Method Article

Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

DOI:

10.3791/53589

⸱

January 26th, 2016

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodalga ışınlaması kullanılarak siklik peptitlerin sentezi için basit ve genel bir yöntem özetlenmiştir. Bu prosedür, yan zincirleri ve farmakoforik kısımları korurken farklı konformasyonların bir koleksiyonu ile omurga siklik peptitlerinin sentezini sağlar ve bu nedenle biyoaktif konformasyonun taranmasına izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri (PPIs) hemen hemen tüm biyolojik süreçlerin neden olduklarına ve birçok insan hastalıkları ile bağlantılıdır. Bu nedenle, temel araştırma ve ilaç sektöründe PPIs hedef büyük bir çaba var. Protein-protein arayüzleri düz, genellikle büyük ve genellikle bu tür siteleri hedeflemek küçük moleküllerin keşfi zorlaştıran, cepler yoksundur. Antikorlar kullanılarak alternatif hedefleme yaklaşımları kötü oral biyoyararlanım, düşük hücre geçirgenliği ve üretim verimsizliği nedeniyle sınırlamaları vardır.

PPI arayüzleri hedef peptidleri kullanma birçok avantajı vardır. Peptitler daha şekilsel esnekliğe, artan seçiciliğe sahip ve genellikle daha ucuzdur. Ancak, peptidler yoksul istikrar ve verimsizlik geçen hücre zarları da dahil olmak üzere, kendi sınırlamaları vardır. Bu tür kısıtlamaların üstesinden gelebilmek için, peptit siklizasyon yapılabilir. Siklizasyon peptid seçimliliği arttırmak için ortaya konmuşturMetabolik stabilitesi ve biyo. Bununla birlikte, bir siklik peptid konformasyonunu biyoaktif tahmin önemsiz değildir. Bu sorunun üstesinden gelebilmek için, bir çekici bir yaklaşım tüm omurga siklik peptitler aynı birincil sekansına sahiptir, ancak bu tür bir halka boyutu ve konumu olarak yapısını etkileyen parametrelerin, farklı olan ekrana odaklanmış bir kütüphanenin taranması için.

Spesifik parazit PPIs hedefleme omurgası siklik peptidlerin bir kütüphane sentezi için detaylı bir protokol açıklar. Rasyonel bir tasarım yaklaşımı kullanarak, aktive C-kinaz (EKSİKLİĞİ) için iskele protein L eishmania reseptörü türetilen peptidler geliştirdi. Biz ancak memeli konak homolog olarak, parazitler korunan LACK diziler, parazitlerin canlılığı açısından kritik olan proteinler için etkileşim siteleri temsil edebilir varsaydık. Halkalı peptidler reaksiyon sürelerini azaltmak ve artırmak için mikrodalga ışıması kullanılarak sentezlendiverimlilik. Farklı halka boyutları ile omurgası halkalı peptidler bir kütüphane geliştirilmesi en Biyolojik aktif konformasyon için sistematik bir ekran kolaylaştırır. Bu yöntem, döngüsel peptitler sentezlemek için bir genel, hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri (PPIs), hücre içi sinyal iletimine hücre ölümüne 1, en ​​çok biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, PPIs hedefleyen temel araştırma ve tedavi uygulamaları temel bir öneme sahiptir. PPI'lar özel ve stabil antikor ile düzenlenir, ancak antikorlar üretmek ve zayıf biyoyararlanıma sahip pahalı ve zordur edilebilir. Alternatif olarak, PPIs küçük moleküller ile hedeflenebilir. Küçük moleküller, antikorlar ile karşılaştırıldığında sentezlenmesi daha kolay ve ucuzdur; ancak, görece daha az esnek ve geniş protein-protein arayüzleri 2,3 daha küçük boşluklara daha iyi uyum. Çeşitli çalışmalar, basit ve ucuz bir antikor daha küçük moleküllere göre daha esnek olan peptidler, protein arabirimleri bağlanan ve PPIs 4,5 düzenleyebildiğini göstermiştir. Küresel tedavi peptid pazarı 2013 yılında 15000000000 dolar civarında değer ve% 10,5 annua büyüyorLly 6. Ayrıca, 50'den fazla pazarlanan peptidler, klinik test farklı aşamalarında yaklaşık 270 peptidler ve gelişmiş klinik öncesi safhalarında 7 yaklaşık 400 peptidler vardır. Çok sayıda peptidler ilaç olarak kullanılmaktadır rağmen, peptidler hala zayıf biyoyararlanım ve istikrar, geçiş hücre zarlarında verimsizlik ve yapısal esneklik 8,9 dahil olmak üzere yaygın bir uygulama sınırlayan birçok zorluklar oluşturmaktadır. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için bir seçenek, örneğin, yerel (D-amino asit ve N-alkilasyon) ve küresel (siklizasyon) sınırlamaların 8,10-12 gibi farklı modifikasyonlar uygulamaktır. Bu modifikasyonlar, aynı zamanda doğal olarak meydana gelir. Örneğin, siklosporin A, bir bağışıklık bastırıcı doğal siklik peptit, tek bir D-amino asit içerir ve N-alkilasyon modifikasyonlar 13,14 geçer.

