Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Özet

Glikoliz, çoklu biyolojik sistemlerde tanımlayıcı bir metabolik belirteçtir. H ⁺ hücre dışı akışını ölçerek glikolizin izlenmesi yaygındır, ancak kantitatif ve açık olması için düzeltme gerektirir. Burada, hücre dışı asitlenmenin solunum ve glikolitik kaynaklarını ayırt etmek için hücre dışı akı verilerinin nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini gösteriyoruz.

Özet

Oksijen tüketimi ve asit üretiminin hücre dışı ölçümü, solunum ve glikoliz hızlarını izlemenin basit ve güçlü bir yoludur¹. Hem mitokondriyal (solunum) hem de mitokondriyal olmayan (diğer redoks) reaksiyonlar oksijen tüketir, ancak bu reaksiyonlar mitokondriyal solunumun kimyasal inhibisyonu ile kolayca ayırt edilebilir. Bununla birlikte, mitokondriyal oksijen tüketimi, solunum hızı^2'nin kesin ve doğrudan bir ölçümü olsa da, aynı şey hücre dışı asit üretimi ve bunun glikolitik hız ^3-6 ile ilişkisi için geçerli değildir. Hücreler tarafından üretilen hücre dışı asit, hem anaerobik glikoliz tarafından üretilen laktattan hem de solunum sırasında sitrik asit döngüsünde üretilen CO_2'den türetilir. Glikoliz için, glikozun laktat^- + H⁺'ya dönüştürülmesi ve ürünlerin tahlil ortamına aktarılması, glikolitik asitleşmenin kaynağıdır. Solunum için, CO₂ ihracatı, H₂CO_3'e hidrasyon ve HCO₃^- + H ^{+ '}ya ayrışma, solunum asitlenmesinin kaynağıdır. Glikolitik ve solunumsal asitlenme oranları, sağlanan hücre tipi ve substrat(lar) dahil olmak üzere deneysel koşullara bağlıdır ve yaklaşık %100 glikolitik asitleşmeden yaklaşık %100 solunum asitlenmesine kadar değişebilir ⁶. Burada, C2C12 miyoblast hücrelerini model olarak kullanarak kültürde tüm hücrelerin toplam hücre dışı asitleşmeye solunum ve glikolitik katkılarını belirlemek için gereken veri toplama ve hesaplama yöntemlerini gösteriyoruz.

Giriş

Bu yöntemin genel amacı doğru dışı akı analizi kullanılarak hücrelerin glikolitik oranını ölçmektir. Dışı asitlenmesine kullanarak glikolitik oranı kantitatif ölçümü birçok deneylerin istenilen uç noktasıdır. Bununla birlikte, hücre dışı asidifikasyon oranı toplam iki bileşenden toplamıdır: Solunum asitleştirme, CO ₍₂ CO ₃ daha sonra HCO ₃ ayrışmaktadır H nemlendirir ^- + ^H +), ₂ şeklinde, ve aynı zamanda glikolitik asitleştirme formda + ^H + ^- laktat.

Toplam dışı asitleşmeye _CO 2 katkıları yakın zamana kadar burada kullanılan ölçüm platformu, XF24 analizörü ⁷ önemsiz kabul edilmiştir. Ancak, ₂ dışı asitleşme ^4-5 büyük katkı olabilir CO çoklu diğer sistemlerde açıktır. Çoklu kağıtlar Bu con kabultribution, ancak asit ^3,8,9 -türevlenmiş _CO 2 doğrudan kantitatif çalışmayın. Biz son zamanlarda bu CO ₂ üretimi, bu sistemde ⁶ hücre dışı asitleşme önemli bir kaynağıdır kantitatif gösterdi. Glikoz katabolizma gelen CO ₂ üreten çok sayıda metabolik yol olmasına rağmen Dahası, bu sitrik asit döngüsü matris dehidrogenazlar tarafından yürütülen ezici katkıda ve tüm diğer kaynaklar deneysel hata ⁶ dahilinde _CO 2 miktarını oluşturur.

_CO2 üretimi için düzeltilmesi olmadan, hücre dışı asitleşme oranı dolayısıyla glikolitik belirsiz bir göstergesidir ve kantitatif kullanılamaz. Daha önceki yayın solunum CO ₂ bile genellikle öncelikle glikoliz ⁶ kullanmak inanılan hücrelerde toplam asitlenme sinyalinin toplu oluşmaktadır çeşitli örneklerini vurgulamaktadır. Buna ek olarak,Toplam asitleştirme solunum _CO2 katılım bir deney farklı aşamalarında glikolitik oranının doğru karşılaştırma _CO2 için düzeltme gerektiren gösteren yaygın metabolik profil deneyleri sırasında büyük ölçüde değişir.

