Eşzamanlı İki foton İn Vivo Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Summary

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Abstract

Bu video, Thy1-GFP transgenik fare hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki (RSC) nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, davranışsal manipülasyonların in vivo olarak nöronal morfolojideki değişikliklerle korelasyonunu araştırmak için bir olasılık yaratır.

Kraniyal pencere implantasyon işleminin sadece namlu alanı gibi kolay erişilebilir korteks bölgeleriyle sınırlı olduğu düşünülüyordu. Yaklaşımımız, yüksek derecede vaskülarize RSC'deki nöronların görselleştirilmesine izin verir. RSC, daha önce in vivo iki fotonlu görüntüleme için sorunlu olduğu düşünülen, uzamsal hafızadan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurudur.

RSC üzerindeki kraniyal pencere implantasyonu, dorsal hipokampusa mCherry eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV^mCherry) enjeksiyonu ile birleştirilir. İfade edilen mCherry, hipokampustan RSC'ye aksonal projeksiyonlara yayılır ve korteksteki hem presinaptik aksonal boutonlardaki hem de postsinaptik dendritik dikenlerdeki değişikliklerin görselleştirilmesini sağlar.

Bu teknik, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Introduction

İki foton mikroskopi yaşayan ve hayvanları davrandığını beyin aktivitesinin gözlem devrim. 1990 yılında piyasaya sunulmasından bu yana hızla popülerlik kazanmıştır ve şimdi in vivo ^1,2 beyin aktivitesinin birçok yönleriyle incelenmesi yönünde en ilginç ve yenilikçi yaklaşımlarından biri olarak uygulanır. Bu uygulamalar ve nöronal hücrelerin morfolojisi (kalsiyum seviyesi göstergeleri veya erken genler ifade kullanarak, örneğin) kan akım ölçümleri, nöronal aktivasyon dahildir. Laboratuvarların sayısı giderek artıyor in vivo beyin görüntüleme için yeni bir standart olarak bilimsel dünyada tekniği uygulayan, iki foton mikro....

Protocol

Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürleri Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü, Polonya Bilimler Akademisi Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi.

Not: ilişkili videoda bazı sahneler hızlanır. Hız faktörü bu sahneler gösterilir.

1. Cerrahi Hazırlık

1. otoklav sıvıların ve pamuklu için tüm araçları, cam kapları sterilize. vazgeçilebilir eldiven kullanın. Cerrahi tablo, stereotaksik çerçeve ve% 70 etanol ile tüm çevresi temizleyin. tüm sterilize ekipmanlar için steril bir alan yaratmak için steril cerrahi takımını kullanın. Küçük parçalar halinde gelfoam kesin ve steril tuzlu su içinde bekletin.

Results

Thy1-GFP raportör fare nöronların bir alt GFP tanımı kortikal dendrit ve RSC lokal akson çıkıntıların in vivo görüntüleme karşılaştırın. Şekil 1A görebilir birden GFP pozitif dendritler ile görüntülerin bir yığının en projeksiyon gösterir. Hücre gövdesi bir arter altında kalmıştır. Şekil 1B 1A belirtilen dendritik şube tek bir düzlem uzaklaştırdınız görüntü (dijital zoom 3x) gösterir. dendritik morfoloji (dikenler, filopodia) Detayları açıkça gö.......

Discussion

Geçerli yazıda kranial pencereden RSC sinaptik giriş ve postsinaptik hedeflerin in vivo görüntüleme eş zamanlı iki foton için bir protokol mevcut. implantasyon prosedürü birkaç anahtar aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, hayvan derin anestezi ve stereotaktik çerçeve sabittir, daha sonra RSC üzerinde kafatası belirgin bir dairesel çizgiler boyunca matkap ve dairesel kemik kaldırılır ile inceltilir. Kanama durdurulduktan sonra, RAAV2 / 1 ^MCherry hipokampus enjekte edilir ve kapak cam delinmiş alana kafa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
İlaç< / güçlü >
İzofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	Ameliyat öncesi% 5-2
İzofluran	Baxter	AErrane 8DG9623	Ameliyat sırasında% 1.5-2
Deksametazon	Taraması Veteriner	Deksazon: 2mg / ml	0.2 mg / kg kas içi
Baytril	Bayer	2.50%	5 mg / kg deri altından
Tolfedin	Vetokinol	%	4 4 mg/kg deri altından
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg deri altından
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg deri altından
Lidokain	Jelfa	Lignocainum	topikal
olarak
Cerrahi< / güçlü >
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Göz merhemi	Dedra	Lubrithal	topikal CA
yapıştırıcı	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental akrilik	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaksik çerçeve	Çalma	51500D
< güçlü > Alet < / güçlü >
Coverglass	Harvard Aparat	HSE-64-0720	3 mm çap
Diş matkabı	Sigmed	Keystone KVet
Sabitleme çubuğu	Özel yapım	N/A	M2 veya M3 vida somunları kullanılabilir
Forseps	Renex	PN-7B-SA
Mikro makas	Falcon	BM.183.180
Diseksiyon mikroskobu	KOZO	XTL6445T
< güçlü > Görüntüleme< / güçlü >
Tutucu çerçeve	Özel yapım	N / A
İki fotonlu mikroskop	Zeiss	Dik Axio Examiner Z1	Lazer ünitesi: Optik Parametrik Osilatör 1050-1300nm ile Tutarlı Bukalemun 690-1040nm. Hedefler: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 ve LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Algılama: Zeiss bant geçiren filtreler BP 500-550 (GFP) ve BP 570-610 (mCherry), 560nm'de ışın ayırıcı ile ayrılmış ve iki GaAsP fotodetektöre bağlanmıştır.
Reaktif< / güçlü >
	K. Deisseroth'tan		CaMK promotörü kontrolü altında floresan protein mCherry eksprese eden rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV)