Bu el yazması, bir saha taşınabilir elektrikli hücre-substrat empedans sensöründe kullanılmak üzere Gökkuşağı alabalığı solungaç epitel hücreleri ile akışkan biyoçiplerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Sensörle hızlı bir içme suyu toksisitesi testi yapmak için protokol de açıklanmıştır.
Yöntem makalesi
Hazırlık ve Test zehirlilik için hızlı değerlendirme İçme Suyu Örnekleri için RTgill-W1 Hücreleri ile akışkan bioçipler Empedans tabanlı
Bu makalede
Özet
Özet
Bu el yazması, sahada taşınabilir su toksisitesi sensöründe kullanılmak üzere Gökkuşağı alabalığı solungaç epitel (RTgill-W1) hücreleriyle akışkan biyoçiplerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Biyoçiplerin içine yerleştirilmiş algılama elektrotları üzerinde bir RTgill-W1 hücresi tek tabakası oluşur. Biyoçipler daha sonra içme suyunun hızlı toksisite testi için tasarlanmış bir saha taşınabilir elektrikli hücre-substrat empedans algılama (ECIS) cihazında test etmek için kullanılır. El yazması ayrıca hazırlanan biyoçipler kullanılarak bir toksisite testinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Bir kontrol suyu numunesi ve test suyu numunesi, önceden ölçülmüş toz ortam ile karıştırılır ve biyoçipin ayrı kanallarına enjekte edilir. Biyoçip kanallarının her birindeki algılama elektrotlarından gelen empedans okumaları, otomatik bir istatistiksel yazılım programı tarafından ölçülür ve karşılaştırılır. ECIS cihazındaki ekran, numune enjeksiyonundan sonraki bir saat içinde "Kontaminasyon Tespit Edildi" veya "Kontaminasyon Tespit Edilmedi" mesajını gösterecektir. Avantajları, kullanım kolaylığı ve insan sağlığı endişeleriyle ilgili konsantrasyonlarda geniş bir inorganik ve organik kimyasal yelpazesine hızlı yanıt vermenin yanı sıra, depolanan biyoçiplerin test için hazır durumda uzun vadeli stabilitesidir. Sınırlamalar, biyoçiplerin soğuk depolanması gerekliliği ve kolinesteraz inhibe edici pestisitlere karşı sınırlı hassasiyettir. Bu toksisite dedektörünün uygulamaları, Ordu Önleyici Tıp personeli tarafından içme suyu kaynaklarının hızlı bir şekilde sahada taşınabilir olarak test edilmesi veya belediye su arıtma tesislerinde kullanım içindir.
Giriş
Genel amaç ECIS biyosensör hücre ekim, depolanması ve akışkan bioçipler test edilmesi için bir yöntem geliştirmektir. Bu biyosensör geliştirilmesi için hedef askerler tarafından kullanılan içme suyu kaynaklarının olası kontaminasyonu tespit olabilecek bir alan taşınabilir aygıt için ABD Ordusu özelliklerini karşılamak üzere idi. toksisite sensörü gereksinimleri cihaz alan taşınabilir olması o, insan sağlığı ile ilgili konsantrasyonlarda (bir saat içinde) hızla toksik endüstriyel bileşiklerin geniş bir yelpazede algılayabilir ve biyolojik bileşenlerin bir raf ömrüne sahip olacağını vardı en az dokuz ay. bozulabilen parçalar kabul edilebilir soğutma, ancak, dondurma değil.
Tarihsel olarak, (örneğin, antikorlar, enzimler ya da nükleik asitler gibi) bunların biyolojik bir bileşeniyle alanı içme suyu testi teknolojileri analit özgü 1-3 olmuştur. biyosensörler bu tür dezavantajı onl olmasıdırY aynı anda kimyasal bir tür algılar. birden fazla kimyasal mevcut olduğu şüphesi varsa çoklu sensör ihtiyaç vardır. Belirli bir sensör testi repertuarında değilse, suda kimyasal kirleticiler kolayca algılanmayan gidebiliriz.
Geniş tabanlı toksisite sensörler, diğer taraftan, bu teknoloji boşluğu doldurmak için potansiyele sahiptir. Bunlar genellikle onlara 4-8 bir hücresel bileşeni var. Geniş tabanlı toksisite biyosensörler avantajları, zaman 5,9,10 nispeten kısa bir süre içinde karışımlar ve bilinmeyenler de dahil olmak üzere kimyasal kirleticilerin, geniş bir yelpazeye varlığını tespit edebilen vardır.
Aynı zamanda elektrik hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) olarak da bilinir olası toksisite sensörü, hücre tek katmanlarının elektrik empedansının ölçümü ile konsepti ilk olarak Giaever ve Keese 11 tarafından tarif edilmiştir. Son yirmi yılda hücre viab hassas bir göstergesi olduğu gösterilmiştirility ve sitotoksisite. Temel olarak, bioçipler elektrotlar yapıştırılır hücre tekli-tabakası, yüksek frekanslı ve düşük voltaj ve akımı alternatif akım sinyaline maruz kalmaktadır. hücreler sık tek tabaka elektron akışını engeller. Hücre mono tabakasının bütünlüğünün (örneğin, bir toksik kimyasal ilave edilir olduğu gibi) bozulduğunda ECIS sensörü elektrik empedans değişikliği kaydeder 11-14. Şekil 1 Biochip hücre tek tabaka ile ilgili olarak ECIS ilkesini göstermektedir .