Hücre dışı asidifikasyon oranını kullanarak hücrelerin glikolitik hızını ölçmek için, üretilen toplam ^H + değişim pH değişiklikleri dönüştürmek ve sitrik asit döngüsünün çalışması sırasında ortaya çıkan _CO2 neden olduğu hücre dışı asidifikasyon çıkartılması gerekli olmaktadır. Burada, (O ₂ konsantrasyonunda hücre dışı değişiklikler elde edilmiş) ve _CO2 üretimi (pH hücre dışı değişiklikler ve kalibre edilmiş deney ortamı tampon gücünden) hücre dışı bir proton üretim hızının ölçülmesi için basit bir yöntem tarif eder ve glikolitik hızı nasıl hesaplanacağını gösterir, Bu ölçümleri kullanılarak.

Bu yöntem, mukavemet laktat üretimi ile tanımlanan düzgün glikolitik oranını hesaplamak için kullanarak hücre dışı asitleşme ölçüm programı ens. Solunum _CO 2 (ya da laktat doğrudan ölçümü) için düzeltme olmadan, belirlemek mümkün olup olmadığını ve toplam asitlenme hızı laktat üretiminin doğrudan ölçümü olarak toplam hücre dışı asitlenme kullanmak deneyler yorumlanması karıştırıcı, glikolitik oranını yansıtan ne ölçüde.

HESAPLAMA

CO ₂ ve laktat deneysel hata içinde vardır, miyoblast hücreleri ⁶ deneylere dayalı dışı asit üretimi için sadece iki katkıda. Dolayısıyla, toplam hücre dışı asidifikasyon (PPR proton üretim oranı) oranı olarak tanımlanabilir:

PPR _tot = PPR _solunu + PPR _glisin Denklem 1

. _content "> tot = toplam; solunu = solunum, glisin = glikolitik Glikolitik PPR böylece:

PPR _glisin = PPR _tot - PPR _solunum Denklem 2

İşte,

PPR _tot = ECAR _tot / BP Denklem 3

burada ECAR = dışı asitleşme oranı (mph / dk) ve BP = tamponlama gücü (mil / pmol ^H + 7 ul), süre

PPR _resp = (10 ^{pH pKa ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH pK ₁₎₎} (max ^H + / _O 2) (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Denklem 4

burada K ₁ = CO ₂ hidrasyon ve HCO ₃ ayrışma kombine denge sabiti ^{- +} H; max ^H + / O ₂ = the CO glikoz ⁶ tam oksidasyonu gibi belirli bir metabolik dönüşüm için ₂ -türevi asitlenme; OCR = oksijen tüketimi oranı (pmol O ₂ / dk), ve OCR _{rot / myx} = olmayan mitokondrial OCR.

Denklem 4 (mitokondriyal solunum zehirler rotenone ve myxothiazol dayanıklı OCR olarak tanımlanan) ve maksimum H hesapları ⁺ her bir taban (max H ⁺ / _O 2 için tüketilen _O 2 başına üretilen olmayan herhangi bir mitokondrial OCR çıkarılarak mitokondrial OCR izolatlarının ) () ^{6 ya bakınız,} yanı sıra deneysel sıcaklık ve pH (10 ^{pH pKa ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH pKa ₁} H ⁺ sebebiyet veren _CO2 oranı). glukoz tam oksidasyonu için, mitokondriyal Oksijen Tüketim Oranı (OCR) CO ₂ üretim hızının tam olarak eşittir. ekstrasellüler akı ölçüm sınırlı tahlil hacmi, CO ₂ üretmeksolunum yoluyla d tahlil ortamında sıkışıp kalır. + H ^{+ -} tuzağa CO ₂ Çoğu sonra _HCO 3 ayrışmaktadır H ₂ CO ₃ için hidratlanır. Küçük bir kısmı çözündürüldü kalır ama hidrate olmadığı ve HCO ₃ CO ₂ hidrasyon ve ayrışma sabiti ile birleştirilmiş denge termodinamik dikte edildiği gibi bir küçük bir kısmı, sulu, ancak ayrışmış ^değil - + H ⁺ deney sıcaklığında (37 ° C) ve pH (~ 7,4).

