Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Özet

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Özet

Bu video, Thy1-GFP transgenik fare hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki (RSC) nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, davranışsal manipülasyonların in vivo olarak nöronal morfolojideki değişikliklerle korelasyonunu araştırmak için bir olasılık yaratır.

Kraniyal pencere implantasyon işleminin sadece namlu alanı gibi kolay erişilebilir korteks bölgeleriyle sınırlı olduğu düşünülüyordu. Yaklaşımımız, yüksek derecede vaskülarize RSC'deki nöronların görselleştirilmesine izin verir. RSC, daha önce in vivo iki fotonlu görüntüleme için sorunlu olduğu düşünülen, uzamsal hafızadan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurudur.

RSC üzerindeki kraniyal pencere implantasyonu, dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV^mCherry) enjeksiyonu ile birleştirilir. İfade edilen mCherry, hipokampustan RSC'ye aksonal projeksiyonlara yayılır ve korteksteki hem presinaptik aksonal boutonlardaki hem de postsinaptik dendritik dikenlerdeki değişikliklerin görselleştirilmesini sağlar.

Bu teknik, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Giriş

İki foton mikroskopi yaşayan ve hayvanları davrandığını beyin aktivitesinin gözlem devrim. 1990 yılında piyasaya sunulmasından bu yana hızla popülerlik kazanmıştır ve şimdi in vivo ^1,2 beyin aktivitesinin birçok yönleriyle incelenmesi yönünde en ilginç ve yenilikçi yaklaşımlarından biri olarak uygulanır. Bu uygulamalar ve nöronal hücrelerin morfolojisi (kalsiyum seviyesi göstergeleri veya erken genler ifade kullanarak, örneğin) kan akım ölçümleri, nöronal aktivasyon dahildir. Laboratuvarların sayısı giderek artıyor in vivo beyin görüntüleme için yeni bir standart olarak bilimsel dünyada tekniği uygulayan, iki foton mikroskopları kullanın.

Standart yaklaşım kafatası pencere implantasyon varil ya da fare beyninin ³ görsel korteks üzerinde (bir kapak camı ile kapatılmış kafatasına bir yuvarlak delik) içerir. Daha sonra, deney protokolüne göre, MMse zaman ^4,5 üzerinde beyin aktivitesi ve nöronal morfoloji değişiklikleri izlemek için izin, görselleştirme ve davranışsal eğitim oturumları bir dizi uğrar. Her iki durumda da kraniyotomi sadece sütürler geçmeden, parietal kemik etkiler. Büyük ölçüde tekniğin başlıca dezavantajı, bu tür hazne ya da görsel korteksin kolayca erişilebilir korteks için sınırlı bir uygulama olduğuna inanılmaktadır. diğer bölgelere göre kraniyal pencere implantasyonu nedeniyle aşırı kanama ve / veya uzaysal engel için, zorluklar bir çok oluşturmaktadır.

Bu yazıda in vivo mikroskopi ⁶ iki-foton ilgi başka bir olası bölge olarak retrosplenial korteks (RSC) Yukarıdaki kraniyal pencere implantasyonu öneriyoruz. RSC uzaysal oluşumundan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurdur. Anatomik, RSC kortikal, hipokampal ve talamik bölgeleri ⁷ bağlayan bir nöronal ağın bir parçasıdır. Buağır gibi uzamsal öğrenme ve nesli yanı sıra mekansal navigasyon ⁶ gibi davranışların, bir dizi çıkıyor.

Nöronların morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için biz Thy1 promoteri altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik fare hattı kullanır. Bu farelerde, GFP iki foton mikroskopi ⁸ kullanarak kortikal akson ve dendritler net görüntülenmesi için izin beyindeki nöronların yaklaşık% 10 olarak ifade edilir. Biz teklif Başka bir yenilik RSC projelendirme beynin derin yapılara bir nöron spesifik CaMKII promotör ⁹ altında kırmızı floresan proteini (mCherry) kodlama bir rekombinant adeno-ilişkili virüs serotipi 2/1 (/ 1 RAAV2) enjekte edilmesidir hipokamp gibi. Thy1-GFP fare hipokampusunda rAAV2 / 1 ^mCherry sentezleme Hippocampo-cortica öncesi ve postsinaptik elemanlarının aynı anda görüntülenmesi sağlarl ¹⁰ sinapsların. Protein aksonal terminallerde yeterli düzeyde ulaşmasını mCherry rAAV güdümlü ifade iki ila üç hafta gerektirir. Bu süre Kraniotomi kurtarma için gerekli her zamanki saatinde ile tutarlıdır.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürleri Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü, Polonya Bilimler Akademisi Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi.

Not: ilişkili videoda bazı sahneler hızlanır. Hız faktörü bu sahneler gösterilir.

1. Cerrahi Hazırlık

1. otoklav sıvıların ve pamuklu için tüm araçları, cam kapları sterilize. vazgeçilebilir eldiven kullanın. Cerrahi tablo, stereotaksik çerçeve ve% 70 etanol ile tüm çevresi temizleyin. tüm sterilize ekipmanlar için steril bir alan yaratmak için steril cerrahi takımını kullanın. Küçük parçalar halinde gelfoam kesin ve steril tuzlu su içinde bekletin.
   Not: Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu göre, etanol sterilant ne de üst düzey dezenfektan ne olduğunu. Sadece daha önceden sterilize edilmiş yüzeyler üzerinde bir temizleme / yağ ayırma maddesi olarak kullanılır.
2. th hayvan koymake indüksiyon odası ve / dk 2 L% 5 izofluran seviyesini ve oksijen akışını ayarlayın. Bu işlem yaklaşık 3 dakika sürer.
3. indüksiyon odasının dışında hayvan alın. Hayvan tamamen uyuşturulmuş sağlamak amacıyla kuyruk ya da ayak Kıstırmaları kullanın.
4. kesin bir düzeltici gözlerine kadar (kulak arası) başın arka saç tıraş kullanma.
5. stereotaksik çerçeve hayvan koyun ve kulak çubukları ile baş stabilize.
6. % 1.5-2 izofluran ve 0.3 L / dk oksijen anestezi seviyelerini ayarlayın.
7. göz merhemi sürün.
8. sırasıyla, iltihap, ağrı ve enfeksiyonu önlemek için Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) ve Baytril (5 mg / kg) ile, hayvan deri altına enjekte edilir.
9. Beyin şişmesini önlemek Deksametason hayvan intramüsküler (0.2 mg / kg) enjekte edilir.
   Not: Deksametazon deri altından enjekte ya da periton boşluğu içine, kas hasarını önlemek mümkündür.
10. s kullanarak cilt temizlemekBetadine ile terile pamuklu% 70 etanol ile izledi.
11. eldiven değiştirin ve% 70 etanol ile sprey.
    Not: Steril alan dokunmayın atılabilir eldivenler kullanırken. Sadece steril cerrahi aletler ve steril bezlerden uçları ile hayvan dokunun.

2. Kafa Pencere Cerrahisi

1. forseps ile cilt kaldırın ve mikro makas gözler arasında ön noktaya eğik sonra kafa tabanı boyunca yatay olarak cilt insizyon ve kullanma. flep çıkarın.
2. aşırı kanama ve ağrıyı önlemek için periost üzerinde steril bir bez ile lidokain merhem sürün.
3. periost kaldırmak için steril pamuklu çubuklarla veya bir neşter kullanın. Steril bezlerden ile kafatası kurulayın.
4. Steril bir iğne kullanarak onları hareketsiz ve diş çimento ile temas önlemek için deri kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. tutkal kurumasını bekleyin.
5. t üzerinde steril, 3 mm coverglass Laylambdoidea'nın sütür ile öne o kafatası. RSC de lamel merkezi koordinatları: AP, Bregma -2.8; ML, steril bir iğne ile kafatası yüzeyi çizilmeye tarafından 0. Mark lamel kenarları bregma. % 70 etanol ile, steril kap içine geri coverglass koyun.
6. 3 mm çaplı daire anahat küçük çaplı çapak ile yüksek hızlı diş matkap kullanın. steril tuzlu batırılmış çubuklar ile kemik tozundan sondaj sahasını temizleyin. zaman zaman kanamayı durdurmak ve kemik temizlemek için gelfoam ve bezlerden kullanın.
7. sondaj arasında hafifçe kemik daire dokunmadan ve hareketliliğini kontrol ederek ince forseps ile kemik kalınlığı kontrol edin. Kemik sütür alanının üzerinde kalın olduğunu unutmayın. Kemik daire mobil ve kemik sadece bir hatta ince tabaka çevresi üzerinde bırakıldığında sondaj durdurun. tuzlu batırılmış çubuklar ile kalan tüm kemik tozu operasyonel alanını temizleyin.
8. delinmiş CIR kapsayan, delme alanına steril tuz bırakındöngü. Dikkatlice sonra yavaşça ince forseps ve kemik daire gözetlemek ama sıkıca yukarıya doğru kaldırarak kemiği kaldırmak. dura olası hasarları önlemek için kaldırarak kemik daire çarpık için dikkatli olun.
9. Yavaşça kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için dura üzerine steril serum fizyolojik ile ıslatılmış gelfoam uygulayın. Tüm kanama tamamen durana kadar bekleyin. Dikkatle pıhtılaşma sürecini rahatsız etmeyecek gelfoam kaldırın.
   Not: Bu noktada kanama derin olarak kanıtlamak olabilir bu yüzden dikiş alanı, çok kanlanan olduğunu. Kanama tamamen durdurmak için yeterli bir süre beklemek gereklidir. Buz üzerine yerleştirerek soğutulan tuzlu batırılmış gelfoam tutmak için yararlıdır.

