Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

7.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53564

⸱

6 Nisan 2016

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

Bu makalede

Özet

Bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresine bağlı, şirket içi yerleşik akışlı triptik mikro reaktör ile proteolitik sindirim için hızlı bir protokol sunulmaktadır. Mikroreaktörün üretimi, deney düzeneği ve veri toplama süreci anlatılmaktadır.

Özet

kütle spektrometrisi (MS) büyük çoğunluğu, protein analiz yöntemleri, tipik olarak tripsin ile, saptama için enzimatik sindirim aşamasından önce dahil tabanlı. Bu adım, kütle spektrometrisi enstrümantasyon etkili tarama aralığı içinde MW <3.000-4.000 Da genellikle, küçük molekül ağırlıklı peptid üretimi için gereklidir. Geleneksel protokoller 37 ºC'de O / N enzimatik sindirim içerir. Son gelişmeler, tipik olarak, örneğin, mikrodalga ya da yüksek immobilize enzim ya da bir kaç dakika için proteolitik sindirimi için gerekli zamanı azaltmak tamamlayıcı fiziksel işlemler (bir dizi bir mikroreaktör kullanılmasını içeren, farklı stratejiler, gelişmesine yol açmıştır baskı). Bu çalışmada, bir proteinin hızlı bir enzimatik sindirim elde etmek için herhangi bir laboratuvar uygulanabilir basit ve maliyet-etkin bir yaklaşımı açıklar. Protein (veya protein karışımı) C18-bağlanmış ters fazlı yüksek perf üzerine emdirilirbir kılcal sütununda önceden sıvı kromatografisi (HPLC), silis parçacıkları sergilemiş ve sulu tampon içinde tripsin kısa bir süre için parçacıklar üzerinde demlenir. on-line MS algılanmasını sağlamak için triptik peptidler MS iyon kaynağı, doğrudan artan bir organik içeriğe sahip olan bir çözücü sistemi ile elüt edilmiştir. Bu yaklaşım, yüksek fiyatlı immobilize enzim parçacıklarının kullanımını önler ve işlemi tamamlamak için herhangi bir yardım gerektirmez. Protein sindirimi ve tam bir örnek analizleri sırasıyla ~ 30 dakika az 3 ~ daha dk gerçekleştirilebilir ve yapılabilir.

Giriş

saflaştırılmış proteinlerin belirlenmesi ve tanımlanması, genellikle MS teknikleri kullanılarak elde edilir. Protein bir enzimle sindirilir ve peptitler, basit bir infüzyon deney düzeneği kullanılarak MS ile analiz edilir. Proteolitik sindirim çoğu MS analiz yararlı kütle aralığında düşüş küçük peptid fragmanlarını üretmek için gerekli olan ve kolayca amino asit sekansı bilgi üretmek için düşük enerji çarpışma kaynaklı ayrışma yoluyla parçalanmış olabilir. izole edilmiş proteinler veya basit bir protein karışımları için, MS tespiti önce peptitlerin kromatografik ayrılması için başka bir ihtiyaç vardır. 25-50 peptidlerinin bir karışım, kolayca MS iyonu kaynağı, doğrudan bir şırınga pompası ile örnek infüzyonu ile analiz edilebilir.

