Yöntem makalesi

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

15.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53534

⸱

5 Aralık 2015

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, 2Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge

Bu makalede

Özet

Bu protokol, farelerde hamilelik sırasında maternal vaskülatürdeki değişiklikleri değerlendirmek için bir tekniği tanımlar. Stereolojik yöntemler kullanılarak, desidual spiral arterlerin yeniden şekillenmesi kantitatif olarak değerlendirildi ve sonuçlar immünohistokimya kullanılarak kalitatif olarak doğrulandı.

Özet

Plasenta, anne ve fetüs arasında gaz ve besin gibi faktörlerin alışverişine aracılık eder ve anne dolaşımından kan temini için özel talepleri vardır. Maternal uterus vaskülatürünün bu geçici talebe uyum sağlaması gerekir ve bu arteriyel yeniden şekillenme sürecinin başarısının fetal büyüme üzerinde etkileri vardır. Maternal bağışıklık sisteminin hücreleri, özellikle doğal öldürücü (NK) hücreler, bu süreçte kritik bir rol oynar. Burada, fare hamileliği sırasında maternal spiral arterlerin yeniden şekillenme derecesini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Hematoksilen ve eozin ile boyanmış doku kesitleri taranır ve damarların büyüklüğü analiz edilir. Tamamlayıcı bir validasyon yöntemi olarak, normalde gebeliğin ortasında arteriyel vasküler medya içinden kaybolan düz kas aktininin (SMA) immünohistokimyasal tespiti ile yeniden şekillenme sürecinin başarısı için kalitatif bir değerlendirme sunuyoruz. Bu yöntemler birlikte, gebelik fenotipinin önemli bir parametresinin belirlenmesini sağlar. Bu sonuçlar, gebelikle ilişkili komplikasyonların altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi sağlamak için fare gebeliğinin diğer uç noktalarıyla birleştirilebilir.

Giriş

Eutherian Gebelikte besin, gaz ve atık ürünlerin değişimi plasenta aracılık eder. Kadın üreme sisteminde, uterin arterler rahim kan ana kanallar vardır. Yerleştirildikten sonra özel gemiler içine bu şube fetoplasental üniteye doğru desidua bazalisin aracılığıyla kangal spiral arterler denir. Çap ve özellikle rahim doğal öldürücü (UNK) hücrelerinde, lökositler çevrili olan bu spiral arterlerin, esnekliği, plasenta 1,2 hacim ve mevcut kan hızını dikte. Spiral arterlerin yeniden bir sonucu olarak doğru hemodinamik değişiklikler gebelik başarısı için kritik öneme sahiptir.

Altında yatan mekanizmalar insan ve fare gebelik arasındaki detaylı farklılık olsa da, her iki türün de yeniden şekillenme sürecinin nihai sonucu kendi düz kas tabakasını kaybeder dilate, yüksek iletkenlik damar olduğunu. Farelerde, Unk (IF interferon hücresinden türetilmişN-) γ yaklaşık orta gebelik 3-5, bu değişiklikler uyarması gereklidir. NK hücreleri veya IFN-γ sinyal yolunun bileşenlerini ya yoksun fareler bu değişiklikleri geçmesi başarısız ve bu fetoplasental üniteye yeterli kan akımının önemini vurgulayarak, azalmış fetal büyüme 6,7 ile ilişkilidir. Erken insan Gebelik sırasında, interstisyel ve endovasküler trofoblast extravillous işgali ve Unk hücreleri ile etkileşimi damar değişiklikleri uyaran ve fetal büyüme 8-10 teşvik etmek için önemlidir. Unk hücreleri, granülosit makrofaj gibi kemokinler ve sitokinler 11 aracılığıyla insan trofoblast invazyonu orkestra olabilir - koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) 12. Sığ trofoblast invazyonu gibi pre-eklampsi 9 olarak azaltılmış arter remodeling ve gebelik komplikasyonları ile ilişkilidir.