Şekil 1:.. Basitleştirilmiş ECIS okuyucu elektrik şematik bir biochip üzerindeki bir hücre tek tabaka ECIS İllüstrasyon prensibi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Başlangıçta, memeli hücre çizgileri akışkan bioçipler tohumlandı ve burada, 12 tarif edilen ECIS sensor teknolojisi kullanılmıştır. Onlar sık ortam değişiklikleri gerekli sınırlı bir raf ömrüne sahip ve yapay CO2 çevre ve 37 ° C inkübasyon sıcaklığı gereklidir, çünkü bu hücreler, bununla birlikte, saha kullanım için pratik değildir edildi. Bu gökkuşağı alabalığı solungaç epitel hücreleri (RTgill B-1 hücreleri) elde edilen ticari olarak temin edilebilen hücre hattı, ortam CO2 oda sıcaklığında test keşfedilmiştir, bioçipler bir konfluent tek tabaka oluşturulmuştur, soğutulmuş sıcaklıklarda muhafaza edilebilir ve İnsan sağlığı 12 ilgili konsantrasyonlarda kimyasal bir geniş spektrumlu bir hızlı tepki (1 saat ya da daha az) vardı. Toksikoloji RTgill-W1 hücrelerinin Uygulamaları, hem de temel araştırmalar olduğu gibi, Lee ve ark tarafından gözden geçirilir. 15
Tohumlama, depolama ve ihtiva eden akışkan bioçipler test yöntemleriBir ECIS biyosensöründeki akışkan biochipler üzerinde RTgill-W1 hücrelerinin mono tabakaları burada açıklanmaktadır. akışkan biochip bir buzdolabında durumda en fazla 9 ay süreyle saklanabilir ve ayrı ayrı sevk edilir, içme suyu SUPPLIES.THE eşlik ECIS okuyucular, ya da test ünitelerinin test edilmesi için, soğuk bir saklama kabı olarak sevk edilebilir. biochip onlara iki bileşeni vardır; iki ayrı sıvı kanalları ve empedans algılama kanal başına dört elektrot pedleri içeren bir alt elektronik tabaka ile bir üst polikarbonat tabaka. ped başına 10 çalışma elektrotlar vardır; Her bir elektrod çapı 250 mm. monte biochip ECIS test ünitesi takıldığında empedans okumaları elde etmek için altın elektrot bağlantıları var. Iki kapalı akışkan U-şekilli kanalların her biri. RTgill-W1 hücre süspansiyonu 2 ml sahip 2, tek bir algılama elektrodu bir konfluent hücreler büyütme ile ECIS okuyucu bir akışkan Bioçip göstermektedir olacaktır.
Şekil 2:.. ECIS Reader akışkan Biochip Büyütülmüş alan tek algılama elektrot üzerinde RTgill-W1 hücrelerinin konfluent tek tabaka gösteren bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protokol
Test malzemelerinin hazırlanması 1.
Not: test biyoçipler hazırlamak için, RTgill-W1 çeşitli hücre Birleşik kaplardan hazır olması gerekir. 16 biochip numaralı seribaşı olması için gerekli şişeler sayısının iyi bir tahmini bir konfluent T175 şişesi olduğunu.
- aseptik teknik kullanılarak bir sınıf II biyolojik güvenlik kabininde (biohood) aşağıdaki adımları uygulayın. biohood ve kaputun yerleştirilen herhangi bir malzeme dezenfekte edilmesi için% 70 etanol kullanımı.
- fibronektin, 1 mg tüp çözdürme ve 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda steril L-15 ortamı, 100 ml seyreltilmesiyle akışkan bioçipler için fibronektin substratı hazırlayın. -20 ° C'de steril 50 ml konik propilen tüplerinde 40 ml alikotları dondurun. bioçipler ekim öncesinde oda sıcaklığı birkaç saat çözülme. çözülmüş bir kez dondurursam yok.
- Fetal sığır serumu 50 mi, 200 5 mi mM L-alanil-L-glutamin destek eklenerek hücre kültürü ortamı hazırlamakmana tamamlayıcı ve L-15 ortamı 500 ml penisilin / streptomisin solüsyonu (5 mi 10.000 birim penisilin / ml, 10,000 ug streptomisin / ml) hazır. Bu% 9 serum içeren hücre kültür ortamının 560 ml verecektir. Buzdolabında.
Not: Bu kültür şişeleri ve bioçipler için kullanılan tam hücre kültür ortamı olacaktır.
- Pudralı Medya Flakon
- vaktinden otomatik toz dağıtıcı kullanılarak L-15ex tozu ± 0.5% 60 mg içeren 0.1 dram ek-kapaklı küçük şişelerden hazırlayın. recloseable metalize poli torbalarda (50 miktarlarda) toz dağıtılmıştır tarih ve buzdolabına şişeleri ile şişeleri etiketlemek; her biri, üç, 1 g silis jeli kuruma paketleri.