kütle spektrometresi analizi yapmak ve kısa zaman çerçevesi içinde bir proteinin dizisini teyit edebilir. modern veri elde etme yöntemleri ile, bu işlem, ağ yapılabilirbirkaç dakika, hatta saniye ithin. Kısa bir süre ölçeğinde tüm süreci tamamlamada sınırlayıcı faktör proteolitik sindirim adımdır. Tipik haliyle, bu işlem birkaç saat süreyle gerçekleştirilir (veya O / N), çözelti içinde, 37 ° C 'de, alt-tabaka kullanılarak: (50-100) enzim oranı: 1 arasındadır. Tarif edilmiştir mikroakışkan reaktörler veya ticari olarak temin edilebilen kartuş formunda, dakika ya da saniye hareketsizleştirilmiş enzim mikroreaktörlerde enzimatik sindirim süresini azaltmak için. 1-6 Tipik olarak enzim kovalent, kovalent olmayan bir fiziksel / adsorpsiyon, kompleks immobilize edilir oluşumu ya da kapsülleme, enzimatik işlemin 3,6 geliştirilmiş verimlilik ile elde edilmiş olmaktadır geniş yüzey-hacim ve enzim için alt-tabaka-oranları. immobilize reaktör diğer avantajları, MS analizinde enzimden otolitik ve parazit azalır enzim stabilitesi ve tekrar kullanılabilirliği geliştirilmiş bulunmaktadır. yaklaşımlar, cam ile ya da polimerik mikrofabrike cihaz çeşitli tarif edilmiştirantikor-antijen etkileşimleri, manyetik boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş enzimleri kullanılarak, 7,8 9 titanyum-alümina sol-jel 10 ve nanozeolites, 11 içinde kapsüllenmiş ya da Ni-NTA veya His-Tag kompleks oluşumu yoluyla çekilen altın nano partiküler ağlarında yakalanmış. 6 Alternatif immobilize enzimler ile açık boru şeklindeki kılcal damarlar, hem de geliştirilmiştir. 12 Dahası, gelişmiş proteolitik bölünme 30-120 reaksiyon sürelerini azaltmak için kontrollü mikrodalga ışıması 13 veya basınç destekli veya basınç çevrim teknolojisi (PCT) kullanılarak ortaya konmuştur min. 14

İmmobilize enzim reaktörlerin birden avantajlarına rağmen, ticari kartuş maliyetleri yüksek olduğu, rutin kullanım için mikroakışkan cihazların kullanılabilirliği sınırlıdır ve ek araçları için ihtiyaç mikrodalga veya PCT teknolojileri sonuçlarının kullanılması. Bu çalışmanın amacı, circumve bir yöntem geliştirmektiBu dezavantajların NTS ve kolayca dakika içinde MS analizi için hazırlık proteinlerin enzimatik bölünme gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yaklaşımla araştırmacılar güçlendirmek için, her laboratuarda uygulanabilir. yaklaşım kılcal ya da mikroakışkan cihaz önceden yüklenmiş olan hidrofobik, C18 partiküllerin kullanımına dayanır ve fazla enzimin infüzyonu sırasında enzimatik sindirme ile ve ardından bu parçacıklar üzerindeki ilgili protein (ler) adsorpsiyonu dolgulu yatak ve yakalanan protein (ler). Bu yaklaşımda, alt-tabaka kovalent olmayan etkileşimlerle hareketsizleştirilen edilir ve enzim hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​fazla demlenir. proteolitik sindirim verimliliği, enzimatik işlem, daha az ve parçacıkların yüzeyinden uzaklıkları ve yayılma süreleri için protein açığa büyük bir tanecik yüzey alanı artmıştır kütle transferi, enzim etkinliğine etki eden herhangi bir kovalent bağlanması, yeteneği artar hızla değerlendirme,Farklı enzimler, disposability ve çoğullama e kombinasyonları süreci mikroakışkan biçimde yürütülür ise. Bu yaklaşım, standart proteinler ve ESI-MS tespiti önce proteolitik sindirimi için tripsin en yaygın olarak kullanılan enzim karışımı kullanımı ile gösterilmiştir. Bu çalışmada tespiti için kullanılan kütle spektrometresi doğrusal bir tuzak dört kutuplu (LTQ) enstrüman oldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kılcal mikroreaktör hazırlanması 1.