Doğal amino asitlerin değiştirilmesi, genellikle peptid etkiler, örneğin D- ve N-alkilasyon gibi lokal kısıtlamaları indükleme9'un s biyolojik etkinliği. Bununla birlikte, ilgi konusu sekans aynı kalır hangi siklizasyon, biyolojik aktiviteyi korumak için daha olasıdır. Siklizasyon farklı konformasyonları arasındaki dengeyi azaltarak peptid yapısal alanı kısıtlamak için son derece cazip bir yoldur. Genellikle tek bir işlevine aracı olan aktif yapının peptidi kısıtlayarak, biyolojik aktivite ve seçicilik arttırır. Siklizasyon ayrıca daha az bozucu enzimler tarafından tanınan bir konformasyonda peptid tutarak, peptid stabilitesini artırır. Gerçekten de, siklik peptitler, linear karşıt parçalarına göre 15-17 metabolik dayanıklılık, biyoyararlanımını ve seçicilik geliştirilmiş gösterildi.

Ancak, siklizasyon bazı durumlarda kısıtlama biyoaktif bir yapıyı elde peptidler engelleyebilir çünkü iki ucu keskin kılıç olabilir. Bu engel aşmak için, odaklanmış bir kütüphane olduğu tüm peptidler aynı birincil sequenc vare ve sonuç olarak sabit bir farmakoforlar sentezlenebilir. Kütüphanede peptidler için, daha sonra biyolojik olarak aktif en konformasyon 9,18 taranması için, ki böyle halka boyutu ve konumu olarak yapısını etkileyen parametrelerin, farklıdır.

Peptitler çözelti içinde ve şimdi daha yaygın peptid sentez yaklaşımı ve daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır, bir katı-faz peptid sentezi (SPPS) yaklaşımı, her iki sentezlenebilir. SPPS kimyasal transformasyonlar sentetik bileşikler 19 geniş bir yelpazede hazırlamak için bir bağlayıcı yoluyla katı bir destek üzerinde gerçekleştirildiği bir işlemdir. SPPS N-terminine bir katı desteğe bağlı olan C-terminaline, bir aşamalı bir şekilde amino asitlerin birbirini takip eden eşleştirme işlemi ile montaj peptidler sağlar. N-α-amino asit yan zincirler st için bir amino asidin ilave edilmesini sağlamak için peptid uzama sırasında kullanılan reaksiyon koşullarında kararlı olan koruyucu gruplar ile maskelenmiş olması gerekirep. Son aşamada, peptid reçineden serbest bırakılır ve koruyucu gruplar yan zincir eş zamanlı olarak giderilir. Peptid sentez edilirken, her karbodiimit süzme ile peptid-katı destek matrisinden çıkarıldı ve her bir bağlantı adımının sonunda yıkanmasını edilebilir. Bu tür bir sistem ile, yüksek bir konsantrasyonda reaktifler, büyük miktarda tamamlanması için birleştirme reaksiyonları tahrik ve tüm sentez aşamalar, malzemenin 20 arasında transfer olmadan aynı kap içinde gerçekleştirilebilir.

SPPS bu reaksiyon 21 izleme tamamlanmamış reaksiyonlar, yan reaksiyonların ürünleri, saf olmayan reaktifler yanı sıra zorluklar üretimi gibi bazı sınırlamalar vardır, ancak, SPPS avantajları peptid sentezi için "altın standart" hale getirmiştir. Bu avantajlar elde doğal olmayan amino asitler, otomasyon, kolay saflaştırmaya birleştirmek için bir seçenek, en aza fiziksel kayıp, ve fazla reaktifler kullanılmasını içeriryüksek verim. SPPS zor sekuenzler 21,22, floresan modifikasyonlar 23 ve peptid kütüphanelerinin 24,25 sentezinde, son derece faydalı olduğu gösterilmiştir. SPPS ayrıca oligonükleotidler 26,27, 28,29 oligosakaritlerin ve peptid nükleik asitler 30,31 gibi diğer poli zincirli montajlar için çok yararlıdır. İlginç bir şekilde, bazı durumlarda, SPPS geleneksel çözelti 32,33 yapılır küçük moleküllerin sentezi için avantajlı olduğu gösterilmiştir. SPPS sektöründe 36-38 araştırma ve öğretim 34,35 için küçük ölçekli hem de büyük ölçekte hem de kullanılır.