Not: L-15ex toz medya şişeler yapılmış ve test öncesinde en fazla 9 ay süreyle saklanabilir.
- vaktinden otomatik toz dağıtıcı kullanılarak L-15ex tozu ± 0.5% 60 mg içeren 0.1 dram ek-kapaklı küçük şişelerden hazırlayın. recloseable metalize poli torbalarda (50 miktarlarda) toz dağıtılmıştır tarih ve buzdolabına şişeleri ile şişeleri etiketlemek; her biri, üç, 1 g silis jeli kuruma paketleri.
- iyonu giderilmiş (Di) su ile çamaşır suyu seyrelterek 100 mi% 20 ağartıcı içeren bir çözelti yapmak. çamaşır suyu çözeltisi 5 ml her bi için gerekli olacağını Tahminochip.
- (Her Biochip için 2 bölüm numaralı seribaşı olan) Otoklavlanabilir biyouyumlu boru 27 mm bölümlerini keserek biyoçip boru derlemeleri yapmak ve polikarbonat kayma luer parçaları ile tüpün her iki ucu uygun. 134 ° C'de 8 dakika süreyle bir otoklav çantası ve otoklavda boru takımlarını yerleştirin. aynı ayarlarla ayrı bir çanta içinde de otoklav biyoçip bujileri (Biochip başına 2).
- ° at121 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır saf su.
Not: Bu su tohumlama sonra biyoçipler yıkamak için kullanılır. 10 ml her biochip için gerekli olacağını tahmin ediyoruz.
Not: Her biyoçip kanalı gerçek hacmi 2 mi, ancak steril su 5 mi ağartma çözeltisinin ayrılmasından sonra, her bir kanal yoluyla durulanır. - biyouyumlu boru 27 mm bölümleri kesme ve boru her iki ucunda erkek kayma luer parçaları takarak şırınga enjeksiyon tüp meclisleri olun. 134 & 8 dakika süreyle bir kağıt ısı mühür sterilizasyon kese ve otoklavda boru takımlarını yerleştirin# 176; C.
2. Akışkan Biochip Tohum Prosedürü
Not: biochip veya medya aseptik teknik kullanılarak bir sınıf II biyolojik güvenlik kabininde işlenen tüm prosedürleri uygulayın.
- önce planlanan tohumlama yirmi dört saat, üretici biohood ambalaj ve sterilize plastik alet durumlarda yerden bioçipler kaldırın.
- aşağıdaki gibi% 20 çamaşır suyu ile sterilize biyoçipler
Not: Tarihsel olarak, bu ağartıcı prosedürü üretici tarafından yapılan bioçipler plazma sterilizasyon etkili olmadığını durumunda, uzun süreli depolama sırasında bioçipler mantar büyümesini önlemiştir.- 20 ml'lik bir şırınga, enjeksiyon boru steril bir şırınga düzeneği bağlanır ve biohood çalışan kullanılarak Biochip her kanal içine% 20 çamaşır suyu solüsyonu 2 ml enjekte edilir. biochip çamaşır suyu çözeltisi ile 1 saat bekletin.
- Bir saat, vakum asp sonravakum emme boru bağlı bir steril erkek kayma Luer derleme kullanarak her iki kanaldan çamaşır suyu kızgın. bioçipler durulama sırasında bir drenaj olarak biyoçip boru montajları birini kullanın.
- steril şırınga enjeksiyonu düzeneğine bağlı bir steril 20 ml şırınga kullanarak, fazla su biohood bir kap içine akmasına izin vermek için, steril su, 5 ml çip her kanalı yıkayın. O zaman sadece çamaşır suyu için açıklanan ve plastik alet durumlarda geri bioçipler yerleştirin ve ertesi gün hücreleri ile seribaşı kadar biohood bırakın kapalı su vakum aspirasyon.
- , Biyoçipler ekim Biochip her kanalı içine 10 ug / ml fibronektin 2 ml solüsyon enjekte etmek için Altmış dakika önce. 60 dakika boyunca biohood biyoçipler bırakın ve (aşama 2.2.3 tarif edildiği gibi) daha sonra hücreler ile Bioçip ekim önce fibronektin aspire vakum. bakın (steril biochip boru meclislerinin iki bölümden yerleştirinbioçipler limanlarında bölüm 1.4).
- Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) ürün tanımı tabaka 16 ana hatları çizilen prosedürler kullanılarak her 16 bioçipler için bir birleşik RTgill-W1 T175 şişesi tripsinize.
- hücrelerinin birbirine karışan balonuna (ler) den medyaya kapalı aspire.
- PBS 15 ml hücre tabakası durulayın ve sonra aspire.
- Her bir T175 şişesi içinde hücre tabakası tripsin / EDTA 6 ml ilave edilir ve hücreler, 5 dakika boyunca trypsinize sağlar.
- tripsinizasyon durdurmak için her bir şişeye tam l-15 hücre kültür ortamı 15 ml ekleyin.
- steril tek bir kap içinde hücre süspansiyonları birleştirin.