Bu protokol önemli açıklanan Anne Croy öncü çalışmalar dayanmaktadırimmunhistokimya ve zarif transfer deneyleri 5,13 ile başarılı vasküler remodeling için bağışıklık sistemi ve özellikle NK-türevli IFN-y rolü. Burada spiral arterlerin yeniden şekillenme durumunu değerlendirmek için hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklayın. Bizim laboratuvar rutin orta gebelik (gebelik gününde (gd) 9.5) 14 bu değerlendirmektedir rağmen, yeniden şekillenme süreci gd8.5 12,5 15 arasında yer alır. Otomatik slayt tarayıcıları gelişiyle büyük ölçüde kesimlerinden damar ve lümen alanlarının değerlendirilmesi kolaylaştırmıştır ve bu damar çaplarını ölçmek daha tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak bulundu. SMA immünohistokimyasal tespiti eklenmesi stereolojik değerlendirmesinden elde edilen sonuçların basit bir doğrulama için izin verir. Tüm Stereolojik tekniklerin olduğu gibi, en az iki sınav görevlisi tarafından bir kör deney olarak değerlendirmeyi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Seri kesme, bu amaçla, bir rastgele adımı dahil edilebilirting örnekleri slaytları değerlendiren araştırmacılar örneklerin geldiği deney grubu arasından bilmiyorum ki.

Bu protokolün genel amacı dikkatle gebelikle ilgili komplikasyonlar için fare modelleri bağlamında tanımlanmış anne ve baba genotipleri ile farelerde spiral arterlerin biçimlenme değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlamaktır. Sonuçları normal fetal büyüme için gerekli olan bu sürecin Unk hücreleri bağımlılığı stres.

Protokol

Bu yazıda ele alınan tüm prosedürler İngiltere Home Office yönetmeliklerine uygun olarak ve Cambridge Etik İnceleme Heyeti tarafından onaylanmıştır.

1. Numune Toplama

  1. Öğleden sonra (erkek başına 2 kadın kadar) yetişkin erkekler ile 8-12 haftalık dişi C57BL / 6 fareler kullanarak zamanlanmış çiftleşmesi ayarlayın. Erken ertesi günlerde sabah çiftleşme işareti olarak vajinal fişler varlığını kontrol edin. Sabah işaretleri gd0.5 bir tamponun varlığı.
  2. Gd9.5 günü, servikal dislokasyon ile hayvan euthanize ve karın boşluğunu açın. Vazodilatasyon neden olabilir CO 2 ile o ötenazi unutmayın.
  3. Yavaşça rahim atardamarları (Şekil 1, kesikli oklar) bağlanması için diş ipi kullanın. Serviks etrafında yanı sıra yumurtalıklarda her uterin boynuz, proksimal ucundaki arterlerin etrafında ipi bağla.
    Not: Bu çökmüş arterlerde yol açabileceği damarları rüptürü etmeyin.
  4. rahim boynuzları ve serviks ucunda üç ligasyon noktalarına distalde tüm uterusu eksize, diseksiyon makas kullanarak hızlı rahim parçalara ayır.
  5. Her iki boynuz serviksten karşıt yönlerde aynı uzun eksen boyunca hizalanır, böylece hazırlanmış bir polistiren parça rahim yerleştirin. Yavaşça germek ve 2-3 25 G iğneler kullanılarak yerine pin.
  6. Bir hazırlanan 50 ml konik tüp içine polistiren daldırın. % 10 formalin ile 50 ml'ye tamamlayın. Oda sıcaklığında 5-6 saat için düzelt.
  7. Formalin çözeltisi atın ve 5 dakika boyunca 50 ml 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile değiştirin.
  8. , Merkezde servikse proksimale her bir ucunda ligasyonu noktasına ve proksimale iki rahim boynuzları tüketim implantasyon siteleri etrafında herhangi bir aşırı yağ uzak trim ve formalin izlerini silmek için 5 dakika boyunca PBS içinde iki kez yıkayın.
  9. Işlenene kadar (iki hafta), 4 ° C 'de% 70 etanol içinde örnekleri saklayın.
    DİKKAT: EthAnole oldukça yanıcı.
  10. . Tablo 1 'de belirtilen parametreler kullanılarak otomatik bir işleme sistemine kullanarak rahim uzun eksenine dik bir düzlem boyunca kesilebilir ve böylece parafin içinde tek tek boynuz gömün. Bu, her bir implantasyon yeri maksimum alan blok (Şekil 2A) ortasına analizi için maruz garanti eder.
    İSTEĞE BAĞLI: istenirse, bu blok rasgele dağıtım için uygun bir zaman noktasıdır.
  11. Bir mikrotom kullanarak, bloklar 7 mikron kalınlığında seri kesitler halinde kesilmiştir. Hematoksilen ve eozin ile her 49 mikron aralıklarla bir bölüm Leke (H & E, bölüm 2.1). SMA boyama ve diğer downstream uygulamalar için oda sıcaklığında kalan bölümleri saklayın.
Çözüm Zaman Isı
% 70 Etanol 1 saat 40 ° C
% 100 Etanol 1 saat 40 ° C
% 100 Etanol 1 saat 40 ° C
% 100 Etanol 1 saat 40 ° C
% 100 Etanol 1 saat 40 ° C
% 100 Etanol 1 saat 40 ° C
% 100 Etanol 1 saat 40 ° C
1 saat 40 ° C
Ksilen 1 saat 40 ° C
Ksilen 1 saat 40 ° C
Parafin 1 saat 63 ° C
Parafin 1 saat 63 ° C
Parafin 1 saat 63 ° C
Parafin 1 saat 63 ° C
: 21px; "> Ksilen

Tablo 1:. Rahim dokusunun işlenmesi için kullanılan ayar otomatik doku işleme Ayarlar Genel Bakış

2. Stereological Değerlendirme

  1. H & E Boyama
    1. Oda sıcaklığında 10 dakika için% 100 iksilen banyosuna bir slayt rafa monte slaytlar daldırılması ile Deparaffinize bölümleri.
      DİKKAT: Ksilen yanıcı ve temas ve solunması yoluyla toksik bir şüpheli kanserojen olduğunu. Bu çalışma kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanarak, bir davlumbaz yapılmalıdır.
    2. Bir 10 dakika daha temiz bir ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın.
    3. Sırayla 5 dakika her biri için,% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve arı su içeren banyolarında slaytlar bırakın.
    4. 5 dakika boyunca, saflaştırılmış su ile seyreltilmiş,% 50 Gill Resim 3 hematoksilin çözeltisi slaytlar bırakın.
      DİKKAT: Hematoxylin yenmesi ve gözlere temas ederek zararlıdır. Işlerken uygun KKE giyin.
    5. 10 dakika boyunca akan musluk suyu altında bir boyama teknesine slaytlar yıkayın.
    6. 10 sn için (% 70 etanol içinde% 1 10 M hidroklorik asit),% 1 asit / alkol çözeltisi slaytlar bırakınve akan musluk suyu altında bir boyama teknesine yıkayın.
    7. 30 sn eozin çözeltisi içinde slaytlar daldırın ve 10 dakika boyunca akan musluk suyu altında bir boyama teknesine yıkayın.
    8. Bir çeker ocak içinde, ardışık olarak 5 dakika her biri için% 70 etanol,% 95 etanol ve% 100 etanol içeren banyolarında slaytlar bırakın.
    9. 10 dakika boyunca ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın.
    10. Dağı bir ksilen bazlı montaj ortam kullanılarak lamelleri. Mikroskop altında slaytlar görselleştirmek önce davlumbaz yatay ve iyice kurutulur.
  2. Gemi Boyutu ve Tadilat Durumu stereolojik Değerlendirilmesi
    1. Her implantasyon site için midsagital noktasına yakın olan bölümleri belirler. Fetus ve gelişmekte olan plasenta arasındaki koriyoallantoik eki midsagital noktada iyi bir göstergesi olarak hizmet vermektedir.
    2. Analiz için midsagital noktasına yakın 49 mikron aralıklarla 3 bölümden seçiniz. Seçilen slaytlar tarayın. Inc önlemek içinDaha fazla çevresel emplantasyon yeri 16 yer gösterilmiştir luding damarlar, her bir implantasyon bölgesine (Şekil 2A) merkez 2/4 üzerinde analiz kısıtlar.
    3. Lümen boyutunu değerlendirmek için, damarların iç etrafında çizin ve bu şeklin alanını kaydedin. Toplam damar boyutu için, endotel hücreleri, perisitler ve içi lökositler de dahil olmak üzere, kabın dış duvarı etrafında çizin.
      Not: lümen toplam damar büyüklüğü oranı bir geminin yeniden şekillenme durumu için bir proxy. Gemi bölümü boyunca kesilmiştir düzlem boyunca bobin olarak, bir slayt aynı arter birden kesitleri olabilir. Aynı arterde birden çok kez ölçüm kaçının.
    4. En büyük ve roundest lümen her implantasyon sitesinde 5 gemilerden ölçümleri kaydedin. Üç kez, her implantasyon yerinin (üç bölüm birbirinden 49 um aralıklı) ölçün. Bu 15 ölçümleri represe ortalamabüyük gemilerin ortalama çapı NTS.
    5. Bazı örneklerde büyük damarların overrepresentation önlemek için, her implantasyon yeri damarların aynı sayıda ölçer.

