Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

58.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53561

⸱

1 Ocak 2016

 , 
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine

Bu makalede

Özet

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Özet

İç kulağın kokleasında bulunan Corti organı, spiral şeklinde düzenlenmiş ve ses algılama için tonotopik bir gradyana sahip mekanosensoriyel tüy hücreleri ve çevresindeki destekleyici hücreleri içerir. Fare kokleası yaklaşık 6 mm uzunluğundadır ve analiz için genellikle üç tura (tepe, orta ve taban) bölünür. Hücre kaybını, hücre bölünmesini veya mozaik gen ekspresyonunu araştırmak için, kokleanın tüm montajı veya yüzey hazırlığı yararlıdır. Bu diseksiyon yöntemi, z eksenindeki farklı düzlemlerdeki hücreleri görüntülemek için immünoboyama ve konfokal mikroskopi ile birleştirildiğinde Corti organı içindeki tüm hücrelerin görüntülenmesine izin verir. Bu z-yığını görüntülerinden çoklu optik kesitler de elde edilebilir. Ek olarak, farklı bir fiksasyon yöntemine ihtiyaç duyulmasına rağmen, elektron mikroskobunu taramak için tüm montaj diseksiyon yöntemi kullanılabilir. Burada, Corti organını üç sağlam koklear dönüş (apeks, orta ve taban) olarak izole etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bir haftalıktan yetişkinliğe kadar değişen fareler için kullanılabilir ve kokleanın kalsifikasyonunun eksik olduğu yenidoğan örnekleri için kullanılan teknikten farklıdır. Sıçan kokleasının diseksiyonu için biraz değiştirilmiş bir versiyon kullanılabilir. Ayrıca floresan etiketli antikorlarla immün boyama için bir prosedür gösteriyoruz.

Giriş

Temporal kemik içinde yer alan iç kulağın spiral şekilli koklea, Corti, memelilerde işitsel duyu uç organ organı ev sahipliği yapmaktadır. Koklea tonotopically düzenlenen ve yaygın olarak apikal ortadan ayrılır ve bazal tepesi 1 taban ve düşük frekans tespiti yüksek frekanslı ses algılama ile farklı frekans bölgelerine tekabül eden döner bir. Saç hücreleri, Corti organı mechanosensory hücreleri, farelerin 2,3 yaklaşık 6 mm uzunluğunda koklea, uzunluğu çalıştırın. Bu hücreler, merkezi işitsel yapıları tarafından işlenen sinirsel sinyalleri içine, sıvı dolu Membranöz labirent aracılığıyla iletilen ses dalgalarının, mekanik enerjiyi dönüştürmek. Burada anlatılan teknik, (yaş bir hafta yetişkinliğe kadar numuneler için) koklea kalsifikasyonu sonra Corti organı tüm bağlar hazırlanması için bir yöntem, tamamlandığında içerir. Ayrıca immunosta için bir yöntem mevcutbütün ining koklear doku monte edilebilir. Koklear bütün bağlar tüm saç hücrelerinin görselleştirme ve doğal uzamsal düzenlemeler destekleyici hücrelerin çevredeki için çok önemlidir ve konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu olarak analiz için izin.

Dr. Hans Engstrom ve Harlow Ades aslında onlar hızla mikroskopik analiz 4 Corti organı kısa bozulmamış kesimleri koruyarak, düzeltmek ve memelilerin çeşitli sıvı batık kalsifiye cochleae incelemek için bir teknik detaylı 1966 yılında bir bütün montaj koklear diseksiyon yöntemi tarif. Bir sabitlenmemiş, kalsifiye sıçan Kokleanın diseksiyonu da bir öğretim video 5'te gösterilen edilmiştir. Dr. Barbara Bohne ve Washington Üniversitesinde Gary Harding bu yönteme pek çok önemli değişiklikler yaptı. Koklear tüm montaj yönteminin kendi versiyonunda, temporal kemik, dekalsifiye oldu plastik gömülü ve beş yarım dönüşler veya on çeyrek dönüşler dissec edildited 6,7. O plastik gömme 8 gerekli değildi bu yüzden Dr. Charles Liberman ve Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Göz ve Kulak Infirmary'de meslektaşları, bu tekniği modifiye. Tekniğin daha da modifikasyon Burada sunulan diseksiyon yöntemi haberdar St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi 9-12 Dr. Jian Zuo'nun laboratuarında meydana geldi. Biz tam apikal, orta ve bazal dönüşler izolasyonuna izin veren Bohne ve Liberman daha Corti, organı erişmek için farklı bir strateji kullanın. Böylece disseke doku büyük ve diseksiyon veya immün işlemleri sırasında kayıp ya da hasar olasılığı daha azdır. Buna ek olarak, güncel yöntem apikal uç veya frekans bölgesini tanımlamak için bazal kanca mesafenin ölçülmesini kolaylaştırır.