3. Virüs enjeksiyonundan

1. stereotaktik kuleye infüzyon pompası takın ve denetleyici bağlayın.
2. şırınga içine 35G iğne takın. sterilize etanol şırıngayı 10 kez yıkayın ve steril tuzlu su ile 10 kat e izlerini silmek için-metanol. şırınga hava kabarcıklarını çıkarın. pompası içine şırınga yerleştirin.
   Not: diğer dezenfektanların kullanmayı düşünün.
3. (10 ¹² pfu tavsiye edilir) RAAV2 / 1 ^MCherry hazırlanması tek doz çözülme ve buz üzerinde tutmak. virüs çözümü ile şırınga doldurun.
4. Bregma üzerinde iğne ortalamak ve sonra yavaşça aşağıdaki koordinatları kullanarak hipokampus takın: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Bu koordinatlar Kraniotomi kenarına yakın yer alacaktır. Doku stabilize etmek için 5 dakika bekleyin.
5. 50 nl / dak oranında rAAV2 / 1 ^MCherry çözeltisi 0.7 ul enjekte edilir. Virüs tamamen adsorbe için 10 dakika bekleyin. Yavaşça iğneyi çıkartın. Kanama oluşursa gelfoam ile kurulayın. kontralateral site ile tekrarlayın.

4. Kafa Pencere İmplantasyonu

1. delinmiş daire çerçeve içinde dura üstüne steril, kuru coverglass yatıyordu. Forc ile coverglass tutuneps hafifçe dura düzleştirmek ve coverglass getirmek için 'kafatası yüzeye yakın kenarları.
   Not: coverglass pıhtı ve kanama devam eder bozan mümkündür. Bu durumda ise, coverglass asansör alkol, kuru yerleştirin ve 2.9 adıma geri dönün.
2. steril bir iğne coverglass kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak kullanılarak kafatası onları takmak için. tutkal kurumasını bekleyin.
3. Kafatasının ön kısmında bir sabitleme çubuğu (M2 somunu veya ısmarlama tasarım) yerleştirin. bar kenarlar üzerinden siyanoakrilat tutkal sürün. tutkal kurumasını bekleyin.
   1. oturumu görüntüleme sırasında kafatası pencerenin yatay konumlandırma sağlayacak bir konuma tespit çubuğunu yerleştirin. penceresinden mümkün olduğunca uzak yerleştirin. o pencereye çok yakın yerleştirilirse, ısmarlama tutucu ile bağlayan çubuk ve vida görüntüleme işlemi sırasında hedefi için bir engel olarak poz olabilir.
4. diş akrilik hazırlayın ve camın etrafında kafatası yüzeyinde uygulayın. Pencere etrafında bir krater benzeri şeklini yararlıdır. Su amacı ile görüntüleme için daha sonra uygulanacak su için bir oyuk oluşturur.
5. kranial pencerenin etrafında krater takviye operasyonel alanda, deri kenarları, tespit çubuğunun geri kalanını kapsayan diş akrilik bir kap oluşturun. Diş çimento sertleşmesine bekleyin.
6. stereotaksik çerçeve hayvan çıkarın ve kurtarma odasına koydu.
7. fizyolojik fonksiyonlarını izlerken hayvan ameliyatın bekleyin.
8. 48 saat boyunca post-operatif analjezi (karprofen, 10 mg / kg) ve antibiyotik tedavisi (Baytril, 5 mg / kg) uygulanır.