Immunhistokimya ile 3. Nitel Değerlendirme

  1. Parafinden arındırma lamların ve Rehidrasyon
    1. Oda sıcaklığında 10 dakika için% 100 iksilen banyosuna ısıya dayanıklı bir slayt raf monte slaytlar daldırılması ile Deparaffinize bölümleri.
    2. Bir 10 dakika daha temiz bir ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın.
    3. Sırayla 5 dakika her biri için,% 100 etanol,% 95 etanol ve% 70 ve saflaştırılmış su ihtiva eden banyolarında slaytlar bırakın.
  2. Antijen Alma
    1. Saflaştırılmış su içinde bir 10 mM sodyum sitrat tamponu hazırlayın ve 10 M hidroklorik asit kullanılarak pH 6 olana kadar ayarlanır.
    2. Yeterli wat içeren bir iç düdüklü tencerede 400 ml sodyum sitrat tamponu ve yeri ile 600 ml tutabilecek bir ısıya dayanıklı bir kap dolduruner kabın yarısını sular altında etmek. Gevşek kaynar kadar düdüklü tencere ve ısı kapağını takın.
    3. Yer slayt sodyum sitrat tamponu içine raf ve sıkı düdüklü tencerenin kapağını sabitleyin. Bir kez basınçlı, 3 dakika için kaynamaya bırakın.
    4. Düdüklü tencere basıncını düşürün ve iç kabı çıkarın. Slaytlar, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sodyum sitrat tampon maddesi içinde soğumaya bırakın.
    5. Yıkama 5 dakika boyunca saflaştırılmış su içeren bir banyo içinde kayar.
    6. Hidrofobik bir bariyer kalem kullanarak bölümleri kuşatmak.
    7. 5 dakika boyunca PBS içinde daldırarak slaytlar yıkayın.
  3. Endojen peroksidaz ve spesifik olmayan bağlanma bloke
    1. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, saflaştırılmış su ile seyreltilmiş% 3 hidrojen peroksit ile bölümleri inkübe edin.
      DİKKAT: Hidrojen peroksit, gözleri, deriyi ve sindirim üzerine son derece tahriş edicidir. Uygun PPE giyin.
    2. Fazla hidrojen peroksit solüsyonu kapalı dokunun ve sli yıkamades kez Tris daldırarak 2 dakika her biri için tuz (TBS) tamponlu.
    3. Fare immünoglobulin imalatçının talimatlarına göre hazırlanmış fare kiti ile ilgili fare bloke edici ayıracı ile bölümleri inkübe edin.
    4. Yıkama 2 dakika her biri iki kez TBS içinde kayar.
  4. Düz kas aktin immunodeteksiyon
    1. (Kitte sağlanan), antikor bir seyreltici çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bölümlere inkübe veya üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir.
    2. 1 seyreltin Antikor Seyreltici çözeltisi içinde 100 fare anti-insan düz kas aktini (DAKO M0851). Nihai immunglobulin konsantrasyonu her iki çözümleri eşdeğer olmasını sağlamak, antikor seyreltici çözeltisi içinde fare IgG2a izotip kontrolü sulandırmak.
    3. Seyreltilmiş antikor veya izotip kontrol çözümleri ile ya aşırı antikor seyreltici çözüm ve kapak bölümleri kapalı dokunun. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odacıkta inkübe edin.
    4. Yıkama için TBS iki kez slaytlar2 dakika her.
    5. Biyotinile edilmiş anti-fare ikincil antikoru ile seyreltilir ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe bölümleri ya da imalatçının talimatlarına göre yöntem.
    6. Yıkama sırasıyla 2 dakika boyunca bir kez, her TBS ve PBS ile kayar.
    7. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın. DAB çözümü ile bölümleri örtün ve aşırı renk gelişimini önlemek için bölümleri izlemek için sağlanması kadar 4 dakika inkübe edilir.
      DİKKAT: DAB yanıcı ve temas ve solunması yoluyla toksik bir şüpheli kanserojen olduğunu. Işlerken uygun KKE giyin.
    8. Boyanmasının istenilen yoğunluğu ulaşıldığında saf su içinde slaytlar bırakın.
    9. 20 saniye boyunca% 50 Gill No. 3 hematoksilen ile Counterstain ve su berrak bitene kadar akan musluk suyu altında bir boyama teknesine yıkayın.
  5. Dehidrasyon ve Montaj
    1. Davlumbaz içinde sırayla% 70 ETH içeren banyolarında slaytlar batırmayınAnole,% 95 etanol ve 5 dakika her biri için,% 100 etanol.
    2. 10 dakika boyunca ksilen içeren banyosunda slaytlar bırakın.
    3. Dağı bir ksilen bazlı montaj ortam kullanılarak lamelleri. Önceden mikroskop altında slaytlar görselleştirmek için bir çeker ocak içinde yatay olarak ve iyice kurutulur