Birçok laboratuarları koklear dokusunun immün gerçekleştirin rağmen bu yöntem nereden geldiğini, bu belli değildir. Bunun sonucunda Buffe engellemek için çeşitli tarifler vardırrs ve bireysel birincil antikor performansını etkileyebilir antikor inkübasyon tamponları. Burada, işitsel alanda en yaygın olarak kullanılan antikorlar için de geçerlidir floresan isim levhası antikor ile immünboyama için bir yöntem sunulmaktadır.

Koklea karmaşık şekli, Corti organı hassas yapısı ve kemik kapatma histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sağlamak. Çeşitli teknikler şu anda bu zor özellikleri aşmak ve Corti, kendi avantajları ve dezavantajları ile her tekniğin organı içindeki hücreleri görselleştirmek için işitme alanında kullanılmaktadır. Burada sunulan protokol küçük bir değişiklikle, potansiyel olarak bu alanda kullanılan diğer model organizmaların çeşitli cochleae içindeki kritik yapılara incelemek için kullanılabilir, yetişkin fare koklea bütün montaj diseksiyon sağlar ve.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Tıp Southern Illinois University School Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

Temporal Bones 1. Ekstraksiyon

  1. Fare kafatası 13 tabanındaki zamansal kemikler tespit ve standart model forseps kullanılarak kranial sinirler kazınması.
  2. Kapsüllü koklea çıkarmak için otik kapsül ucunda aşağı posteriyor semisirküler kanal üzerinde ters elle basının başparmak ile standart model forseps yerleştirin.
  3. El başparmak ve işaret parmağı ile ya da 10.5 cm ince makas kullanarak kafatası temporal kemiğin alt yarısı boşaltın.

2. Geçici Bones Post-fix

  1. 10 mM fosfat tamponlanmış tuzlu su içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) pH 7.4 ile inkubasyondan - 250 ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüpleri içine zamansal kemikler yerleştirin20 saat - 2 RT'de yedik.
    NOT: yuvarlak veya oval pencereye PFA apikal kap veya enjeksiyon Hiçbir açılması gereklidir. Cam şişe içinde% 16 konsantrasyonda satın alınabilir metanol ücretsiz, ultra saf, elektron mikroskobu (EM) notu PFA kullanmanızı öneririz. Bir şişe açıldı ve 1 seyreltilmiş sonra:% 4 çözelti haline PBS 4 (Bazı antikorlar tolere edebilir kısa tespiti ve diğerleri gerektiren 4 o C'de saklandığında, o kadar 2 hafta boyunca kullanılabilecek O / N (O / N) tespit).

