Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Apikal Rezeksiyon Fare Modeli Erken Memeli Kalp Rejenerasyon Eğitim

11.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53488

⸱

23 Ocak 2016

 , 
1Center for Molecular Medicine, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biological Science, China Agricultural University

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada apikal rezeksiyonun adım adım video protokolü gösterilmiştir. Apikal rezeksiyon, memeli kalp rejenerasyonu araştırmalarında son zamanlarda öne çıkan bir cerrahi yaklaşımdır. Bu çalışma, kalp rejenerasyonunun altında yatan mekanizmaya yönelik araştırmalarda standart bir metodoloji olarak apikal rezeksiyonun uygulanmasını teşvik edebilir.

Özet

Kardiyovasküler hastalık nedeniyle yoğun yaşam tarzı değişiklikleri tüm dünyayı veba. Kalp rejenerasyon tamir nedeniyle yaralanma ve hastalık kaybetti kardiyomiyositlerde geri yükleme için büyük umut vaat ediyor. Bazı alt omurgalıların sağlam kardiyak rejenerasyon aksine, erişkin memeli kalpler tipik kalp rejenerasyon ve tamir için asgari kapasiteyi gösterir. Ancak son çalışmalar (P7 P1) 7-1 doğum sonrası gün arasında, yenidoğan fare kalp apikal rezeksiyon (yani cerrahi amputasyon ve sol ventrikül apeks maruz sonra) önemli rejeneratif potansiyelini korur, bulgu ile hatırı sayılır bir bilimsel ilgi uyandırmıştır. Bu bulgu üzerine bir büyük tartışma çoğaltmak veya bu önemli bulgu üzerine genişletmek çabalarında kullanılan çeşitli cerrahi ile ilgili prosedürlere bağlı olabilir. Bu talimatlar dinamik bir fare modelinde apikal rezeksiyon için malzeme ve metodoloji sunuyoruz. Bu kemirgen surviva belirgin adımlarıl cerrahi hipotermi anestezi, torakotomi, kalp ventrikül cerrahi amputasyon ve dikiş ve farelerin kurtarma içerir. Kardiyovasküler araştırmalar için apikal rezeksiyon fare modelinin uygulanmasını genişletmek olabilir açıklanan yaklaşım.

Giriş

Uzayan insan ömrü, önde gelen ölüm nedeni olan kalp yetmezliği de dahil olmak üzere yaşlanma ve yaşam tarzıyla ilgili çeşitli hastalıklara yol açar. Bununla birlikte, kaybedilen veya işlevsiz kalp kası hücrelerinin yerine konmadan, mevcut terapötikler sadece geçici olarak kardiyak fonksiyonu iyileştirebilir1, 2. Bu nedenle, kardiyak rejenerasyon ve onarım için yenilikçi stratejiler keşfetmek ve geliştirmek gerekir. Yetişkin memeli kalbi sınırlı rejeneratif potansiyele sahiptir. Urodele amfibileri ve teleost balıkları gibi daha düşük omurgalılardan yapılan çalışmalar, kalp yenilenmesinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlamıştır3, 4. Son zamanlarda, insan kalbi rejenerasyonu için gerekli olan evrimsel olarak daha korunmuş patofizyolojik olayların tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlayabilecek bir yenidoğan fare kalp rejenerasyonu modeli ortaya çıkmıştır5.

Apikal rezeksiyon, sol ventrikül apeksinin cerrahi olarak çıkarılmasını ifade eder. Bu prosedür, yaşlı farelerde yüksek ölümcüllüğü nedeniyle 1 ila 7 günlük (P1 ila P7) farelerle sınırlıdır6. Apikal rezeksiyon sonrası yenidoğan farelerde kardiyak rejenerasyon sürecinin aşağıdaki gibi olması beklenmektedir: (I) apeksi kapatmak ve kan kaybını önlemek için hızlı ve etkili bir hematom oluşumu; (II) kardiyomiyosit rejenerasyonu ve sistolik fonksiyonun restorasyonu5, 7. Son çalışmalar, bu model8-11'in önemi ve etkinliği üzerine tartışmaları teşvik etti. Bu nedenle, apikal rezeksiyonun açık ve ayrıntılı bir şekilde sunulması önemlidir. Bu amaçla, bu protokol, önceki bir protokol6'ya dayanarak apikal rezeksiyonu nasıl yaptığımın bir videosunu canlı ve özel olarak açıklamaktadır.