Not: Konteyner boyut bioçipler sayısı numaralı seribaşı olan bağımlı 150-500 ml arasında değişebilir. Hücre süspansiyonunun 5 mi Biochip başına gerekli olacağını tahmin.
- hücre süspansiyonu ± 1 ml alın ve sayım için mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin. 10X amaç, ticari bir aydınlık mikroskop kullanarakziyaretinde bir hemositometre bir hücre 10 ul bir kısım sayısı ve 2.5 x 10 5 hücre / ml'lik bir hücre süspansiyonu elde etmek için gerekli olan tam bir L-15 hücre kültür ortamı hacmi hesaplamak.
Not: hücre süspansiyonu kullanılarak kültürü devam etmek için matara tohum ise, bunu yapmak için noktası olacaktır. tam L-15 hücre kültür ortamı kullanılarak hücre süspansiyonu konsantrasyonunu ayarlayın. - Biochip her kanalın dış bağlantı noktasına hücre süspansiyonu, 2.5 ml enjekte steril şırınga enjeksiyonu boru montaj (bölüm 1.6) için syringeattached steril 20 ml kullanılarak (yani, bağlı tüp olmayan bağlantı noktaları), biohood bir atık kabına borudan dışarı akmasına ilave hücre süspansiyonu bir tanır.
Not: Bu tüm kanal ve bağlı boru hücre süspansiyonu dolu olacak sağlayacaktır.- Luer fitti hortum serbest ucunu takarak her biyoçip kanalı için kapalı bir döngü oluşturunHer kanal için dış liman içine ng.
- % 70 etanol ile ıslatılmış kağıt havlu ile kapalı döngüler kapalı herhangi bir aşırı medya silin ve bir 20 ° C inkübatör geri plastik kutu biochipler yerleştirin. Her Biochip benzersiz bir tanımlayıcı numarasını ver.
- Gün 4 ve Gün 7'de 20 ° C inkübatör biyoçipler çıkarın ve ısı-dengeli tam l-15 hücre kültür ortamı ile bioçipler tüm ortam doldurmak. Kullanım dışında adım 2.6 sadece L-15 hücre kültür ortamı yerine (hiçbir hücre süspansiyonu) aynı prosedürü takip edin. gün 4 beslenme sonrası 20 ° C inkübatör biochipler geri yerleştirin.
- gün 7 beslenmesi sonra kaldırmak ve cips Hortumları atmak ve bioçipler otoklava boşaltma vidasını takın.
- Test için kullanılan kadar 6 ° C inkübatör bir kutu biochipler yerleştirin.
cips kadar 9 ay boyunca buzdolabında sıcaklıklarda saklanabilir ve hala test i için geçerli olan: Notn ECIS okuyucular.
Bioçipler 3. ECIS Testi
- kullanıyorsanız Test kimyasalları hazırlayın. (Bkz Brennan ve ark., Test kimyasal hazırlanması 2012 7).
- taşıma çantası gelen ECIS okuyucu ve test malzemeleri çıkarın. 6 ° C inkübatör hazırlanmış bir Bioçip kaldırın. Bir kağıt havlu üzerine Bioçip yerleştirin. ECIS okuyucu açın.
- 10 ml şırınga kullanarak, etiketli 0.5 ons şeffaf plastik kontrol kavanozun içine kontrol su 10 ml ve etiketli 0.5 ons şeffaf plastik testi kavanozun içine test örneği 10 ml dağıtmak.
Not: 1) Doğru bir ölçüm için kabarcıklarını çıkarmak için emin olun. 2) şırıngalar ve kavanozlar renk kodludur; test için kontrol ve kırmızı mavi. - folyo çanta iki toz medya şişeleri çıkarın. Açık toz ortam flakon on (gerekirse kullanımı amaçlı bir araç) içine, tüm ampulün bırakarak, kontrol, su ile kavanoz içine bir şişenin bütün muhtevası, dökünçözüm de. Test kavanoz ile bu işlemi tekrarlayın. Kapak toz eritilir sağlamak için kavanoz sallayın.
- Her iki kontrol (mavi şırınga) ya da test (kırmızı şırınga) ilgili ampuller gelen çözeltiler 9 ml sahip renkli 10 mi şırınga her doldurun. şırınga hava kabarcıklarını çıkarın.
- Biochip limanlarından tapaları çıkartın ve drenaj takın.
- ECIS okuyucu çıkarılabilir plastik tepsi içine Bioçip yerleştirin ve kapağını kapatın.
- Dış biyoçip portlarına dolu şırınga takın ve şırınga pistonu takın.
- Ana ekrandan, "NEXT" seçeneğini ön testi başlatmak için.
Not: Okuyucu yazılım empedanslarından kontrol edecektir. Empedansları kullanıcı (genellikle arasında 1000 ve 3000 ohm) ekranı kaydeder tarafından belirlenen aralıkta ise Şekil 3'te gösterilen ve "Next" seçmesini talimat ve yazılım) 3.10 adıma geçin gibi "Kartuş Geçti". Empedanslar dahilinde değilseçünkü kusurlu Biochip ya da (genellikle nedeniyle elektrot hiza) okuyucuya Biochip hatalı bağlantı seti aralığı, ardından ekran kaydedecektir "Kartuş Başarısız" ve kullanıcı ya "Abort" seçeneğine sahip ya da olacak testi "doğrulama".- ) 3,9 adıma geri dönmek için "Kes" i seçin. "Doğrulama" seçeneğini bir "Kartuş Geçti" mesajı alan ve "İleri" seçtikten sonra) 3.10 adıma geçin.