Böylece, PPR _tot olduğu PPR _resp çıkarılarak PPR _g hesaplanması için tam denklem:

PPR _glisin = ECAR _tot / BP - (10 ^{pH pKa ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH pK ₁₎₎} (max ^H + / _O 2) (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Denklem 5

benn bu yolu, solunum ve glikoliz yanı sıra bunların ilişkili ATP üretim oranları oranları, kantitatif basit ölçümlerle (oksijen tüketimi, hücre dışı asitleşme, tamponlama kapasitesi) ve diğer gerekli değerlerin ithalat veya hesaplama ^(H + / _O 2 belirlenebilir P / O ve denge sabiti K ₁₎ ^6. Burada anlatılan deney Seahorse XF24 ^10,11 olarak Ekstraselüler Akı Analyzer gibi kullanmak için standart teknikler genişletir; Diğer dışı akı ölçüm biçimleri (örneğin, XF ^e 96 ya da XFP) için, aşağıdaki tüm birimler uygun ölçekli edilmelidir.

Deney ortamı tampon gücü, kalibre edilmiş bir pH sondasını kullanarak ya doğrudan hücre-dışı akı platformda veya ayrı olarak, standart bir eğri elde ile ölçülebilir. Burada dışı akı deney ortamı ile tamponlama ölçmek için üç seçenek tüm Injecti kullanarak da dahil olmak üzere, verilenHücre içermeyen örnek kuyu veya hücre içeren kuyu (bölüm 1) veya harici pH ölçümü (bölüm 2) kullanılarak yalnızca son enjeksiyon portu kullanarak dışı akı analizör portları. Örnek verileri tam hesaplamalar için ekli elektronik tablo bakın.

Hücre dışı akı enstrümanın pH tespit yeteneğini kullanarak tamponlama gücünü ölçmek için, sinyal değişimi en aza indirmek için hücre içermeyen kuyuları kullanmak için güvenli olduğunu. Bununla birlikte, hata payı içinde, anlamlı bir fark hücre içermeyen ve hücre ihtiva eden bu ölçümü gerçekleştirirken kuyu (veriler gösterilmemiştir) arasında bulunmaktadır. Not: Adım 1.7'de tarif edilen varyasyon gürültüsü sinyalinin dezavantaj, ilave bileşikler ile ya da hücrelerin varlığı ile kazandırılan tamponlama herhangi bir potansiyel değişiklikler hesaba olanaklar taşır. Yukarıda belirtildiği gibi, ancak, önemli bir fark, Tablo 1 'de gösterilen hücre içermeyen tasarım arasında hesaplanan tamponlama gücü bulunan veBurada tarif edilen deney koşulları altında, Tablo 2'de sonrası deney tasarımı.

Ayrıca, küçük ΔpH aralıkları (<0.4 ünite, deneysel iyi 0.2 ünite ile sınırlı) üzerinden, doğrusal eğimi Δ mph / pmol H çizilerek elde ⁺ yeterince ΔpH ve ^[H +] ile logaritmik bir ilişki yakındır. Bu standart eğrinin eğimi dolayısıyla 7 ul pH / nmol ^H + test edilen deney ortamı tamponlama gücünü temsil, veya mph / pmol ^H + 7 ul. Biz orta tamponlama gücünün artırılması ya da ölçüm süresinde 0.2 pH birimi değişikliği aşan numuneler için hücre yoğunluğu azalan öneririz. Ölçüm süresi de azalmış olabilir, ama bu kararlı hal asitlenme hızının kısaltmak ve hızı hesaplama içine hatayı tanıtmak olabilir.

Protokol

1. Bir Ekstrasellüler Flux yürütülecek olan arabelleğe Güç Ölçme: İki Variations

NOT: hesaplamalar ve burada açıklanan yöntemler, bir Ekstraselüler Akı Analyzer kullanılarak geliştirilmiştir. Diğer enstrümanlar için ölçüm hacmi uygun ölçekli olmalıdır.

1. Üretici talimatlarına göre (Materyaller ve Ekipman bakınız) HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın.
   Not: Tüm dört enjeksiyon çıkışlarından kullanım için HCI enjeksiyonları hazırlanması için bir örnek hesaplaması, Tablo 1 'de gösterilmiştir:

Tablo iyi bir hücre dışı akı tahlil içine 1. Ardışık HCl enjeksiyonu.