5. Görüntüleme

1. kadar güç mikroskobu, Sapphire lazer: Ti başlatın. Bu deneyde kullanılan sistem bir iki-fotonlu lazer, OPO sistemi ve çift GaAsP PMT ile donatılmıştır.
2. induc hayvan koyunyon odası ve anestezi neden.
3. mikroskop altında gaz anestezi maskesi indüksiyon odası ve yerden hayvan çıkarın. 0.3 L / dak oksijen akışını ve% 1.5-2 izofluran konsantrasyonu azaltır.
4. M2 vida (veya başka bir özel sistemi) ile özel mikroskop çerçeveye hayvan sabitleyin. kranial pencereyi dengeleyin.
   Not: Belirli özel kare daha iyi sonuçlar (geliştirilmiş kafa istikrar, kronik deney sırasında birden oturumlarda sabit konumlandırma) verir rağmen, mikroskop üreticinin baş sabitleme sistemini kullanmak mümkündür.
5. retrosplenial korteksin kenarlarından birinde widefield mikroskop ayarları ve düşük büyütme objektif merkezi görünümü kullanarak ve lamel yüzey üzerine odaklanır.
6. krater benzeri akrilik kuyuya bir su damlasının uygulanır. Bir uzun mesafe suya daldırma hedefi geçin. Su menisküs con kadar kafatası pencereye doğru hedefe taşımaknumune ve objektif nects.
7. iki foton ayarlarına geçin ve en düşük zum kullanarak alt numune üst taramaya başlar. dura mater geçiş yüksek spesifik olmayan sinyalin bir parlama olarak görünür olacaktır.
8. tüm dinamik aralığını karşılamak için floresan hücrelerden sinyal gücüne göre her iki kanal (GFP ve mCherry) mikroskop satın alma ayarlarını yapın.
9. (Diğer hücrelerden ayrılmıştır dendritik ağaç ile) uygun bir nöron bulduktan sonra düşük zum ve 5 mikron z mesafe sadece GFP filterset kullanarak bir ilk tarama yapar.
10. Taranan yığınının maksimum projeksiyon elde etmek ve (ters renkleri kullanarak) ek açıklamalar için yazdırabilirsiniz.
11. İstenilen morfolojik ayrıntıları görüntüye sağlayacak bir değere zum ayarlayın. Görüntü rehber olarak maksimum projeksiyon kullanılarak GFP ve mCherry kanallarında tüm dendritik ağaç.

Sonuçlar

Thy1-GFP raportör fare nöronların bir alt GFP tanımı kortikal dendrit ve RSC lokal akson çıkıntıların in vivo görüntüleme karşılaştırın. Şekil 1A görebilir birden GFP pozitif dendritler ile görüntülerin bir yığının en projeksiyon gösterir. Hücre gövdesi bir arter altında kalmıştır. Şekil 1B 1A belirtilen dendritik şube tek bir düzlem uzaklaştırdınız görüntü (dijital zoom 3x) gösterir. dendritik morfoloji (dikenler, filopodia) Detayları açıkça gö...

Tartışma

Geçerli yazıda kranial pencereden RSC sinaptik giriş ve postsinaptik hedeflerin in vivo görüntüleme eş zamanlı iki foton için bir protokol mevcut. implantasyon prosedürü birkaç anahtar aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, hayvan derin anestezi ve stereotaktik çerçeve sabittir, daha sonra RSC üzerinde kafatası belirgin bir dairesel çizgiler boyunca matkap ve dairesel kemik kaldırılır ile inceltilir. Kanama durdurulduktan sonra, RAAV2 / 1 ^MCherry hipokampus enjekte edilir ve kapak cam delinmiş alana kafa...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İlaç< / güçlü >
İzofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	Ameliyat öncesi% 5-2
İzofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	Ameliyat sırasında% 1.5-2
Deksametazon	Taraması Veteriner	Deksazon: 2mg / ml	0.2 mg / kg kas içi
Baytril	Bayer	2.50%	5 mg / kg deri altından
Tolfedin	Vetokinol	%	4 4 mg/kg deri altından
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg deri altından
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg deri altından
Lidokain	Jelfa	Lignocainum	topikal
olarak
Cerrahi< / güçlü >
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Göz merhemi	Dedra	Lubrithal	topikal CA
yapıştırıcı	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental akrilik	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaksik çerçeve	Çalma	51500D
< güçlü > Alet < / güçlü >
Coverglass	Harvard Aparat	HSE-64-0720	3 mm çap
Diş matkabı	Sigmed	Keystone KVet
Sabitleme çubuğu	Özel yapım	N/A	M2 veya M3 vida somunları kullanılabilir
Forseps	Renex	PN-7B-SA
Mikro makas	Falcon	BM.183.180
Diseksiyon mikroskobu	KOZO	XTL6445T
< güçlü > Görüntüleme< / güçlü >
Tutucu çerçeve	Özel yapım	N / A
İki fotonlu mikroskop	Zeiss	Dik Axio Examiner Z1	Lazer ünitesi: Optik Parametrik Osilatör 1050-1300nm ile Tutarlı Bukalemun 690-1040nm. Hedefler: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 ve LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Algılama: Zeiss bant geçiren filtreler BP 500-550 (GFP) ve BP 570-610 (mCherry), 560nm'de ışın ayırıcı ile ayrılmış ve iki GaAsP fotodetektöre bağlanmıştır.
Reaktif< / güçlü >
	K. Deisseroth'tan		CaMK promotörü kontrolü altında floresan protein mCherry eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV)

Lidokain Jelfa 20 mg/g hediyesi