Not: Bioçip çıkarmak ve görsel kusurları ya da bir mesaj, yeni bir Biochip devam etmeden önce alınan "Kartuş başarısız" eğer sızıntı olup olmadığını kontrol edin en iyisidir.
- ) 3,9 adıma geri dönmek için "Kes" i seçin. "Doğrulama" seçeneğini bir "Kartuş Geçti" mesajı alan ve "İleri" seçtikten sonra) 3.10 adıma geçin.
Şekil 3:. Kabul edilebilir Empedans Okumalar bir Biochip ve ECIS Okuyucu Screenshot ekran görüntüsü 4 co her ohm ilk empedans okumaları gösterirntrol elektrotlar (CE) ve akışkan Biochip içinde 4 test örneği elektrotlar (SE). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- okuyucu tarafından istendiğinde, yumuşak bir klavye kullanarak örnek bilgileri girin ve bittiğinde sonra "Kabul" seçeneğini seçin.
Not: ECIS okuyucu yazılım otomatik olarak tarih, saat ve kullanıcı tarafından girilen diğer bilgilerin her veri kümesi damga; biochip numarası, kimyasal ve konsantrasyon türü olarak. empedans iki veri dk eklenen Biochip tahsil edilecektir ve bir ekran zamanlayıcı geri sayım süreyi. - kırmızı bir kutu içinde yanıp ekrandaki talimatları tarafından istendiğinde iki dakika sonra, "NEXT" çarptı. "Şimdi örnekleri enjekte" için yanıp sönen yeşil kutu tarafından istendiğinde, biyoçip chann içine aynı anda bağlı şırınga gelen denetim ve test ortamı enjekteels. Bittiğinde bioçipler üzerinde yerinde şırınga bırakın.
Not: Empedans değerleri 60 dakika kez dakikası tahsil edilecektir. ECIS okuyucu yazılım tedavi kanal testin başlamasından sonra 10 ile 60 dakika arasında herhangi bir noktada kontrol kanalı istatistiksel olarak farklı olduğunu belirlerse, ardından ekrandaki görüntü örneği "Kirli" olduğunu gösterir. Tedavi kontrol kanalı farklı değilse, o zaman ekranı test çalışmasının sonunda "Tespit Kontaminasyon" gösterecektir. - kirlenmiş veya değil olarak kayıt test sonuçları her bir örnek için kirlenmiş.
- Test çalışmasının sonunda, kaldırmak ve Bioçip atın. Durulayın ve testler sırasında Bioçip ev sahipliği şırıngalar, deney şişeleri ve çıkarılabilir plastik tepsi hava kurutun.
Not: ECIS okuyucu operasyonel yazılım için yerleşik depolama 4 GB, kontrol modelleri ve test dosyaları bir test çalışmasından kaynaklanan. Bu, birkaç th sağlarousand deney dosyaları okuyucuya saklanır. Dosyalar USB atlama sürücü ile alınır ve istenirse araştırma amaçlı daha fazla analiz için bir bilgisayara aktarılabilir.
Sonuçlar
Bu yazıda anlatılan ECIS teknolojisi, ABD Çevre Koruma Ajansı (USEPA) Teknoloji Test ve Değerlendirme Programı (TTEP) -sponsored test uygulandı. On üç kimyasal içme suyu olası kirletici olabilir toksik endüstriyel bileşiklerin geniş bir yelpazede temsilcileri olarak performansı test edilmiştir. Test sırasında, 13 9 insan sağlığı ile ilgili olan konsantrasyonlarda bir saat içinde ECIS tarafından tespit edildi 8. Tablo 1, bu kirletici test sonuçlarını göstermektedir. Şekil 4 bir "Kirli" sonucu üzerinde nasıl görüneceği için temsili niteliktedir ECIS okuyucu ekranı. Çoğunlukla, hücresel empedanslar kontrollere kıyasla kirlenmiş numuneler için azalmıştır. Zaman zaman, bazı bileşikler empedansında bir artışa neden olabilir.
Ayrıca Tablo 1'de özetlenmiştir Temiz su testidir. Kırk temiz su numuneleri çalıştırmak ve herhangi bir kontaminasyon örneklerinin hiçbirinde tespit edildi "Hayır kontaminasyon Algılanan" temsili bir ekran çekim için (Şekil 5).