2. Ortam içinde HCI standart dilüe carr olan teknik çoğaltır sayısı için Tablo 1 'de olduğu gibi denenmektedir edilmesibir tabak içinde ied, artı bir pipet hatası sağlamak için; örneğin, liman dört teknik çoğaltır A enjeksiyonu için, (48.9 ul x 5) tahlil ortamında (1.1 ul x 5) 0.1 M HCl bir stok hazırlamak.
3. Ölçüm probu kartuşunun her Liman A içine 50 ul dağıtın. Kalan limanlar B, C, ve D için bu yordamı yineleyin
4. Dört liman eklemeler her biri için [2 dakika karıştırın, 1 dakika bekleyin ve 5 dk ölçümü] iki döngü izledi standart kalibrasyon döngüsü ile bir hücre dışı akı tahlil ^10, Run (bakınız Şekil 2).
   1. Yazılım talimatlarına göre alet yazılımı yukarıda deneyi programlayın. Makinenin içine hazırlanmış kartuşu yükleyin ve yazılım talimatlarına göre kalibrasyonu yapın.
   2. Program tarafından istendiğinde, kalibrant içeren plaka kaldırmak ve iyi aracı haline her tahlil ortamı içeren plaka takın; programı devam ettirin.
5. U daha önce gelen kararlı durumda elde edilen 8-10 veri noktaları (genellikle son 8-10 puan) ortalamasını şarkı ve her port ilavesinden sonra, standart asidin her enjeksiyonundan kaynaklanan pH (ΔpH) olarak (kümülatif) farkı hesaplayın.
6. Nmol H karşı ΔpH Plot ⁺ ölçüm probu tarafından yakalanan 7 ul hacminde içeriyordu. Doğrusal eğim mph / pmol ^H + tamponlama gücü (BP) 'dir.
7. Alternatif olarak adımları 1,2-1,3, Tablo 2'de olduğu gibi Liman D'de bir HCI enjeksiyonu takiben bağlantı noktaları A, B, ve C Bir deney için kullanılan bir deneyde, aşağıdaki ΔpH ölçümleri yürütmek dört teknik eşlemeler Hücre dışı akı analiz plakasının (dört arka plan sıcaklık düzeltmesi kuyular hariç) 20 deneysel kuyularda 5 puanlık bir standart eğrinin her noktası oluşturmak için kullanılan.

53464table2.jpg "/>
Iyi bir hücre dışı akı tahlil içine Tablo 2. Tek HCl enjeksiyonu.

2. Harici pH Metre Kullanımı arabelleği Güç Ölçme

Not: Harici bir pH sondasını kullanarak bir maddenin tamponlama gücünü ölçmek 37 ° C'de sondasını ayarlamak ve deney süresince her reaktifler için bu sıcaklığı korumak için.

1. Üretici talimatlarına göre HCl konsantre kullanılarak su içinde 0.1 M standart HCl hazırlayın.
2. Sıcak pH probu, pH standartları olan tamponlama kapasitesine ölçülecek deney ortamı, ve bir su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar 0,1 M HCI.
3. Üretici talimatlarına göre 37 ° C'de pH sondasını kalibre edin. Bir ısı plakası ya da su banyosu kullanılarak analiz boyunca 37 ° C'de tüm reaktifler koruyun.
4. Kısım küçük bir cam bardak veya konik tüp içine tahlil ortamı 10 ml. Sürekli bir dalmış pH prob kullanılarak pH'ı izleyin.
5. Şu şekilde 0,1 M HCI ekleme10-20 ul alikotları orta söylüyorlar.
   1. Bir karıştırma çubuğu kullanarak veya elle her asit ilavesinden sonra kabı dönen karıştırma emin olun.
   2. PH ölçümü stabilize etmek için bir kaç saniye sonra her eklemeden sonra pH'ı kayıt izin verin.
   3. Tablo 3'te görüldüğü gibi, ilave yeterli sayıda doğru eğim hesaplama sağlamak ve deney sırasında beklenen pH aralığını karşılamak için tercih.

Tablo 3. pH metre kullanılarak tamponlama gücü ölçümü. Veriler 0.1 M HCl altı 20 ul eklemelerle tipik bir deney temsil etmektedir.

6. Nmol ^H + karşı komplo ΔpH tamponlama gücü (Şekil 1) temsil eden bir lineer eğim vererek, 7 ul başına katma.

Şekil 1. tamponlama gücü belirlenmesi. HCI standart eğri Tablo 3'te aşağıdaki Tablo 1, Tablo 2 (burada) 'deki gibi ölçülür. Lineer eğri uyum eğimi tamponlama gücü (pH / nmol ^H + 7 ul içinde) elde edilir. Her nokta n ± SEM = 9 teknik çoğaltır ortalama temsil eder.