Kardiyak rejenerasyonun altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, kalp yetmezliği1, 2 gibi kardiyomiyositlerin kaybı ve/veya yaralanması ile karakterize kalp hastalığının tedavisi için önemlidir. Kardiyak rejenerasyon araştırmalarında apikal rezeksiyonun mevcut ve umut verici ilerlemesi göz önüne alındığında, bu çalışma bu tekniğin kullanımını ve kardiyak rejenerasyon araştırmalarında kullanımlarını teşvik edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fare deneyleri protokol numarası H0083R3 ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) de Hayvan Bakımı ve Kullanımı Programı tarafından kabul edildi. NHLBI IACUC analjezik olmadan protokolü onayladı.

Yenidoğan Farelerde 1. Hipotermi Anestezi

  1. Ameliyat öncesi bir otoklav içinde sünger ve cerrahi ekipman sterilize edin. Tüm cerrahi malzemelerin hazırlayın ve 270 ° C 240 ° C'ye ulaşması önceden sıcak bir boncuk sterilizatör 15-20 dk açın.
  2. Taze yatak ve yuvalama materyalleri ile temiz fare kafesine kendi hemşirelik anneden tüm C57BL / 6 yavrular (yaş P1) aktarın. Yavruların bir ameliyat odasına alınır sonra, onların zaman anneden ayrılmış geçirdi ve anne markada riskini azaltmak için en aza indirmek için derhal apikal ameliyat.
  3. Bir buz yatakta sünger koyun ve ~ 3 dk hipotermi anestezi elde etmek için daha sonra sünger tek yavru yerleştirin. Ap gözlemleyerek anestezi onaylayınnea ve akinezi ve arka ayak kısma. Çok az zaman yavru akinetik ve apne ve hayatta kalma oranını 12 düşürebilirsiniz anestezi aşırı süresini yapmaz nedeniyle sık sık yenidoğanların durumunu kontrol edin.

2. Torakotomi

  1. Cerrahi Benchtop alanı üzerine buz yataktan yavru aktarın ve bir yatar pozisyonda kolları, bacakları ve kuyruk hareketsiz hale getirmek için bandı kullanın.
  2. Betadin kullanarak göğüs dezenfekte ve yavaşça bir% 70 alkol hazırlık takımını kullanarak temizleyin.
  3. Bir Vannas Bahar Makas kullanarak göğüs boşluğunun ortaya interkostal alanı boyunca enine cilt kesisi yapın ve sonra kalp erişimi kolaylaştırmak için ileri interkostal kasları disseke künt.
    NOT: kan kaybı, cerrahi işlem sırasında minimize edildiğinde sağkalım oranları artırmak.

Kalp Ventriküler Apex 3. Cerrahi Amputasyon

  1. Elle nazikçe exteriorize karın üzerinde baskı uygulamakkalbin apeksi. Net görüntüleme için steril pamuk uçlu aplikatörler cerrahi alanı çevresinde kan emer. Sahte çalışan kumanda yenidoğanlarda için, 4 (Sütür ve Farelerin Kurtarma) Adım doğrudan devam.
  2. Bir büyüteç lamba ve makas iridektomi kullanarak altında yavaşça LV odası açığa çıkana kadar sol ventrikül (LV) parça parça rezeksiyonu gerçekleştirin. LV rezeksiyon bölümlerini en aza indirmek için dikkatli olun. Yaklaşık% 15 rezeksiyon LV odasının optimum pozlama sağlamak için gereklidir.
  3. LV odası maruz kez kalp göğüs boşluğu döner emin olun.