Sonuçlar

Rag2 - / - IL2rg - / - fareler, NK hücreleri 17 dahil olmak üzere tüm olgun lenfositler, eksikliği ve uterin arterler orta gebelik 5,14 yaklaşık konjenik vahşi tipli C57BL / 6 (WT) farelerinde görülen vasküler değişimler geçirirler başarısız. Farenin stereolojik H & E boyalı bölümler görsel ve sayısal olabilir genel olarak daha küçük damarların gösterge önemli ölçüde daha küçük lümen yüzey alanları (Şekil 2) gösteren - / - / - - IL2rg bu azaltılmış remodeling Rag2 bir sonucu olarak. Bundan başka, (lümen oranı damar) göreceli duvar kalınlığı azaltılmış kan temini ve yüksek kan hızının öne bu farelerde, spiral arterler daha yüksektir.

Bu nicel değerlendirme SMA immünohistokimyasal algılama kullanarak teyit edildi. WT fareler damar medyanın içinde SMA en kaybetmek için bu karakteristikortalarında gebelik ile spiral arterlerin. Bu NK hücresi dayalı süreç yer almaz ise, SMA damarların ortam kalır ve kolaylıkla kan damarları (Şekil 3) etrafında halkalar olarak immünohistokimyasal tespit edilebilir.

figure-results-1
Şekil 1: gd9.5 at Fare rahim, rahim boynuzları, serviks (mavi) göreli konumlarını gösteren şematik genel Çizim ve ana uterin arterler (kırmızı).. Rahim boynuzları (oklar) ve ligasyon noktaları (kesikli oklar) uzun ekseni vardır belirtti. Immünohistokimya için bölümler görüş düzlemi boyunca kesilir.