7. Tamponlama gücü Yöntem 1 veya yukarıdaki 2 ile bilinen kez iktidarı tamponlama ile ECAR bölerek PPR (pmol ^H + / dak / mg protein) için ECAR sinyali (mph / dak) dönüştürmek (BP) (mph / pmol ^H +) ve her bir kuyu protein içeriği ölçekleme:
   PPR _tot (pmol ^H + / dak / mg protein) = ECAR (mph / dak) / BP (mph / pmol ^H + 7 ul) iyi (ug) başına / protein Denklem 6
8. Alternatif olarak, Yöntem aynı deneyleri kullanmaks 1 ya da 2 otomatik veri toplama sırasında PPR hesaplamak için cihaz yazılımı tarafından kullanılan arabelleği Kapasitesi (BC) değerini hesaplamak için.
   NOT: Cihaz kullanım kılavuzu ¹² (sayfa 107) hesaplanması ve M.Ö. olarak açıklanan tamponlama kapasitesi, kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar
   BC (mol / L) = mol ^H + / (ΔpH x tampon hacmi (L)) Denklem 7
   Not: Denklem 7'de tanımlanan tamponlama kapasitesi, yukarıda tarif edilen cihaz veya harici pH probu deneylerinde hesaplanabilir. Tamponlama gücü ve tamponlama kapasitesi arasındaki Dönüşüm kolayca (ekli e-tabloyu bakınız) yapılır:
   BC = 1 x 10 ^-9 / BP ((mph / pmol ^H + 7 ul) / 7 ul) Denklem 8
   NOT: tahlili yapmadan önce Eğer biliniyorsa, tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında cihaz yazılımı doğrudan girilebilir.
9. Önceki yayın ^6'da tarif edildiği gibi, bu yordamı ve çoğu geleneksel tampon sistemlerinde yukarıda kullanılan hesaplamaları uygulanır.
   NOT: Tablo 4 tamponlama gücü ve çeşitli geleneksel medya tamponlama kapasitesi.

Tablo 4. Tamponlama gücü ve seçilen medya tamponlama kapasitesi.

3. C2C12 Miyoblast Hücreleri Kullanarak Hücre dışı Akı Testi Sahne

Not: Aşama 3.4.3 içinde, CO ₂ açısından farklılık varlığını HCO _{3 CO} 2 tam dönüşümü için gerekli olmadığını öne C2C12 kültüründe karbonik anhidraz varlığına asit üretimi bağlıdır -türevli vardı ^- + H ^+. Ancak, ampirik farklı deneysel sistemlerde bu test om önce öneriliritting karbonik anhidraz.

1. Kültür fare C2C12 11,1 mM glukoz, 2 mM glutamin,% 10 h / h cenin sığır serumu (FBS), 100 U Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) içinde% 95 hava /% 5 _CO2 altında 37 ° C'de ¹³ miyoblastlar / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin.
2. Testten 24 saat önce için 20.000 hücre, aynı kültür ortamında 100 ul plaka / tohum hücre / oyuk, herhangi bir ek kaplama ile 24 oyuklu polistiren hücre dışı akı deney plakası (Malzemeler ve Yöntemler bölümüne bakınız).
3. , FCCP oligomycin seyreltilir ve Krebs Ringer fosfat HEPES (KRPH) deney ortamı (2 mM HEPES, 136 mM NaCI, 2 mM NaH ₂ PO _4, 3.7 mM KCI, 1 rotenon artı myxothiazol ve 10x son konsantrasyona HCI (isteğe bağlı) _mM MgCI2, 37 ° C'de 1.5 _mM CaCl2,% 0.1 w / v yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini, pH 7.4) eklenmiştir.
4. Hücre hazırlığı
   1. 30 dakika önce tahlil için, ge aspire yapışık hücreler üç defa yıkamakntly kuyudan orta kaldırmak ve daha sonra yavaş yavaş 500 ul KRPH sözlerine ekledi.
   2. Hava altında 37 ° C 'de, üçüncü bir yıkama aşamasından sonra hücreler inkübe (değil% 5, bu bikarbonat içermeyen ortamın pH değerini değiştirdiklerini _CO2 altında).
   3. Deney başladığında, ek bir alt-tabaka ile, 500 U / ml, karbonik anhidraz ve ya glikoz (10 mM) veya sadece ortam içeren 500 ul taze KRPH kuyularda KRPH değiştirin.
5. Sensör kartuşu yükleme
   1. Liman A: 2 ug / ml oligomycin Port B: 0.5 uM FCCP, Port C (analizdeki nihai konsantrasyon da verilebilir) aşağıdaki gibi hücre dışı bir akış algılayıcısı, kartuşun kartuş bağlantı noktalarına Aşama 3.3'te hazırlanan her bir 10x bileşik pipetleyin 50 ul tam bölünen miktarları : 1 uM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCI (yukarıda ve Tablo 2'de tarif edildiği gibi bir in-deney asit kalibrasyon gerçekleştirmek ise).
      NOT: Tüm solunum zincir engellenmesi amacı Burada anlatılan için, 1 uM benimxothiazol 1 uM antimycin A ile değiştirilerek kullanılabilir
6. Ekstrasellüler akış deneyi:
   1. ¹⁰ de tarif edildiği gibi, solunum kontrol belirlenmesi için standart bir hücre dışı akı tahlili gerçekleştirin.

