodejenerasyonun Moleküler Mekanizmaları" (SFB 596) aracılığıyla DFG tarafından desteklendi; Entegre Protein Bilimleri Merkezi (Münih) ve Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) 200611 no'lu Hibe sözleşmesi (MEMOSAD) kapsamında. Halen New York Kök Hücre Vakfı-Druckenmiller Üyesidir ve Alman Bilimler Akademisi Leopoldina'dan bir burs tarafından desteklenmiştir. L.G., SFB 870 "Nöronal Devrelerin Montajı ve İşlevi", Proje A11 aracılığıyla DFG'den sağlanan finansmanla desteklenmektedir.

Balık tesisimizi koruduğu için Kristina Wullimann'a, teknik destek için Yvonne Hufnagel'e ve el yazması hakkındaki yorumları için Thomas Misgeld'e minnettarız. M1 Medusa vektörünü (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) sağladığı için R. Köster'e (Technische Universität Braunschweig) Centrin-YFP'yi sağladığı için ve S.C. Suzuki'ye ve T. Yoshimatsu'ya (Washington Üniversitesi) CentrinFish'i yapmak için muhabir yapısını oluşturmak için kullandığımız 14xUAS:MA-cerulean kasetini sağladıkları için minnettarız. Otx2:Gal4 transgenik hattı için S.C. Suzuki ve T. Yoshimatsu'ya (Washington Üniversitesi), Sensory:Gal4-VP16 yapısı (UCLA) için A. Sagasti'ye ve pCold Heart Tol2 vektörü için M. Nonet'e (St. Louis'deki Washington Üniversitesi) teşekkür ederiz. MitoFish'in geliştirilmesine katkıda bulundukları için Bettina Schmid, Alexander Hruscha ve Christian Haass'a (Alman Nörodejeneratif Hastalıklar Merkezi Münih - DZNE) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agaroz (2-hidroksietilagaroz)Sigma-AldrichA4018-10GDüşük jelleşme sıcaklığı Tip VII
Blok ısıtıcıEppendorfThermomixer kompakt
Ca (NO3< / sub>) 2< / sub> Kalsiyum nitrat hidrat,% 99.996 & nbsp;Aldrich202967-50g30x Danieau'nun
CCD kamerasınıQimagingRetiga Exi Fast 1394
Seramik Kaplı Dumont #5 ForsepsDumont - Güzel Bilim Araçları11252-50#5 Forseps
Konfokal lazer tarama mikroskobuOlympusFV1000 Fluoview
Kültür bulaşık ısıtıcısıWarner Instrument CorporationDH-35Isıtma halkası
Etil 3-aminobenzoat metansülfat tuzuPharmaQTricaine PharmaQ-25gTrikain (anestezik)
Floresan diseksiyon mikroskobuLeicaM205 FA
GeneClean kitiMP Biyomedikal111001200
Cam Alt Kültür TabaklarıMatTek CorporationP35G-0-14-C35 mm petri kabı, 14 mm mikro kuyu, No. 0 kapak camı
Cam iğnelerDünya Hassas Aletler A.Ş.  TW100F-4Mikroenjeksiyonlar için
HEPESSigmaH3375-250g30x Danieau'nun
Yüksek vakumlu yağınıDow Corning DCC000001242 150gSilikon dioksit gresi
KCl %99Sigma-AldrichS7643-5kg30x Danieau'nun MgSO'sunu hazırlamak için
sub>4.7H2O     Magnezyum sülfat heptahidrat %98+ ACS reaktifiSigma-Aldrich230291-500g30x Danieau'nun Mikroenjektörünü hazırlamak için
 EppendorfFemtoJet
Mikro Yükleyici uçlarıEppendorf9300010070.5-20 ul
MikromanipülatörMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Mikropipet tutucuIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon KitiAmbionAM1340PCS-Transpozazı yazıya dökmek için
NaCl BioXtra >%99,5Sigma-AldrichP9541-1kg30x Danieau'nun
Nanofotometresiniiçin DNA/RNA konsantrasyonunu ölçmek için
İğne çektirmeSutter AletiP-1000Alevli/Kahverengi
NIR Apo 40x/0.80W NikonSu daldırma konisi objektifi
N-Feniltiüre Sınıf I, yaklaşık% 98SigmaP7629-10GPTU (pigmentasyonu önler)
Petri kaplarıSarstedt AG 82147292 x 16mm 
Plastik kalıplar Uyarlanabilir Bilim AraçlarıTU-1Mikroenjeksiyonlar için
Delikli pleksiglas kapakÖzel yapımPleksiglas kapaktaki delik, su daldırma konisinin çapından 3 mm daha büyük olmalıdır. Hedef
Çay süzgeci (Plastik)Zebra balığı yumurtalarını toplamak için
Sıcaklık kontrolörüWarner Instrument CorporationTC-344BÇift Otomatik Sıcaklık Kontrolör
Transfer pipetleriSarstedt AG 86.11713.5mL plastik transfer pipetleri
UMPlanFI 100x/1.00WOlympusSu daldırma konisi objektifi
UMPlanFLN 20x/0.50W OlympusSu daldırma konisi objektifi
Geniş alan mikroskobuOlympusBX51WI
PTU (50x Stok)76 mg PTU'yu 50 ml damıtılmış suda çözün
Oda sıcaklığında kuvvetlice karıştırın 
-20 oC'de 1 ml alikot
1x çalışma solüsyonunda kullanın
Trikain (20x Stok)200mg Trikaini 48 ml damıtılmış suda çözün
2 ml 1M Tris bazı (pH9)
ekleyin pH 7 'ye ayarlayın;
-20 oC'de 1 ml alikot
1x çalışma çözümünde kullanın
Danieau'nun Çözümü (30x Stok)1.740 mM  NaCl 
21 mM          KCl 
12 mM          MgSO4.7H2O 
18 mM          Ca (NO3)2
150 mM      HEPES tamponu 
1 L 'ye kadar damıtılmış su;
4 oC  adresinde saklayın;
0,3x çalışma çözümünde kullanın
hazırlamak için hazırlamak için < hazırlamak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191 (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56 (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15 (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2(2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45 (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32 (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33 (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11 (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70 (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30 (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240 (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142 (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163 (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3 (10), 130065(2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20 (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74 (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99 (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80 (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108 (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341 (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184(2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (3), prot5586(2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42 (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21 (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. , 14.20(2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. , 21.4(2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556(2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33 (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cresel Alt Yap G r nt lemeMitokondriyal Ta maSentrozom Dinami iGal4 UAS SistemiFloresan aretlemeGeni Alan MikroskopisiKonfokal MikroskopiZaman Atlamal G r nt lemeIn Vivo Mikroskopi

İlgili makaleler