figure-results-2

Şekil 2:. Ikinci trimesterde arteriyel biçimlenme Stereolojik değerlendirilmesi (A) Örnek assedesidua bazalisin merkezi 2/4 yılında luminal ve WT kadınlardan H & E boyanan kesitler toplam damar alanlarının ssment gd9.5 de (dikey siyah ile çizilmiş kesik çizgiler). Yüksek büyütmede damarlarda, kırmızı çizgi, toplam damar alanı, sarı kesikli çizgi lümen alanı demarcates demarcates kesik. Çubuk = 500 um (sol), 50 um (sağ). Rahim uzun ekseni bu yönde yatay bir çizgidir. WT (C57BL / 6) ve Rag2 toplam damar alanı (sağ panel) luminal alanları (sol panel) ve luminal alanına oranının (B) tayini - / - Il2rg - / - fareler (C57BL / 6 arka plan üzerine). Her veri noktası 15 ölçümlerden (bölüm başına 5 ölçümleri, implantasyon site başına 3 bölüm) ortalamasını temsil etmektedir. Barlar n = grup başına 4 gebelikten 11-13 implantasyon siteleri demek temsil ettiği; iki kuyruklu, eşleştirilmemiş Mann-Whitney testi p-değer. WT: vahşi tip.

figure-results-3
Şekil 3:. Decidua basalis düz kas aktin immünohistokimyasal algılama WT (üst) ve Rag2 ilgili Örnek SMA boyama - / - IL2rg - / - gd9.5 de (C57BL / 6 arka plan üzerinde, alt) fareler. Çubuk = 100 um. WT: vahşi tip.

Tartışma

Burada sunulan protokolü başarılı gebelik için gerekli olan damar değişiklikleri değerlendirmek için bir tekrarlanabilir bir yöntem sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu değerlendirme başarısı için kritik doku bölümleri kalitesidir. Her ikisi de doğru güvenilir uterin arterler önemli adımlardır bağlanarak yanı sıra implantasyon sitelerinin gebelik yaşını belirleyen. Vb tespitin zamanında, doku işleme protokolü gibi parametrelerde değişiklikler de sonucu etkileyebilir. Tarafsız bir stereolojik değerlendirme için, her implantasyon sitede gemilerin aynı sayıda ölçmek için önemlidir. Bu implantasyon yeri ve üç kez her implantasyon bölge başına 5 damarları ölçülmesi tavsiye edilir. Bu 15 ölçümün ortalama 5 büyük gemilerin ortalama boyutunu gösterir.

/ - - IL2rg - Daha fazla alymphoid Rag2 verilerine / - fareler Burada gösterilen, biz bu Prot bulunduinhibe NK hücreleri 14 dahil bir vasat maternal bağışıklık fonksiyonunun bir model, bir dizi için yararlı ocol. Arteryel yeniden bozuklukları da bozulmuş trofoblast invazyonu 18 modellerinde gösterilmiştir ve burada tarif edilen teknikler bu durumlarda damar değerlendirmek için yararlı olabilir. Bu optimize edilmiş ve fare orta-gebelikte desidual vasküler yeniden incelenmesi için bu protokolü geçerliliği, fakat diğer model sistemlerinde (örneğin sıçan) ya da diğer organlarda çalışmak için bu protokolü adapte de düşünülebilir. Biz NK-bağımlı biçimlenme sağlam gd9.5 değerlendirilebilir edilebilir bulurken, bu tür anne damar tamamen yenilenmiş olan gd12.5 gibi diğer zaman noktaları için tadil edilebilir. Bu zaman noktasında, trofoblastik istilası 16 daha derin ve bu zaman noktası, damar değişimlerinin trofoblast rolü araştırmalar için daha uygun olabilir. Ek niceliksel okumalar istenirse,Araştırmacılar ayrıca SMA için boyanan kesitler sayısını artırmak ve her implantasyon site içinde kısmen yenilenmiş damarların yüzdesini değerlendirmek olabilir.

Bu protokolün bir sınırlama histolojik muayene açıklayıcı doğasıdır. Fonksiyonel tahliller, ancak, sadece yavaş yavaş (örneğin Doppler ultrasonografi 19 gibi) kullanılabilir hale gelmektedir. Bu teknikler, teknik uzmanlık ve edinme ve ekipmanları korumak için çok daha yüksek masraflar gerektirir, ancak histolojik olarak görülebilir değişikliklerin etkisi için in vivo okuma bir Boyuna sağlama avantajına sahiptir. Tüm stereolojik sınavlar olası bir dezavantajı araştırmacıların öznellik olduğunu. Bu amaçla, bağımsız tüm numuneleri analiz iki bağımsız denetçilerini kullanarak bu sorunu önlemek için yardımcı olabilir. Burada özetlenen protokol fazla kan Fetomaternal arayüzü ulaşabilir nasıl fikir verir iken, bunu compl ile birleştirmek avantajlı olabilirplastik üzerinden damar herhangi bir zamanda kan miktarını değerlendirmek ementary yaklaşımı 16 düşürdü.