NOT: Deneyin her segment için, karışımı belirlemek bekleyin ve ölçüm süreleri kesimi başına döngü yanı sıra numarası, istenilen.

NOT: Tablo 5'teki veriler üç deney çevrimleri tamponlama kalibrasyonu için HCI (farklı miktarlarda Port D ilave edildikten sonra meydana gelen, 2 dk karışımı, 1 dakika bekleyin ve her segment için 5 dakika ölçüm iki deney çevrimi üzerinde toplandı Tablo 2 deki gibi gücü).

Tablo 5. Hücre dışı akı tahlil yapılandırması.

4. Measuring sonu nokta Laktat Konsantrasyon

Not: azaltılması (2 dakika boyunca), ilk hızının ölçümü geleneksel bir 96 oyuklu plaka içerisinde direkt olarak belirlenebilir hücre dışı bir akı deneyin sonunda bazı farklı sistem, son nokta laktat konsantrasyonu burada tarif Dolaylı tahlil doğrulamak için NAD ^{+ →} NADH, bizim daha önceki yayında ⁶ ayrıntılı olarak tarif laktat dehidrojenaz ile katalize. Örnek Sonuçlar sunulan veriler için, glükoz-ihtiva eden test gözlerine bitiş noktası laktat konsantrasyonu ~ 40 uM idi.

1. 2x hidrazin orta hazırlayın: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hidrazin, pH 9.8 22 ° C'de),. Hemen deney başlamadan önce, 40 U / ml 4 mM ve laktat dehidrojenaz (LDH) NAD ⁺ ilave edin. Nihai deney ortamı bileşimi (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM, hidrazin, 2 mM NAD ^+, 20 U / ml LDH.
2. Hemen hücre dışı akı tahlili sonra, 100 kaldırmaOpak bir (siyah) bir çukuruna hücre dışı akı deney plakası ve iletiminin her kuyudan tahlil ortamı 96-çukurlu plaka ul.
3. Her bir numune için, 100 ul 2x hidrazin orta ekleyin.
4. Hemen bir mikro-okuyucu plaka yük ve 340 nm uyarma / 460 nm emisyon NADH floresan izleme başlar.
5. Yaklaşık 2 dakika boyunca başlangıç ​​hızı kaydedilir.
6. 0 ila 50 uM ilave laktat konsantrasyonları için laktat konsantrasyonuna karşı başlangıç ​​hızını gösteren standart bir eğri oluşturmak için benzer bir deney başlat.
7. Her deneysel iyi standart eğri kullanılarak laktat konsantrasyonunu hesaplayınız.

5. Protein İçeriği Ölçme

1. Deney plakasının her bir oyuğuna kalan deney ortamını çıkarın.
2. Alt kuyu yüzeyindeki hücrelerin yerini değiştirmemek en aza indirmek için dikkatli olmak, BSA içermeyen KRPH ul wells 250 ile üç kez yıkayın.
3. 25 ul RIPA lizis ekleortamı (150 mM NaCI, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA,% 1 h / h Triton X-100,% 0.5 w / v sodyum deoksikolat,% 0.1 h / h SDS, 22 ° C'de pH 7.4) deney plakasının her oyuğuna.
4. 30 dakika boyunca buz üzerinde plaka inkübe edin.
5. 5 dakika boyunca 1200 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde çalkalayın plaka.
6. Liziz tamponu bileşimin ölçümü yöntemi ile uyumlu hale getirmek için, bir BCA aracıyla, örneğin, standart yöntemler, protein konsantrasyonu ölçümü. Şekil 2'de deneyde protein içeriği ~ 4 ug / oyuk oldu.