3. decalcify Temporal Bones

  1. Tespit edildikten sonra, bir pipet kullanılarak, PFA çıkarın ve 120 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), biraz daha fazla 2 ml ile değiştirin. Tüp kapalı olduğunda hava kabarcıkları önlemek için tüm 2 ml'lik ependorf tüp doldurmak için emin olun.
    1. Hemen dekalsifiye Eğer değilse, o 4 ° C'de 10 mM PBS, pH 7,4 ve mağaza örnekleri ile PFA yerine
      Not: Tespit edildikten sonra, temporal kemik variab saklanabilirle antijenleri bağlı dekalsifikasyon incelenmeden önce zaman tutarındadır.
  2. Uçtan aşırı uca rotator yerleştirin tüpler ve RT'de 4 rpm'de döndürün. Bir pipet kullanarak günlük EDTA çözeltisi değiştirin. Dekalsifikasyon uzunluğu numunesinin yaş ve diseksiyon yaparak bilim adamı tercihine bağlıdır.
    1. Inkübasyon sürelerinde aşağıdaki yönergeleri kullanarak EDTA temporal kemikler inkübe:
      8 P15 numunelerin doğum sonrası gün (P): 2-4 saat; P21 için numuneler P15 için: O / N; P30 örnekleri P21 için: 2 O / N; 3 ya da daha fazla, O / N: P30 daha büyük numuneler için.
      NOT: Decalcification süreleri kullanıcıların tercihine tabidir ve gerektiği gibi uzatılabilir. Decalcification süresi yaklaşık 8 saat arayla, günde iki kez EDTA çözeltisi değiştirerek düşürülebilir. Bulaşmasını önlemek için daha uzun bir süre için 3 gün dekalsifiye Bazı laboratuarlar EDTA solüsyonuna% 1 PFA ekleyin.
  3. Numune yeterince dekalsifiye ise o zamansal kemikler koyun belirlemek içinna silikon diseksiyonu çanak elastomer kaplamalı ve yavaşça salyangoz şeklindeki koklea üzerine forseps basın. Doku süngerimsi ise, yumuşatma işlemi tamamlanır.
  4. Yumuşatma işlemi tamamlandıktan sonra, bir pipet kullanılarak EDTA çıkarın ve 10 mM PBS pH 7.4, 500 -1000 ul ekle. Kadar hazır 4 o C'de saklayın örnekleri incelemek için.

4. Silikon Elastomer kaplı Diseksiyon Dish oluştur

  1. Taban ve üreticinin talimatlarına göre bir silikon elastomer kapsülleyici kitinin sertleştiriciyi birleştirin ve iyice karıştırın.
  2. Çözüm siyah olana kadar toz kömür 3 yemek kaşığı ve iyice karıştırın - yaklaşık 2 ekleyin.
    NOT: Sıvı mürekkep veya sıvı kömür solüsyonu ile karıştırmak olmaz ve kullanılamaz. Silikon elastomer enkapsülant kitleri adım 4.2 atlanabilir sağlayan siyah satın alınabilir.
  3. Kaplamak için yeterli alt doldurma 60 mm cam veya plastik petri kaplarının içine solüsyonu dökülür. Bu takdirdebbles, mevcut yüzey üzerinde hava ile puf. Ayarlamak için oda sıcaklığında en az 24 saat bekletilir.
    Not: Silikon elastomer kaplı tabaklar yıl tekrar tekrar kullanılabilir. Bu silikon elastomer çatlamasına neden olur Ancak, temizlik için etanol kullanmayın.