  1. 100 um iç çap (ID) 360 um dış çap (OD) 7-8 cm uzunluğunda kılcal ve cam kılcal bıçağıyla 3-5 cm 20 um çapa x 90 mm OD kılcal X ekseni; herhangi çıkıntılı çapaklar olmadan, hem kılcal ucu temiz, düz bir kesim var mikroskop altında doğrulayın.
  2. ~ 6 mm uzunluğunda, 100 um iç çap x 360 mm OD borunun bir ucuna 20 mikron iç çapa x 90 mm OD kılcal yerleştirin; ihtiyaç halinde, mikroskop altında bu işlemi dikkate alınmalıdır.
  3. Q-ucu sonu ile 90 mikron OD / 100 mikron ID kılcal damarların birleştiği etrafında tutkal E6000 küçük bir damlacık uygulayın ve oda sıcaklığında tutkal kür O / N izin verin.
  4. ~ 10-15 mm bir uzunluğa eklenir 20 um çapa x 90 mm OD kılcal kesme; Bu elektrosprey iyonizasyon yayıcı olacaktır.
  5. Önceden kesilmiş 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK ve 1/16 "OD PTFE küvetuzunluğunda 4-5 cm parçalar halinde ing; Bu bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için kılcal birlikleri kullanılan kollu olacak.
  6. Bir PEEK birliğe 100 mikron ID x 360 mm OD kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 "PEEK kol kullanabilirsiniz.
  7. Ekle / birliğin karşısında sonunda içine 5 cm uzunluğunda 1/16 "PTFE tüp ~ bir parça sıkın.
  8. önceden temizlenmiş / 2 ml bir cam şişe kurutuldu C18 (5 um) bir parçacık ~ 4 mg ağırlığında; , 0.5 ml izopropanol ilave şişeyi kapatın ve ultrasonikatör banyosunda bulamaç dağıtmak.
  9. , 250 ul şırınga yaklaşık 200 ul bulamaç ile çekilme PEEK birliği 1/16 "PTFE tüp şırınga iğne takın ve yavaş yavaş 100 mikron ID x 360 mikron OD kılcal içine bulamaç dağıtmak; olarak mikroskop altında gözlemlemek kılcal elde edilir 2-3 mm'lik ambalaj uzunluğu kadar parçacıklar ile doldurur, bu mikroreaktör olacaktır (Şekil 1), 20 μ.m kimliği kılcal bir Keystone etkisi ile mikroreaktör partikülleri tutar. 15
  10. H2O / CH3CN 50:50 h / h 50 ul çözeltisi ~ ile mikroreaktör yıkayın ve daha sonra H2O / CH3CN 98 50 ul çözeltisi ~ ile: 2 h / h.

Örnek Çözümleri 2. Hazırlık

Not: Organik çözücü ve asitler ve çözelti hazırlama kullanımı içeren İşlemler davlumbaz ifa edilecek olan vardır. gözlük, eldiven ve koruyucu giysiler giyin.

  1. CH3 OH ile yıkayın ve bir kaç küçük cam şişeler (4 mi) ve polipropilen tüpleri (15 mi) kuru.
  2. H2O / CH3CN içindeki bir çözeltisine, 10 ml hazırlama (98: 2 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 200 ul CH3CN ile 9.8 mL H2O karıştırarak; sonikasyon ile karıştırın.
  3. Oluşan bir çözeltiye 10 ml hazırlamak H2O / CH3CN (50:50 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 5 ml H2 karıştırılarak </ sub> O ile 5 ml CH3CN; sonikasyon ile karıştırın.
  4. H2O / CH3CN, 4 ml 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş sulu bir çözeltisi (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlanması: Bir 4 ml bir cam şişe içinde (98 2 h / h); sonikasyon ile karıştırın.
  5. 4 ml H2O / CH3CN (50:50 h / h) 'de 4 ml bir cam şişeye 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş, organik çözelti (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlamak; sonikasyon ile karıştırın.
  6. 16 mg NH4 HCO3 tartılır 4 ml bir cam şişe içinde, bir analitik mikro-dengesi ile; (: 2 h / h 98) çözeltisi ve sonikasyon ile dispers, 2 O / CH3CN H 4 ml Bu sulu tampon içinde NH4 HCO3 (pH ~ 7.8), 50 mM çözeltisi ile sonuçlanır.
  7. Standart proteinin 5 mg ağırlığında (örneğin, büyükbaş hayvan serum albümin, hemoglobin α / β, sitokrom c, karbonik anhidraz, α-2-HS-glikoprotein, vs.), bir 4 ml cam tüp içinde bir analitik mikro-dengesi ile; 4 mi DI wate eklemer ve sonikasyon ile dağıtmak; Bu, tipik olarak yüksek bir uM düzeyinde konsantrasyonu çözelti ile sonuçlanır.
  8. NH4 HCO3 (50 mM), sulu tampon, uygun hacimde yüksek uM düzeyinde konsantrasyonu çözeltisi ile seyreltilmesi ile 1 ml protein çözeltisi (1-2 uM) hazırlama; sonikasyon ile karıştırın.
  9. (50 mm) NH4 HCO3 170 ul sulu tampon 20 ug dizileme dereceli tripsin eritilerek tripsin çözeltisi (5 uM) hazırlama; sonikasyon ile dağılır.