Sonuçlar

Şekil 2 tipik bir deney için ham verileri gösterir. OCR ve pH (dikey barlar gölgeli) hem de point-to-point kayıt son 10 ölçüm noktası hesaplamalar için kullanılmıştır. İlk endişeler her tahlil döngüsünün ortalama değeri (orta noktası ölçümü), dışarı kaynaklı değildi liman ilave ve sürekli hal asitlenme hızının arasında hafif bir gecikme ortaya çıktı özellikle de doğru bir hesaplama için oran yeterli çözünürlüğü sağlamak olmaz Bu hesaplama hatası önemli ölçüde katkıda görünmüyor gibi (gösterilmemiştir). Doğru tamponlama kapasitesi deneysel kurulum sırasında girilen Alternatif olarak, eğer PPR enstrüman yazılımında veya veri çıkış ayarları biri olarak mevcut PC uyumlu bir biçimde PPR çıkışı göstererek enstrüman veri toplama okuma doğrudan okunabilir.

ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
Şekil _2, O ve ^H + 2. Örnek hücre dışı akı izleri. OCR ve pH deney başlangıcında 10 mM glükoz ihtiva eden, Tablo 5 'de bir örnek deney için izler. D çıkışı (bu ortalama izleri gösterilmemiştir) tampon gücü kalibrasyonu için farklı HCl konsantrasyonları. Önceki yayında ⁶ veriler. Her nokta n = 8 biyolojik çoğaltır ortalama ± SEM temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Temsili sonuçlar Veri analizi

-Tabloyu Tablo 6'da gösterilen bir ek olarak sağlanır kullanılarak, tek tek oyuklara veri değerleri sarı başlıkları ile gösterilen sütunlar girilebilir. Altı sütunları Sağ bu girdileri hesaplanır. Tablo 6'da örnek PPR _resp ile ya da ekledi glikoz olmadan doğal koşullar, oligomycin önceki Limanı bir ek için ayrı kuyudan ECAR ve OCR verileri kullanılarak PPR _glisin hesaplamalarını gösterir. Her biyolojik hazırlık Teknik çoğaltır normalde son dört sütun halinde çıkışların tek değerleri vermek için ortalaması alınır, daha sonra farklı biyolojik hazırlıklar veri hatası BP istatistik ve bu dört değerlerin uygun yayılımı ile ortalaması alınır.

Tablo 6. Solunum ve glikolitik asitlenme hesaplanması. Sarı başlı Sütunlar değerler hesaplamadan girilecek gösterir (örneğin, BP, max ^H + / O _2), ya da veri toplama (örn, ECAR _tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> bu tablonun büyük halini görmek için tıklayınız |. tıklayınız bir Excel elektronik olarak bu tabloyu indirmek için .

Düzeltme sonrası PPR için glikoliz ve solunum Katılımlar

Şekil 3 FCCP ek (Liman B) Aşağıdaki yerli glikolitik ve solunum asidifıkasyon oranları, ek (Liman A) oligomycin aşağıdaki oranlara ve oranları Tablo 6'daki olarak hesaplanan verilerin grafiksel çıkışını gösterir. Bu veriler açıkça substrat seçimi ile solunum ve glikolitik asitlenme değişim oranları (hiçbiri ile kontrol (CTL vs glikoz) eklenmiştir) nasıl göstermek ve mitokondriyal durumu (yerli fonksiyon vs farmakolojik fonksiyonu değişmiş) ile.

">
Glikolitik ve solunum kaynaklardan Şekil 3. Proton üretim hızı (PPR). Solunumla PPR (açık kısımları) ve katma glukoz (üç sol çubuklar) veya katma glikoz (üç sağ çubuklar olmadan) Denklem 5 kullanılarak hesaplanan C2C12 hücrelerinin glikoliz (dolu bölümleri). ^{6 ila} veriler. Tüm veriler n ± SEM = 8 biyolojik çoğaltır ortalama temsil etmektedir.

Tartışma

Hücre dışı asidifikasyon hücresel metabolik hızının kolayca ölçülebilir bir göstergesidir. (Laktat üretimi tarafından tanımlandığı gibi) düzgün bir deney ortamı tamponlama gücünü bilmek önemlidir hücresel glikoliz oranını belirlemek için, ve üretim oranları proton, oksijen tüketimi ve asitlenme dışı akı ölçümlerini dönüştürmek. Bu hesaplama gerçekleştirilmesi ile, sitrik asit döngüsünde serbest CO ₂ kaynaklanan asidifikasyon laktat üretimi ile sonuçlanan asitlenme bırakarak çıkartılabilir.