(P7 ve Yaşlı Örnekleri için) Kohlea 5. Tüm Dağı Diseksiyon

  1. Orta / apikal döner bazal dönüş ayırın
    1. 10 mM PBS pH 7.4 ile üçte ikisi dolu dolu bir silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak bir dekalsifiye zamansal kemik yerleştirin ve aşağıdaki adımlar için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın.
    2. 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ve 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanılarak vestibüler bölgede zamansal kemiği tutun, kenarları boyunca ve apeks yukarıda aşırı otik kapsül doku kesip.
    3. 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, oval pencere içine bir bıçak takın ve spiral ligament / yanal boyunca birkaç küçük kesikler yapmakBazal dönüş duvarı.
    4. 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve temporal kemik dışında diğer bıçağı yerleştirin oval pencereye medial. Bu kesim, orta ve apikal döner gelen bazal dönüş ayırır.
  2. Bazal dönüş tam diseksiyonu.
    1. 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, bazal sırayla gerginliği ve vestibüler organların ayrılması bazal dönüş kesim için modiolus bağlanmak spiral ganglion sinir liflerini kesti.
    2. 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, Corti organı yukarıda ve aşağıda hem spiral ligament / lateral duvar kaldırmak için küçük kesikler bir dizi yapmak. Doku rehberlik 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanın. Silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak spiral ganglion sinir liflerini Pin, ancak doku gözyaşı gibi bu bölgede tutunmaya yok.
    3. Önceki adımlarda, Reissner en membranın bazı sırasındae sık sık silinecektir. Herhangi hala kalırsa, 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ile Reissner en zarı kavramak ve Corti organı uzak çekin.
      NOT: örtü oluşturan zar nadiren görülür ve genellikle kaldırılması için özel bir adım gerektirmeden uzak yüzer.
    4. Sonunda için, mümkün olduğunca düz dönüş yapmak ve spiral ganglion kalan aksonlar tutarak, disseke bazal dönüşü aktarmak için 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanmak için, spiral ganglion akson kalınlığını azaltmak için çeşitli kesimler yapmak Bir 48-yuvalı plaka (veya odacık slayt) 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul ihtiva etmektedir.
  3. Ayrı orta ve apikal dönüşler
    1. Koklea, aşağı apikal tarafında kalan üçte ikisini yerleştirin.
    2. 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, kullanılan orta dönüş bazal dönüş bağlanacak scala ortamı içine bir bıçak yerleştirin ve th spiral ligament / yan duvar boyunca birkaç küçük kesikler yapmake orta dönüş.
    3. 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece bıçağın üstüne yerleştirilir orta çevirmek ile kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve apikal ucundan 90 o açıyla, kemikli labirent dışında diğer bıçağı yerleştirin. Bu tepe dönüş gelen orta dönüş ayırır.
  4. Bazal da benzer bir şekilde, orta dönüş tam diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız).
  5. Apikal dönüş tam diseksiyonu.
    1. 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, apikal dönüş kapsayan kapağı açın. Bazal da benzer bir şekilde komple diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız).