3. Deneysel Kurulum

Not: LTQ-MS sistemi, çeşitli örnek giriş yaklaşımlara kütle spektrometresi arabirim sağlayan bir ev yapımı XYZ kademeli içeren değiştirilmiş bir ESI kaynağı ile donatılmıştır.

  1. PEEK sendikası kılcal mikroreaktör ayırın ve PEEK Tee bağlanın.
  2. PEEK Tee yan kolunda bir ~ 2 cm uzunluğunda Pt tel takın; Bir temin edilmesi için bir 1/32 "PEEK kol kullanabilirsinizkaçak ücretsiz bağlantı ve Pt tel yalıtım.
  3. PEEK Tee karşı ucuna (~ 0.5 m uzunluğunda) Örnek transferi kılcal kanallardan 50 mikron çapa x 360 um OD geç; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 "PEEK kol kullanabilirsiniz.
  4. XYZ-sahnede PEEK Tee Güvenli ve uzak kütle spektrometresi giriş kılcal ESI yayıcı ~ 2 mm yerleştirin.
  5. kütle spektrometresi ESI güç kaynağı kaynağına Pt tel bağlayın.
  6. Paslanmaz çelik birliğe örnek transferi kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için 1/16 "PEEK kol kullanabilirsiniz.
  7. Paslanmaz çelik birliği karşı ucuna 4-5 cm uzunluğunda 1/16 "PTFE tüp bağlayın ve PTFE tüp 250 ul şırınga iğneyi; örneğin (pompa açmak ve istenilen değerde akış hızını ayarlamak, 2 ul / dakika).
  8. MS Enstrüman bir kontrol yazılım paketi içine girdi tandem MS veri toplama parametrelerianalizi yapmak için hazır kurulum için bir yöntem dosyası olarak kaydetmek d; LTQ-MS sistemi için, aşağıdaki veri bağımlı analiz parametreleri kullanabilirsiniz: dışlama kitle genişliği ile 180 saniye süreyle etkin dinamik dışlama 1,5 m / z ±; bir MS bir zoom ardından tarama ve MS ilk 5 en yoğun zirveleri üzerinde 2 tarama, 5 m / z ± tarama genişliği Büyütmek; çarpışma kaynaklı ayrışma izolasyon genişliği 3 m / z, normalize çarpışma enerjisi% 35, aktivasyon Q 0.25 ve aktivasyon zamanında 30 milisaniye olarak belirlenmiştir (CID) parametreleri.

4. mikroakışkan Kur

  1. Cam ya da polimerik substratlardan mikroakışkan cihazı hazırlanması; bir girişine bağlı 16-18 cihazının yerleştirimini Şekil 2A'da verilmiştir bir mikroreaktör oluşan (1) (0.13 mm genişlik x 2 mm uzunluk x 50 mm derinlik) (2 ), çıkışı (3) ve bir yan bağlantı noktası (4); Akışkan manipülasyonları için birbirine kanal ~ vardır110 mikron genişliğinde ve ~ 50 mikron derin; Çok kanallı yapı (5), oluşan ~ 1.5-2 mm derinlik x 10 mm genişlik x yerleştirilmiş 100 mikron uzunluğunda mikrokanallar 25 mikron dışında, mikroreaktör parçacıkları tutmak için bir filtre görevi görür.
  2. Veya sıvı teslim (Şekil 2B) için parçaları barındıran bir polimerik tavır oluşturulması yoluyla giriş delikleri için özel konnektörleri yapıştırma çip sıvı-teslim bağlantılarını etkinleştirin. 16
  3. Aşama 1.8 de tarif edildiği gibi C 18 partikülleri (5 um) bir bulamaç hazırlamak; çip yan bağlantı noktasına bağlı 1/16 "PTFE boru kullanarak bir şırınga ile mikroreaktör bulamaç sağlamak (4) 90 ° C sıcaklıktaki bir fırın içerisinde epoksi yapıştırıcı ve 1 saat için tedavi ile birlikte partikül yüklemeden sonra ağız yalıtım 16.
  4. kür O / N E6000 yapıştırıcı ile mühürlenir, izin, çıkış limanında bir kılcal (20 mikron ID x 90 mm OD x 10 mm uzunluk) yerleştirin; Bu (ESI yayıcı olur 6).
  5. 50 mikron ID x 360 mikron OD bağlayın (~ 0.5 m uzunluğunda) yonga giriş portuna örnek transferi kılcal (2); 3.6-3.7 tarif edildiği gibi, bir 250 ul şırınga ve şırınga pompasına kılcal karşıt ucunu.
  6. Giriş portuna hemen önce numune transfer hattı üzerinde, bir hafif PEEK bağlantı parçası yerleştirin (2) ve T-şekilli yan koluna bir Pt tel takmak, 3.2 de tarif edildiği gibi; Bu ESI elektrot olacaktır.
  7. kütle spektrometresi giriş kılcal ~ 2 mm uzakta konumlandırılmış ESI yayıcı ile XYZ sahnede mikroakışkan cihaz Güvenli; 3.8 de tarif edildiği gibi analiz için MS hazırlar.