Bu düzeltme için tamponlama gücünü ölçmek için burada verilen çok farklı şekillerde, farklı avantaj ve dezavantajlara taşırlar. PH sondası kullanılarak Dış ölçüm son derece doğru ve tekrarlanabilir, ancak deney plakası, deney sırasında bileşiklerin eklenmesi ya da t mevcudiyetinde içinde ihtiva floroforlar ile getirilen pH tespiti küçük farklılıkları yansıtmayabilirO hücrelerin kendileri. In-plaka pH ölçümleri bu konuları ele, aynı zamanda deneysel gürültü değişen derecelerde tanıtmak.

ECAR CO ₂ Düzeltme ilk kez glikolitik oranı net ve kantitatif hesaplama sağlar ve bir deney sırasında, toplam ECAR solunum ve glikolitik katkı değişimini göstermektedir. Denklem 5 ve OCR, ECAR ölçümlerini kullanarak, güç ve tamponlama, glikolitik hızı sağlanan basit bir tablo (Tablo 6) kullanılarak hesaplanabilir. ⁶ istenirse bu oran post-hoc laktat ölçümü ile kontrol edilebilir. Pentoz fosfat yüksek ölçüde aktif olan hücrelerde, örneğin 6-aminonicotinamide olarak yolu inhibitörleri kullanımı glikolitik hız izole etmek için yararlı olabilir. Her iki _CO 2 katkılarının hesaplanması ^- toplam ve laktat türevi ^H + Ekstra Hücresel Asidifikasyon Oranı ve Oksijen Tüketim ölçüleniyon Oranı metabolik aktivite konusunda güçlü ve nicel ifadeler yapmak dışı akı verilerini kullanmak için paha biçilmez bir araçtır.

Tamponlama gücünün ölçülmesi ve araştırma ve istenen veri altında hücreleri için hücre dışı bir akış deneyi optimize etmek için çeşitli değişiklikler dahil olmak üzere, burada tarif edilen prosedürler kullanılarak, dokunulmamış hücrelerde glikoliz oranı, deney şartlarının geniş bir yelpazede altında belirlenebilir. Bu yöntem, bir polistiren yüzey (yapıştırılabilir ya da hücreler veya organellerin) yapışık kültürde büyüyebilen hücreler ile sınırlıdır. Kültürlenmiş hücreler homojen ve konfluent olduğunda yararlı veriler yine de bu bir koşul aralığı üzerinde elde edilebilir olsa en güvenilirdir. Hesaplamalar k hücreleri ise, ancak farklı alt-tabaka ve kısmi oksidasyon ⁶ daha tam oksidasyonu için 0.65 ile 1.0 en fazla ^H + / O olarak ₂ aralıkları, hücrelerin metabolizması bilgisine ihtiyaçnown glikoz oksitlenmesi için, 1.0 bir değer kabul edilebilir.

Sistemlerinde kullanıldıklarında tüm metabolik karakterizasyonu ile ilgili, bu yöntem özellikle yararlı olabilir rağmen burada solunum yolu ve aynı zamanda glikolitik metabolizması arasında bir kayma hücresel ATP kaynağı kök hücre ve tümör kaynaklı kanser hücreleri karakterizasyonu dahil olmak üzere, önemli bir fenotipi muhafaza etmek. Bu ve diğer bağlamlarda metabolik kontrol değişiklikleri anlamak bu hücre tiplerinin deney tasarımı ve analizi sofistike ve doğruluk yüksek derecede sağlayacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pherastar FS	BMG	yok	mikroplaka okuyucu
Denizatı XF-24	Denizatı Biyobilim	n/a	hücre dışı akı aleti
Denizatı XF tahlil plakası	Denizatı Biyobilim	V7-PS	sarf malzemesi
XF Kalibrantı Denizatı Biyobilim		100840-000	çözeltisi
HCl standardı	Sigma	38280	kimyasal
oligomisin	Sigma	O4876	kimyasal
FCCP	Sigma	C2920	kimyasal
Rotenone	Sigma	R8875	kimyasal
Myxothiazol	Sigma	T5580	kimyasal
DMEM	Corning	10-013-CV	orta bileşen
FBS	Corning	35-010-CV	orta bileşen
penisilin / streptomisin	Corning	30-002-CI	orta bileşenli
karbonik anhidraz	Sigma	C2624	kimyasal
96 kuyulu tahlil plakası	Corning	CLS3991	sarf malzemesi
NAD < sup> + < / sup>	Sigma	N7004	kimyasal
LDH	Sigma	L1254	kimyasal