      Not: Dissected koklear döner immün önce birkaç hafta içinde 4 o C'de 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) içinde 10 mM PBS, pH 7.4 içinde saklanabilir. Üzerine bakteriyel veya mantar büyümesi neden olabilir 3 hafta - Ancak PBS uzun 2'den buharlaşması ve periyodik olarak doldurulan gerekiyor ve depolama olacakgörüntünün kalitesini düşürebilir doku. Biz undissected temporal kemik olarak numunelerin uzun vadeli depolama öneririz.

Floresan Tagged Antikorlar 6. immün

  1. Diseksiyon sonra, 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul batırılmış bir 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) ayrı bir kuyunun her koklear dönüş depolar. Aşağıdaki adımlardan her biri için koklear dönüş, sıvı batık gereken üstte yüzen değil ya da kuyunun yanına yapışmış.
    NOT: her bir sıvının sökerken, bu koklear dönüşler kaybetmek ya da pipet o kadar emmek için kolaydır. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak 200 ul pipet ile çözümler Değişen bu önlemeye yardımcı olur.
  2. Bir pipet kullanarak, her bir oyuğa PBS çıkarıp yerine ~ 200 - / bloke permeabilizasyon çözeltisi (oyuk başına 300 ul% 1 Triton X-100,% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS) 10 mM PBS içinde seyreltilmiş pH 7.4). 3B rotator oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    Not: kullanılan herhangi bir birincil antikor, bir keçi konukçuda yapılmış ise, o zaman ikinci bir anti-keçi antikoru gerekli olacak ve NGS herhangi bir aşaması için kullanılmamalıdır gerekir. Normal at serumu NGS için bir yedek olarak kullanılabilir.
  3. Bir pipet kullanılarak bloke / geçirimli hale çözeltisini çıkarın ve primer antikor çözeltisi, oyuk başına 100 ul ~ ile değiştirin (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). Her primer antikor için sulandırma faktörü değişir. 3D döndürücüde 4 o C'de O / N (en az 14 saat) inkübe edin.
    Not: birden çok birincil antikoru kullanıldığında, tüm sadece her birincil antikor farklı ev sahibi olduğundan emin olun, inkübasyon için aynı çözelti içinde kombine edilebilir.
  4. Bir pipet kullanılarak birincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. Her bir yıkama 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum kuluçkaya.
  5. Geçen P kaldırBS, bir pipet kullanılarak ve ikincil antikor çözeltisinin oyuk başına 100 ul ile ul yerine yıkama (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). 500 ya da 1: 1000 her biri için sulandırma faktörü floresan ikincil antikor, genellikle 1 olan etiketli. Floresan ışıktan korumak sekonder antikorlar etiketli bir kara kutu 48-plaka koyun. 3B rotator oda sıcaklığında 3 saat - 2 inkübe edin.
    Not: birden fazla ikincil antikor ihtiyaç varsa, inkubasyondan için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. Çapraz etiketleme imkanı yoktur emin olun (örn., Keçi anti-tavşan ve tavuk anti-keçi ikincil antikorlar kullanarak)
  6. Bir pipet kullanılarak ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun.
  7. Bir pipet kullanarak son PBS yıkama çıkarın ve Hoec oyuk başına ~ 100 ul ile değiştirinçekirdekleri etiketlemek için: hst 33.342 (10 mM PBS pH 7.4 2,000 1 seyreltilmiş). 3B rotator oda sıcaklığında 20 dakika - 15 inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. Uzun 20 dakika inkübe yapmayın.
  8. Bir pipet kullanılarak Hoechst çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun.
  9. Gerekirse tüm adımlar birkaç saat, Hoechst inkübasyon hariç uzatılabilir. Herhangi bir aşamada reaksiyonu durdurmak için, sadece 10 mM PBS pH 7.4 ~ 500 ul örnekleri batırmayın ve protokol saat veya 1 sürdürmek için hazır olana kadar 4 o C'de 48 eh plaka (veya bölme slayt) saklamak - 2 gün sonra .