5. Numune Yükleme, MS Analizi için proteolitik sindirim ve Elüsyon

Tüm solüsyon / Örnek aktarım basamağı, bir şırınga pompası yardımıyla gerçekleştirilir ve ölü volum telafi etmek için, tamamlamak için bir kaç dakika daha izin vermelidir: Notve mikroreaktör transfer hatları ile ilişkili es; Gerekli zaman ilgili akış oranları bağlıdır.

  1. Mikroreaktör durulayın ve 2 O / CH3CN H sulu bir NH4 çözeltisi HCO3 (50 mM) infüzyonu ile analiz için hazırlayın: 5 dakika için 2 ul (98 2 h / h) / dk; 250 ul şırınga kullanın.
  2. 2 ul örnek çözeltisi infüzyonu ile mikroreaktör protein örneği (1 uM) yük / dakika, 5 dakika boyunca; 250 ul şırınga kullanın.
  3. 1-3 dakika / 2 ul dakika mikroreaktör üzerinde adsorbe protein üzerinde tripsin solüsyonu (5 mcM) demlenmeye.
  4. TFA asitleştirilmiş sulu bir çözelti ile mikroreaktör durulayarak proteolitik sindirim süreci söndürün (% 0.01 hacim / hacim) H2O / CH3CN (98: 2 h / h) 2 ul / dakika, 5 dakika boyunca, 250 ul şırınga kullanın.
  5. (Protein TFA bir asitleştirilmiş organik bir çözüm beslerken tarafından mikroreaktör gelen sindirmek akıtılarak% 0.01 başlath / h) H2O / CH3CN (50:50 h / h), 300 NL / dakika.
  6. MS veri toplama süreci ve ESI voltajı (~ 2.000 V) açın; Adım 3.8 sağlanan veri toplama parametreleri kullanılarak MS veri elde; Triptik peptidlerin elüsyonu izleyin.