Şekil 4: "Kirli" Su Numune ECIS Okuyucu Ekran kirlenmiş bir su örneğinden normalize empedans grafik ve sonuçların bir örneği.. Mavi çizgiler kontrol elektrotların her normalize empedans temsil eder; Kırmızı çizgiler deney numunesi elektrotların her normalleştirilmiş empedansları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: "Hiçbir kontaminasyon algılandı" Su Numune ECIS Okuyucu Ekran kirlenmiş olmayan bir su örneğinden normalize empedans grafik ve sonuçların bir örneği.. Mavi çizgiler kontrol elektrotların her normalize empedans temsil eder; Kırmızı çizgiler deney numunesi elektrotların her normalleştirilmiş empedansları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Kategori | kirletici madde | Konsantrasyon test edilmiştir (mg / L) 1 | Algılandı ≤1 saat n = 4/4 cips | |||
| Pestisitler | aldicarb | 0.17 | hayır | |||
| arsen ic (sodyum arsenit) | 4,5 | Evet | ||||
| Azite (sodyum azit) | 46.7 | Evet | ||||
| fenamifos | 0.56 | hayır | ||||
| Methamidophos | 1.4 | hayır | ||||
| metil parathion | 33.6 | Evet | ||||
| Parakuat (diklorür) | 4.6 | hayır | ||||
| Pentachlorophenate (sodyum) | 71.9 | Evet | ||||
| Endüstriyel Kimyasallar | Amonyak | 924 | Evet | |||
| Bakır (bakır-II sülfat) | 103 | Evet | ||||
| Siyanür (sodyum) | Evet | |||||
| Merkür (klorür) | 24.7 | Evet | ||||
| tolüen | 444 | Evet | ||||
| Temiz Su 2 | hiçbiri | NA | hayır | |||
| Test 1 konsantrasyonları ve ark Widder tarafından el yazması aynıdır. (2014). | ||||||
| 2 40 temiz su numuneleri hiçbir kirlenme ile çalışıldı. | ||||||
Tablo 1: ECIS tarafından Algılanan Su Örnekleri Bulaşanlar.
Tartışma
ECIS teknolojisi laboratuvar ortamında iyi bir performans ve insan sağlığı ile ilgili olan konsantrasyonlarda potansiyel su kirleticileri tespit etmeyi başardı. Teknolojinin taşınabilirlik ve paketleme alanı kullanımına da elverişli hale getirir.
1) kültür, tohumlama sırasında aseptik koşullarda koruyun ve bioçipler beslenmesi, 2) RTgill-W1 hücreleri beri test için hazır olana kadar buzdolabında koşullarda seribaşı bioçipler tutun aşağıdaki gibidir: teknolojinin başarısı için protokol kritik adımlar çok uzun da 25 ° C nin üzerindeki sıcaklıklara maruz sonra yaşayamaz, 3) doğru bir toz halinde ortam şişeler L-15ex ağırlığında ve doğru bir değişiklik neden olabilir yanlış pozitif üretilmesi önlemek için, su numuneleri ölçmek medya ziyade örnek toksisite osmolalitesi, 4) testleri çalıştırmak için ECIS ekranda kullanıcı yönergeleri izleyin. okuyucu yazılım bi eğer kullanıcıyı uyarırbiyoçip ilk okuyucuya takıldığında ochip (ilk empedans okumaları göre) test için kabul edilemez. empedans düzeyleri test için kabul edilemez ise, yazılım, yeni bir biyoçip kullanılıncaya kadar kullanıcı testi ile devam etmek izin vermez. kabul edilemez empedans okumaları için nedenleri yüzünden ECIS okuyucu pimleri veya Biochip yapıştırma kenarlarından biri boyunca sıvı kaçağı ile biyoçip elektrotlar hafif bir hiza genellikle bulunmaktadır.
ECIS sensör sadece içme suyu ile test ve yüzey suyu ile olmuştur çünkü bu teknoloji için bazı sınırlar vardır. Biochip Hangi RTgill-W1 hücreleri (süre sıcaklığına bağlı olarak saatlerden günlere kadar olabilir, uzun süreli dönemler için daha 25 ° C'nin üzerinde dondurma ya sıcaklıklara uyum olabilir. Biochipler bir sıcaklık aralığı içinde iyi işlev soğutulmuş arasında oda sıcaklığı 7. Onlar hemen r olduktan sonra, ancak, hemen kullanıma hazırsoğuk depodan emoved. Taşınabilir soğuk saklama kapları, şu anda sıcaklığa duyarlı malzemeleri için alanında Ordu personeli tarafından kullanılmaktadır. Bu aynı kaplar numaralı seribaşı biyoçip taşınması için de kullanılabilir.
Bu teknolojinin bir başka sınırlama, bir geniş bantlı toksisite sensörü olsa bile hiç değilse, bu gibi bir böcek ilacı gibi kolinesteraz önleyici bileşikler ile, iyi yanıt olmasıdır. Bu özellik, boşluğu doldurmak için ECIS sensörü toksisite testinin daha geniş bir kullanıcıya sağlamak için su numuneleri test edilirken bir ticari olarak temin edilebilir, hızlı pestisit deney tahlili ile bağlantılı olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kit 30 dakika içinde organofosfat ve karbamat pestisitler algılamak için tasarlanmış hızlı bir enzimatik bir testtir.
Şu anda algılamak için askeri koruyucu hekimlik personel tarafından kullanılan alan su test sistemi, arsen - ECIS sensörü wqas-PM (Önleyici Tıp Su Kalitesi Analiz Sistemi) tamamlarBir içme suyu numunesinde ic, kurşun ya da siyanür. ECIS sensörü kirletici ne tespit olmaz, ancak bazı metaller veya organik bileşikler, bu ise, bu su, insan tüketimi için uygun olmayabilir belirten gösterir. ECIS test sonuçları bir saat içinde mevcuttur. Pozitif test sonucu varsa su numuneleri daha sonra kirletici tanımlanması için daha fazla analiz için gönderilebilir.