Bu protokolün gücü, bağımsız iki yaklaşım birleştirmesidir. Vasküler değişim ilk olarak niceliksel stereology tarafından değerlendirilir ve sonuç daha sonra immünohistokimya kullanılarak nitel doğrulanır. Sonuçların güvenilirliği daha da örnekleri rastgele güçlenmiştir edilebilir. Bu protokol için hazırlanan numuneler de kolayca titizlikle midgestation bir hamilelik fenotip değerlendirmek için, bu tür decidualisation, gebelik (MLAp) veya ilgi hücrelerin İmmuno mesometrial lenfoid agrega gelişme olarak gebeliğin diğer parametreleri incelemek için kullanılabilir.

Arter remodeling kadın ve bu değişikliklerin başarısızlık komplike gebeliklerde önemli bir adımdır harika obstetrik sendromlar (GOS), yani pre-eklampsi, fetal büyüme kısıtlaması ve temelini iseölü doğum. Biz dikkatle GOS patofizyolojisi bazı özelliklerini taklit fare modellerinde bir hamilelik fenotip değerlendirmek için burada teknikleri sunuyoruz.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, yararlı tartışmalar için Colucci laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], Trofoblast Araştırma Merkezi ve İngiliz Kalp Vakfı tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
C57BL/6 fare (8-12 haftalık)Charles River
Diş ipi
PolistirenDokuyu yerinde tutmak için kullanılır
Düz diseksiyon makasıEMS72940
25 G iğnelerBD 300600Dokuyu yerinde tutmak için kullanılır
50 ml konik tüplerFalcon352070
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu,% 10SigmaHT501128-4L
Fosfat tamponlu salinSigmaP3813-10PAK
EtanolSigma32221-2.5L
ParafinSigma327204-1KG
XyleneFisher ScientificX/0250/17
Otomatik doku işlemcisiSakura6032
MikrotomLeicaRM2245
Kayar rafSigmaZ710989
Coplin kavanozuSigmaS5891
Arıtılmış su
Hematoksilen çözeltisi, Solungaç No. 3SigmaGHS332-1L
Eosin Y çözümüSigmaHT110116-500ML
Çeker ocak
Ksilen bazlı montaj ortamıVWR361254D
Slayt tarayıcıHamamatsuNanoZoomer
Slayt tarayıcı yazılımıHamamatsuNDP görüntüleyici
Sodyum sitrat tribazik dihidratSigma3232010 mM çözelti yapın ve pH'ı 6'ya ayarlayın
Düdüklü tencereAntijen alımı için kullanılır
Isıtma plakasıAntijen alımı için kullanılır
Hidrofobik bariyer kalemiVectorH-4000
Hidrojen peroksitFisher ScientificH/1800/15
Tris tamponlu salinSigmaT6664-10PAK
Fare kitindefare VektörBMK-2202Arka planı önemli ölçüde azaltır
Fare anti-insan düz kas aktiniDAKOM0851ile çapraz reaksiyona girer
DAKOX0943
Nemlendirilmiş odaSigmaH6644
3,3'-Diaminobenzidin çözeltisiSigmaD4293-5SET
Hidroklorik asitFisher ScientificH / 1050 / PB17
Fare IgG2a izotip kontrolü

Kaynaklar

  1. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  2. Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
  3. Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
  4. Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
  5. Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
  6. Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
  7. Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
  8. Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
  9. Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
  10. Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
  11. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  12. Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
  13. Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
  14. Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
  15. Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
  16. Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
  17. Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
  18. Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
  19. Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Spiral Arter AnaliziHematoksilen Eozin BoyamaD z Kas Aktin Tespitimm nohistokimyasal Do rulamaUterin Doku FiksasyonuParafin G mmeDamar Boyutu l mAk Sitometrisi Entegrasyonu
Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.