6. Veri İşleme

  1. Ham MS veri formatı ile uyumlu bir arama motoru ile tandem MS verileri işlemek.
    1. bir organizmanın belirli minimal gereksiz protein veritabanı kullanılarak LTQ-MS ham dosyaları işlemek; , Arama motoru ham veri yüklemek, sırasıyla 2 ve 1 Da ebeveyn ve fragmanı iyon kütle toleransları ayarlayın ve en fazla iki arama çatışmaları cevapsız ile sadece tam triptik parçaları kullanmak; posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez; sırasıyla% 1 ve% 3, yüksek ve orta-güven yanlış keşif oranları (FDR) ayarlamak ve posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez.
  2. sadece yüksek güven seçmek için verileri filtrelemekpeptid veritabanındaki proteinlere maçları; Protein ve peptid düzeyi sonuçlarını değerlendirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Proteolitik sindirim işleminin temsili bir sonuç, yukarıda tarif edilen mikroreaktörlerde (Şekil 1 ya da 2), Tablo 1 'de verilmektedir sahip bir protein karışımı, eşzamanlı olarak gerçekleştirilir. Tablo belirli bir protein tespit benzersiz peptid dizilerini ihtiva eder, çapraz korelasyon skoru (Xcorr) (yani, ilgili tandem kütle spektrumunda deneysel-to-teorik maçın kalitesini karakterize bir skor), cevapsız bölünmeler sayısını, peptid şarj ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada tarif mikroreaktör sağlayan kolay uygulanması en az 30 dakika, MS analizi ve tanılanması için proteinlerin enzimatik sindirim yapmak için deney düzeneği. Geleneksel yaklaşımlara kıyasla bu sistemin farklı avantajları, basitlik, hız, düşük reaktif tüketimi ve düşük maliyetleri içerir. Özel olarak, pahalı bir hareketsiz tripsin boncuk ve kartuş için bir ihtiyaç vardır. Kılcal mikroreaktör hazırlanması basit (Şekil 1A), ve genel olarak, bir kromatografi laboratuvarda bulunan standart kaynaklar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, IML'ye NSF/DBI-1255991 hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İyon tuzağı ESI-MSTermo ElektronLTQ LTQkütle spektrometresi, tandem MS verilerini elde etmek için kullanılır
XYZ aşamasıNewportBirden fazla parçaEv yapımı XYZ aşaması, ticari LTQ nano-ESI kaynağını çeşitli numune dağıtım sistemlerinden girdi alacak şekilde uyarlamak için kullanılır
Stereo mikroskopEdmund optikG81-278Mikroskop, mikroreaktör paketleme sürecini gözlemlemek için kullanılır
Analitik terazi/MetlerVWR46600-204Terazi, protein numunelerini tartmak için kullanılır
Ultrasonik banyo/BransonVWR33995-540Sonik banyo, numuneleri karıştırmak/homojenleştirmek ve C18 parçacık bulamacını dağıtmak için kullanılır
Şırınga pompası 22Harvard Aparatı552222Mikropompa, numuneyi ve enzimi paketlenmiş kılcal mikroreaktör
Milli-Q ultra saf su sistemiEMD MilliporeZD5311595 MilliQ su sistemi, arıtılmış DI suyu hazırlamak için kullanılır
Pipetleyici/Eppendorf (1.000  &mikro; l)VWR53513-410Pipetatör, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır
Pipettor / Eppendorf (100  &mikro; l)VWR53513-406Pipetatör, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır
Pipettor/Eppendorf (10  &mikro; l)VWR53513-402Pipetatör, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır
Erimiş silika kılcal (100 & mikro; m Kimlik x 360 ve mikro; m OD)Polymicro TechnologiesTSP100375Bu kılcal, mikroreaktör
Erimiş silika kılcalının (20  &mikro; m Kimlik x 100 ve mikro; m OD)Polymicro TechnologiesTSP020090Bu kılcal, ESI emitörünün imalatı için kullanılır
Erimiş silika kılcal (50 < &mikro; m Kimlik x 360 ve mikro; m OD)Polymicro TechnologiesTSP050375Bu kılcal, numuneleri ve eluentleri şırınga pompasından kılcal mikroreaktöre aktarmak için kullanılır
Cam kılcal baltaSupelco23740-UBu, erimiş silika kılcal damarları istenen uzunlukta kesmek için bir araçtır
TutkalEklektik ÜrünlerE6000 CraftBu yapıştırıcı, ESI yayıcıyı kılcal mikro reaktöre veya mikroakışkan çipe sabitlemek için kullanılır