4. Sütür ve Farelerin Kurtarma

  1. Steril Proline 6-0 sütür kullanarak göğüs boşluğuna mühür birlikte kaburga ve kasları sütür ve daha sonra dikkatlice cilt yapıştırıcı kullanarak cilt kesi siteyi kapatın.
  2. Kurtarma için ~ 3 dakika boyunca bir ısı lambası altında yenidoğan ısıtın ve bir% 70 alkol Hazırlık pedi befo kullanılarak, kan ve tutkal izlerini temizlemekonun littermates onu reintroducing yeniden. Anneden ayrı harcanan zamanı minimize apikal rezeksiyon sonrası yavru hayatta kalma artırır, çünkü 10 dakika içinde tüm cerrahi prosedür tamamlamaya çalışın.
  3. Her Ameliyatı takiben, tam sterilizasyon yaklaşık olarak 20 saniye boyunca sıcak boncuk sterilizatör taneleri ile temas cerrahi aletler yerleştirin. Cerrahi aletler her ameliyat öncesi oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  4. Bir çöp tüm yavruların için ameliyat tamamladıktan sonra, annenin yuvaya onları dönmeden önce annenin yatak ve dışkı ile yavrular karıştırın.
    NOT: Genellikle ICR / CD-1 fareler daha bakıcı C57BL / 6 den anne, hatta aynı genetik kökenli emziren anneler arasında, teşvik içgüdüleri değişir. Hemşirelik anne, değişen anne markada tarafından ölümlerini azaltmak hemşirelik anneye P0 yavrular kaldırmak ve daha sonra P1 apikal rezeksiyon gerçekleştirmek için gerekirse. Sadece sahte işlemi veya apikal r ya gerçekleştirmekYavruların bir çöp içinde esection, karıştırma sahte ve cerrahi yavrular yavruların 6 cerrahi grubunun sağkalım oranlarını azaltmak çünkü.

5. Post-Cerrahi Analizi

  1. Bir gün ameliyat sonrası, yavrular izlemek sham ve cerrahi gruplar arasında hiçbir fark yoktur emin olun ve hayatta kalma oranını ölçmek için yavruların sayısı. Ameliyatlar düzgün yapılırsa, sağkalım oranları sham ve cerrahi her iki grupta da benzer ve daha fazla% 60 olması gerekmektedir.
  2. Kalp izolasyonu ve tespit.
    1. Günlerde 1 de yavrular ve servikal dislokasyon ile ölüm güvencesi ile CO2 ile Dekapitasyon ve gündüz 21 sonrası ameliyat yoluyla 2 sonrası ameliyat Euthanize, daha sonra% 70 alkol hazırlık kullanarak göğüs temizleyin.
    2. Göğüs orta hat cilt ve kas insizyon ve sonra kutuyu açın.
    3. Göğüs boşluğundan tüm kalpleri tüketim ve% 4 paraformaldehid O / RT'de N 5 ml Her numunenin tüm kalbini düzeltmek.
  3. Bir sonraki gün,% 70 etanol örnekleri aktarın. Numuneler parafine önce bir haftaya kadar saklanabilir.
  4. Dilim 5 mikron kalınlığında parafin tüm ventrikül ile bölümleri ve rejeneratif yanıtı 5, 7 incelemek için standart hematoksilen ve eozin (H & E) ve Masson trikrom gerçekleştirin. Özellikle, H & E boyama kas değiştirme incelemek için kullanılır ve Masson Triclırome boya kullanılır fibrotik yanıtları 5 incelemek için.
  5. Ilgi alanı seçin ve elle bir slayt tarayıcı kullanılarak örnek başına en az üç odaklar kurdu. Görüntü ve varsayılan parametrelerle üreticinin talimatlarına göre 40 × büyütmede boyama slaytlar analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare yavrular 1, 2, ve 21 gün sonrası apikal rezeksiyon ötenazi ve kalpleri H & E ve Masson Trikrom leke toplandı. Masson trikrom boyamada Mavi renk epikardiyal ekstraselüler matriks 5 birikimini gösterir. Şekil 1A gösterildiği gibi başarılı apikal rezeksiyon, bir kan pıhtısı etkili LV, bir gün sonrası apikal rezeksiyon kapamak için oluşturulmuştur. Kan pıhtısı ve erken kalp fibrozis kademeli erimesi gözlenir ve miyokardın tam rejenerasyon 21 gün apikal rezeksiyon sonrası (Şekil