7. Dağı Koklear slaytlar açar

  1. Etiket kullanılan örnek ve antikorlar konusunda ilgili bilgiler slaytlar.
  2. Pipet montaj medya ~ 50 ul her slayt üzerine ve dikkatli olmakkabarcıklarını engellemek için. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için montaj ortamı içeren tüp santrifüj.
  3. 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanarak, hafifçe montaj medyada slayt ve yere 48 plaka itibaren bir koklear dönüş transfer spiral ganglion aksonları kavramak. Slayt başına Dağı tek koklear dönüş görüntüleme işlemi sırasında ışığa maruz ve photobleaching önlemek için.
  4. Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, kullanım # 4 ya da 5. düz kuyumcu forseps koklear dönüş yeniden konumlandırmak için.
  5. Slayt üzerinde bir lamel bir ucunu yerleştirin ve yavaşça lamel düşmesine izin için bırakın.
  6. Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, yavaşça koklear dönüş yeniden konumlandırmak için ileri ve geri lamel hareket ettirin.
  7. Yer slaytlarböylece bir slayt klasörüne onlar düz koymak. Montaj edelim medya kür O / oda sıcaklığında N (DARK tutmak)
  8. Net oje ve mağaza oda sıcaklığında veya -20 o C Seal lamelleri kadar görüntülenmiş. Slaytlar slayt klasör veya slayt kutusunda saklanabilir.
    NOT: Slaytlar -20 o C veya -80 o C ve floresan uzun süreli saklanabilir birkaç ay için muhafaza edilecektir.
  9. Immün işlemi sırasında kullanılan ikincil antikorlar göre uygun dalga boyunda bir konfokal mikroskop kullanılarak Görüntü slaytlar. Parlaklık ve kontrast ayarı konfokal satıcı tarafından sunulan görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve tabanı) Şekil 1'de sunulan anahtar diseksiyon adımlarla, kalsifiye olan koklear dokudan olarak Corti organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Gelişiminin ilk doğum sonrası haftasında, kalsifikasyon sırasında Fare koklea eksiktir ve daha basit bir diseksiyon yöntemi 13 kullanılabilir. Corti organı P7 gelen kokleadaki ve gözyaşları içinde eski fareler sonuçları ve parçalama ile neonatal tüm montaj diseksiyonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Başarılı tüm montaj diseksiyonu ve immün için birkaç kritik adımlar vardır. Bu yöntemlerden birini gerçekleştirilir Ancak önce, koklear dokusunun uygun sabitleme gereklidir. Biz metanol, ücretsiz, ultra saf, EM dereceli PFA kullanmanızı öneririz. PFA metanol ve immünofloresan kalitesini düşüren dengesiz bir pH izlerini olabilir toz yaptı. Diğer gruplar, benzer diseksiyon formaldehit 14-16 içermeyen kullanılarak mümkün olan sabitleyiciler olduğunu göstermiştir. Sabitleme uzunluğu da önemlidir ve antikor ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Deniz Araştırmaları Ofisi'nden (N000141310569) bir hibe ile desteklenmiştir. Southern Illinois Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Görüntüleme Tesisi ekipmanı, Ulusal Araştırma Kaynakları-Sağlık Merkezi (S10RR027716) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Standart  desen forsepsGüzel Bilim Araçları11000-12diğer satıcılardan satın alınabilir
10,5 cm ince makasGüzel Bilim Araçları14060-11diğer satıcılardan satın alınabilir
2 ml mikrosantrifüj tüpleriMidSciAVSS2000diğer satıcılardan satın alınabilir
%16 formaldehit, metanol içermez, ultra saf, EM sınıfıPolysciences18814ZEHİRLİ --eldiven giyin ve lavaboya atmayın. Diğer satıcılardan satın alınabilir.
PBS pH 7.4 SigmaP3813-10PAKdiğer satıcılardan satın alınabilir
EDTAFisherBP118-500diğer satıcılardan satın alınabilir
uca tüp döndürücüFisher05-450-127diğer satıcılardan satın alınabilir
60 mm petri kabıFisher50-202-037diğer satıcılardan satın alınabilir
Dow Corning Sylgard 184 silikon kapsülleyici kitiEllsworth Yapıştırıcılar184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG
aktif kömürFisherAC134372500diğer satıcılardan satın alınabilir
stereo diseksiyon mikroskobuZeissStemi 2000diğer satıcılardan satın alınabilir
Dumont #4 kuyumcu forsepsGüzel Bilim Araçları11241-30
Dumont #5 kuyumcu forsepsGüzel Bilim Araçları11251-20
2,5 mm Vannas yaylı makasGüzel Bilim Aletleri15001-08kavisli 
5 mm Vannas-Tübingen yaylı makasGüzel Bilim Araçları15003-08düz
48 oyuklu plakalarFisher08-772-52diğer satıcılardan satın alınabilir
8 kuyulu oda kızaklarıFisher1256518diğer satıcılardan satın alınabilir
Triton X-100SigmaX100-500diğer satıcılardan satın alınabilir
BSA, kesir VFisherBP1605diğer satıcılardan satın alınabilir
NGSVector labsS-1000diğer satıcılardan satın
NHSVector labsS-2000diğer satıcılardan satın
3D döndürücüMidsciR3D-710diğer satıcılardan satın alınabilir
Western blot kuluçka kutusu XLLicor929-97401
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570diğer satıcılardan satın alınabilir
Prolong altın antifade montaj ortamıLife TechnologiesP36930diğer satıcılardan satın alınabilir, ancak montaj ortamları foto ağartmaya karşı koruma yeteneklerine göre farklılık gösterir
Superfrost Plus SlidesFisher12-550-15diğer satıcılardan satın alınabilir
lameller 22 x 22 x 1Fisher12-548-Bdiğer satıcılardan satın alınabilir
şeffaf ojeeczanediğer satıcılardan satın alınabilir
karton slayt klasörüFisher12-587-10diğer satıcılardan satın alınabilir
plastik sürgülü kutuFisher03-448-10diğer satıcılardan satın alınabilir
uçtan alınabilir alınabilir Yerel

Kaynaklar

  1. Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
  2. Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
  3. Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
  4. Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
  5. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442(2011).
  6. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
  7. Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
  8. Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
  9. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
  10. Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
  11. Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
  12. Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
  13. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685(2010).
  14. Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
  15. Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
  16. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  17. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Corti Organmm nofloresan BoyamaKonfokal MikroskopiKoklear D n lerSpiral Ligaman n kar lmasFloresan AntikorlarZ Ekseni G r nt lemeKoklear Diseksiyon
Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.