Epoksi yapıştırıcıEpo-Tek353NDTBu yapıştırıcı, C18 parçacıklarının yüklendiği mikroakışkan giriş deliğini kapatmak için kullanılır
Ters faz C18 parçacıkları (5  &mikro; m)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18Bunlar, proteinlerin adsorbe edildiği C18 parçacıklarıdır; parçacıklar bir 4  mm x 20 cm C18 LC sütunu Agilent
Şırınga/camdan (250 & mikro; l)Hamilton81130-1725RNCam şırıngalar, C18 parçacık bulamacını kılcal mikroreaktöre yüklemek ve numuneyi ve eluentleri mikroreaktöre iletmek için kullanılır
Dahili indirgeme PEEK Birliği (1/16 "ila 1/32")ValcoZRU1.5FPKBu birleşim 250 & mikro'yu bağlamak için kullanılır; l 5 & mikroyu yüklemek için mikroreaktöre şırınga; m parçacık bulamacı
Paslanmaz çelik rakor (1/16 ")ValcoZU1XCPaslanmaz çelik rakor, cam şırınga iğnesini infüzyon kılcal
Mikro hacimli PEEK Tee konektörüne (1/32")ValcoMT.5XCPKPeek tee, numune transfer kılcalını kılcal mikro reaktöre bağlamak için kullanılır; yan kolunda, Pt telinin takılmasını sağlar
Tee konektörü (hafif)ValcoC-NTXFPKaracılığıyla mikroakışkan çipe ESI voltajı uygulamak için kullanılır.VWR
66260-126Pt teli, ESI üretimi için elektrik bağlantısı sağlar ve kütle spektrometresi ESI güç kaynağı
PTFE borusuna (1/16") bağlanır. OD)ValcoTTF115-10FTTeflon boru, şırınga iğnesi ile paslanmaz çelik rakor arasında hava geçirmez bir bağlantı sağlamak için kullanılır 
PEEK boru (0.015" Kimlik x 1/16 inç OD)Upchurch Scientific1565Peek boru, paslanmaz çelik rakor ile 50  arasında hava geçirmez bir bağlantı sağlamak için bir manşon olarak kullanılır; &mikro; m ID transfer kılcal
PEEK hortumu (0.015" Kimlik x 1/32" OD)ValcoTPK.515-25Peek boru, erimiş silika kılcal damarlar ile Peek Tee Temiz kesim polimer boru kesici Valco JR-797 arasında sızıntısız bir bağlantı sağlamak için bir manşon olarak kullanılır
kesici, 1/16" ve 1/32' önceden kesmek için kullanılır ~ 4-5 cm uzunluğunda parçalar halinde sızdırmaz bağlantılar için manşon olarak kullanılan peek polimer boru
Amber flakon (2 ml)Agilent HP-5183-2069Şişeler, numune çözeltilerini ve C18 parçacık bulamacını hazırlamak için kullanılır;
Amber flakon (4 ml)VWR66011-948Şişeler numune çözeltileri hazırlamak için kullanılır
Polipropilen tüp (15  ml)Fisher12-565-286DŞişeler tampon çözeltileri hazırlamak için kullanılır
Silindir (100 ml)VWR24710-463Silindir, çözücü hacimlerini ölçmek için kullanılır
Silindir (10 ml)VWR24710-441Silindir, çözücü hacimlerini ölçmek için kullanılır
Pipet uçları (1.000 & mikro; l)VWR83007-386Pipet uçları, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır
Pipet uçları (100 ve mikro; l)VWR53503-781Pipet uçları, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır
Pipet uçları (10 & mikro; l)VWR53511-681Pipet uçları, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır
: Cam yüzeyler,NanofilmB270, beyaz taç, 3" x 3"Bunlar, mikroçip üretimi için cam yüzeylerdir
Erkek somun bağlantısı (1/16")UpchurchP203XBu bağlantı parçası, transfer kılcal damarlarını mikroakışkan çipe bağlamak için kullanılır
Nanoport montajıUpchurchN-122HBu bağlantı parçası, transfer kılcal damarlarını mikroakışkan çipe bağlamak için kullanılır
Protein standartlarıSigmaMultiple #
Asetonitril, HPLC sınıfıFisherA955
Metanol, HPLC sınıfıFisherA452
İzopropanol, HPLC sınıfıSigma650447
Trifloroasetik asitSigma302031
Amonyum bikarbonatAldrichA6141
Tripsin, sıralama sınıfıPromegaV5111
üzerine ve içinden yüklemek, durulamak ve ayrıştırmak için kullanılır;. bağlamak için kullanılır. Bu Tee konektörü, numune transfer hattı Pt kablosu (0.404 mm) Bu

Kaynaklar

  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Enzimatik SindirimProtein SindirimiTripsin SolüsyonuC18 PartikülleriKütle SpektrometrisiKılcal KolonElektrospray İyonizasyonuPeptit ElüsyonuNumune Analizi
Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.