Yukarıda tarif edildiği gibi, ECIS okuyucu kirletici saptanması geniş spektrumlu bir kapak için ayrı bir enzimatik ACE kiti içeren bir sistemin bir parçası olarak tasarlanmıştır. Bu okuyucuların her ikisi de askerler tarafından saha kullanımı için alan taşıma için sağlam bir durumda paketlenmiş ediliyor.
Açıklamalar
Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve tavsiyeler yazarlara aittir ve ABD Ordusu tarafından mutlaka onaylanmamıştır. Bu raporda ticari kuruluşlara veya ticari isimlere yapılan atıflar, bu kuruluşların ürün veya hizmetlerinin resmi bir Ordu Bakanlığı tarafından onaylandığı veya onaylandığı anlamına gelmez. Her ikisi de ABD Ordusu Çevre Sağlığı Araştırma Merkezi'nden yazarlar Linda M. Brennan ve Mark W. Widder, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ediyorlar. Michael Mayo, Michael McAleer ve Alex Greis, bu Makalede kullanılan tek kullanımlık biyoçipleri ve aletleri üreten Nanohmics'in çalışanlarıdır.10251980
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı ve Küçük İşletme İnovasyon Araştırması ve Küçük İşletme Teknoloji Transferi programı tarafından desteklenmiştir; Sözleşme No. W81XWH-13-C-0093. Fraser Üniversitesi'nden Dr. Lucy Lee'ye RTgill-W1 hücre kültürü danışmanımız olduğu için teşekkür etmek ve Waterloo Üniversitesi'nden Dr. Niels Bols'a RTgill-W1cell serisinin geliştirilmesi için teşekkür etmek istiyoruz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fetal sığır serumu | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Mağaza @ -20 ° C. Kullanmadan önce @ oda sıcaklığında çözdürün. Tam L-15 hücre kültürü ortamı için bileşen (% 10). |
| Fibronektin, sığır plazması | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | @ -20 °C saklayın. Kullanmadan önce @ oda sıcaklığında çözdürün. 10 & # 956 konsantrasyon için L-15 ortamı ile karıştırın; g/ml ve donma @ -20 &derece; Alikotlarda C. Biyoçipler için substrat olarak kullanın. |
| L-glutamin içermeyen L-15 ortamı | www.lonzabioscience.com | 12-700F | Hücre kültürü ve biyoçip besleme için bazal ortam. 6 >C'de saklayın. |
| L-15ex fenol kırmızısı US | Biological ile toz haline getirilmiş ortam; www.usbio.net | L1501 | Besiyeri, 0.1 dram şişelerde 60 mg alikotlarda tartılır ve 6 ° C'de saklanır; Kurutucu ambalajlı folyo torbalarda C. Dokuz ay raf ömrü. Biyoçiplerde test etmek için 10 ml su numunesi ile karıştırılır. |
| PBS, Ca2+ veya Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | olmadan Oda sıcaklığında saklayın. Hücre kültürü şişelerini tripsile yaparken ortamı durulamak için kullanılır. |
| Tripsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | @ -20 ° C'yi saklayın. Oda sıcaklığında çözdürün ve hücre kültürü şişelerini tripsinize etmek için kullanın. |
| T175 kültür şişeleri | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-30 | RTgill-W1 hücrelerini kültürlemek için kullanılır. |
| Çamaşır | suyu kloroks | ECIS talaşlarını temizlemek için millique veya damıtılmış su ile% 20'ye kadar seyreltilir. Herhangi bir ev tipi çamaşır suyu kabul edilebilir. | |
| %70 etil alkol | Biyodavut yüzeylerini ve biyokaburga yerleştirilen her türlü malzemeyi dezenfekte etmek için kullanılır. | ||
| Gökkuşağı alabalığı solungaç hücreleri (RTgill-W1) | Amerikan Tipi Doku Kültürü Koleksiyonu www.atcc.org | CRL-2523 | Kültürlenmiş ve biyosensör için kullanılan hücreler (biyoçiplerin tohumlanması). |
| GlutaMAX-1 Takviye Edici Gıda, 200 mM Takviye Edici Gıda | www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Oda sıcaklığında muhafaza ediniz. Tam L-15 hücre kültürü ortamı için bileşen (% 1). |
| Penn/Strep Stok 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Mağaza @ -20 derece; C. Kullanmadan önce @ oda sıcaklığında çözdürün. Tam L-15 hücre kültürü ortamı için bileşen (% 1). |
| Pharmed BPT boru | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | 27 mm'lik kesitler halinde kesilmiş ve otoklavlanmıştır. Biyoçipleri hücrelerle tohumlamak için ve ortam değişiklikleri arasında kapalı bir döngü olarak kullanılır. |
| Pharmed boru montajları için polikarbonat luer bağlantı parçaları | Value Plastics | MTLS210-9 | Bichips'e yerleştirmek için kesilmiş Pharmed borunun her iki ucuna sabitlenmiştir. |