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kardiyak rejenerasyon, kalp yetmezliğinin tedavisi ve önlenmesi için potansiyel gösterir1, 2. Hayvan modelleri vazgeçilmezdir ve kardiyak rejenerasyonun nasıl gerçekleştiğini anlamada kritik bir rol oynar3-6. Birçok amfibi ve balık, yaralanmaya tepki olarak kalp dokusunu yeniler ve insan kardiyovasküler hastalığı hakkındaki anlayışımız hakkında fikir verir13, 14. Bununla birlikte, evrim açısından, patofizyoloji, bir fare modeli ile insanlar arasında daha fazla korunmalıdır. Memeli hayvan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu yazı için Yayın ücretleri Dr. Jian Hou Güzel Bilim Araçlar hediye sponsorluğunda bulundu.

Teşekkürler

Yazarlar Dr teşekkür. James Hawkins, Ulusal Kalp, Akciğer gelen Zu-Xi Yu ve Xuan Qu ve fare ameliyat hazırlanması ve parafin kesitlerin boyanması ile yardım için Kan Enstitüsü (NHLBI). Yazarlar editoryal yardım için NIH Fellows Yayın Kurulu minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Olsen-Hegar Makaslı İğne Tutucular, 1.5 mmİnce Bilim Aletleri12002-12
Vannas Yaylı Makas - 2 mm Kesici Kenarİnce Bilim Aletleri15000-03İridektomi makası
Sıcak Boncuk SterilizatörüGüzel Bilim Araçları18000-45
İris Forseps, Düz, Tırtıklıİnce Bilim Aletleri11064-07
İris Forseps, Kavisli, TırtıklıGüzel Bilim Aletleri11065-07
Shea Makas - Kavisli/Künt-Künt/12cmGüzel Bilim Aletleri14105-12
Yuvarlak Saplı Sütür Bağlama Forsepsleri, DüzGüzel Bilim Aletleri18025-12
Yuvarlak Saplı Vannas Yaylı MakasGüzel Bilim Aletleri15400-12
İnce HemostatGüzel Bilim Aletleri13007-12
Büyüteç LambasıLuxolamp CorpIM120 
Isıtma lambasıBrandt Equipment llc51152/3
6-0 Prolene sütürlerEthicon8889H
Cilt tutkalı-Vetbond Doku Yapıştırıcısı 3M 1469
Steril Pamuk Uçlu AplikatörlerDynarex4305
WEBCOL Alkol Hazırlama PediCovidien6818Orta 2 KATLI, 200/KUTU, %70 İzopropil Alkol ile Doymuş
Kür Çok Amaçlı SüngerlerCovidien9024Dokumasız 4 KAT, 4 "x4" (10,2 cm&kez; 10,2 cm)
Tezgah üstü koruyucu levhaKIMTECH SCIENCE754618" x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50
%0,9 Sodyum Klorür, 250mlHospira Inc.NDC 0409-6138-22
Betadine Çözeltisi SwabsticksPurdue Ürünleri LPNDC 67618-153-03
OtoklavTOMY Dijital BiyolojiSX-700YÜKSEK BASINÇLI BUHAR STERILIZATÖRÜ
Slayt tarayıcıHAMAMATSUNanoZoomer 2.0-RS

Kaynaklar

  1. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
  2. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
  3. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
  4. Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
  7. Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
  8. Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
  9. Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2(2014).
  10. Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
  11. Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
  12. Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
  13. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).
  14. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. , 326-335 (2011).
  15. Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
  16. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yenido an FareTorakotomiHipotermi AnestezisiParaformaldehit FiksasyonuHematoksilen BoyamaMasson TrikromLam Taray cSa kal m Oran
Apikal Rezeksiyon Fare Modeli Erken Memeli Kalp Rejenerasyon Eğitim
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.