| 20 ml şırınga, kayar uçlu | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | ECIS çiplerinin tohumlanması ve cipslerin beslenmesi için hücre süspansiyonu enjeksiyonu için kullanılır. |
| 0.1 dram geçmeli kapaklı polipropilen mikrovials | Şişeler Kavanozlar ve Tüpler, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | 60 mg L-15ex toz ortam alikotlarını saklamak için kullanılır. |
| 60 mil Lexan akışkan ECIS biyoçipleri | Nanohmics, Inc. | Nanohmics, Inc. tarafından özel olarak üretilen RTgill-W1 hücreleri biyoçiplere enjekte edilecek ve tohumlanmış çipler test için ECIS okuyucusuna yerleştirilecektir. | |
| Otoklavlanabilir Plastik Alet Kutusu 17 1/2 "x 7 3/4" x 2 3/8 " | Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Aşağıdakileri saklamak için kullanılır; otoklavlanmış tıkaçlar, temizlenmiş biyoçipler, tohumlanmış biyoçipler. |
| Kağıt ısıyla yapıştırma sterilizasyon torbaları, 7 & frac12; ” x 13 inç | Kardinal Sağlık www.cardinalhealth.com | 90713 | Boru ve bağlantı parçalarının ve tapaların otoklavlanması için kullanılır. |
| Quantos otomatik toz dağıtıcı | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | 60 mg alikot toz L-15ex'in 0.1 dram şişelerine otomatik dağıtımı. |
| ECIS okuyucu | Nanohmics, Inc. | Nanohmics, Inc. tarafından özel olarak üretilmiştir. Tohumlanmış biyoçip, su toksisitesi testi yapmak için okuyucuya yerleştirilir. | |
| 3 x 5 metalize 2,5 mil polipropilen tekrar kapatılabilir torbalar | Uline www.uline.com | S-16893 | Hem tohumlanmış biyoçipler hem de toz haline getirilmiş L-15ex ortam şişeleri için paketleme ve depolama. |
| Leatherman fışkırtma ps4 | Amazon | Toz haline getirilmiş ortam şişelerini açmak için kullanılır. | |
| 1 g silika jel kurutucu paketleri | Uline www.uline.com | S-3902 | Tozun nem almasını önlemek için L-15ex toz ortam şişeleri ile polipropilen torbalara koyun. |
| Steril 250 veya 500 ml Nalgene şişeleri | Fisher Scientific www.fishersci.com | 09-740-25C veya E | ECIS çiplerini biyodavutta tohumlamak için hücre süspansiyonlarını tutun. |
| Biyoçipler için fişler | Nanohmics, Inc. | Nanohmics, Inc. tarafından özel olarak üretilmiştir. 6 ° C'de depolamadan önce biyoçipler üzerindeki bağlantı noktalarını kapatmak için kullanılır. | |
| ECIS biyoçipleri için drenajlar | Nanohmics, Inc. | Nanohmics, Inc. tarafından özel olarak üretilmiştir. ECIS okuyucusuna yerleştirilmeden önce biyoçipler üzerindeki 2 iç porta yerleştirilir. Test enjeksiyonları sırasında fazla ortamın kanallardan boşaltılmasına izin verir. | |
| Hemositometre | Fisher Scientific www.fishersci.com | S17040 | Biyoçiplere enjeksiyon için hücre süspansiyonunu ayarlamadan önce hücreleri saymak için gereklidir. |
| 10X objektifli parlak alan mikroskobu | Leitz Labovert | Herhangi bir parlak alan mikroskobu kabul edilebilir. | |
| Sınıf II biyolojik güvenlik kabini | : Hücre kültürünün steril koşullar altında gerçekleştirilebildiği herhangi bir sınıf II biyolojik güvenlik kabini kabul edilebilir. | ||
| Mikrosantrifüj tüpleri, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 02-681-311 | Hücreleri saymadan önce 1 ml hücre süspansiyonu tutar. |
| Slip 10 cc kırmızı şırınga | Prosedür Ürünleri, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | , 9 ml test suyu numunesini çeker ve numuneyi biyoçipe enjekte etmek için kullanılır. |
| Slip 10 cc mavi şırınga | Prosedür Ürünleri, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | : 9 ml kontrol suyu örneğini çeker ve örneği biyoçipe enjekte etmek için kullanılır. |
| ½ oz. Şeffaf PET Plastik Kavanoz w / Beyaz Nervürlü Astarlı Kapaklar | SKS Şişe & Ambalaj A.Ş. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Test için L-15ex tozu ve 10 ml su numunesini karıştırmak için kullanılan numune şişeleri. |
| 50 ml steril konik polipropilen santrifüj tüpleri | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | 10 &# 956'lık 40 ml alikot tutmak için kullanılır; -20 ° C'de g / ml fibronektin. |
| NIDS ACE Asetilkolinesteraz İnhibitörü Tespit Testi | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com | ACE-400 | Sensörü, içme suyundaki pestisitlerin hızlı tespiti için tasarlanmıştır |
Kaynaklar
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
Yeniden basım ve izinler