Esas olarak Peptidlerin sentezi için SPSS metodoloji kullanılır iki sentez stratejileri bütiloksikarbonil (Boc) ve 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) 'dir. SPPS'si için kişiye ilk strateji r peptidin grupları Yan-zincir koruma kaldırma ve parçalamak için güçlü asit koşulları gerektirir Boc olduğuEsin. Fmoc-temelli peptit sentez, ancak, orta dereceli bir baz koşulları kullanır ve asit-labil Boc protokolü 39 daha yumuşak bir alternatiftir. Fmoc stratejisi asit koşulları altında, peptidin reçineden ayrılması sırasında sentezin son aşamasında uzaklaştırılır ortogonal t-butil (tBu) yan zincir koruma kullanmaktadır.

Katı bir destek üzerinde peptit sentezi için genel çalışma prensibi Şekil 1 'de sunulmuştur. N-α-terminalinde bir geçici koruyucu grup ile maskelenen başlangıç ​​amino asidi, C-terminali reçineye yüklenir. (Şekil 1, Aşama 1) gerektiğinde yan zinciri maskelemek için bir yarı kalıcı koruyucu grup, aynı zamanda kullanılır. Hedef peptidin sentezi N-α-geçici koruyucu grubun korumasının kaldırılması, tekrarlı devreler aşağıdaki korumalı amino asit (Şekil 1, Aşama 2) ve bağlantı (Şekil 1 ile N-terminine C-termininden monte edilir Ong>, Aşama 3). Son amino asit (Şekil 1, Aşama 4) yüklendikten sonra, peptit reçine desteğinden ayrılmaktadır ve yarı kalıcı koruyucu-gruplar (Şekil 1, Aşama 5) çıkarılır.

figure-introduction-1
Katı fazlı peptid sentezi Şekil 1. genel şema. N-α-korumalı amino asit reçinesi (Aşama 1) bir bağlayıcı vasıtasıyla bir karboksil grubuna kullanılması ile tespit edilir. Istenen peptit N-a (Aşama 2) ve amino asit bağlama (Aşama 3) geçici koruma grubu (TPG) korumasının kaldırılması, tekrarlı devreler ile N-terminine C-terminaline kadar olan bir doğrusal tarzda monte edilir. Sentezi (Aşama 4) tamamladıktan sonra, yarı-kalıcı koruyucu-gruplar (SPG) peptidi yarılması (Aşama 5) boyunca kaldırılır.= "_ blank" olsun> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu siklizasyon (Şekil 2A) için tek seçenek, (B) halkalanmaya sağlar çünkü bu uygun bir yoldur, ancak sınırlı - (A) baş-kuyruk siklizasyonuyla: Tüm peptit zincirinin toplanması ardından, siklizasyon çeşitli alternatifler elde edilebilir Biyolojik olarak aktif fonksiyonel gruplar ihtiva ilgi sekansından amino asitleri - ancak bu amino asitlerin kullanımı bozmadan amino asit (ya da diğer yapı taşları) ile biyolojik aktivitesi (Şekil 2B) ve (C) siklizasyonunu etkileyebilir Biyolojik olarak aktif dizisi. Bu ilgi duyulan dizilimi (Şekil 2C) değiştirmeden odaklı kütüphanelerin üretilmesine imkan verir olarak bu molekülleri tanıtılması yaygındır.

figure-introduction-2
FŞEKIL 2. Alternatif peptit siklizasyon stratejilerinin C-terminal ve N-terminal arasında bir peptid bağı vasıtasıyla kuyruk siklizasyon (A) kafası.; Fonksiyonel gruplar arasında, (B) siklizasyon örneğin / glutamik asit (2) ya da yan zincir N- ya da C-ucu (3 aspartik sistein artığı (1), ya da lizin yan zincirleri arasında bir amid bağı arasında bir disülfid bağı olarak -4); (R0) öncesi ve (R7) biyoaktif dizisi sonra, örneğin ekstra amino asitler ya da amino asit türevleri ya da küçük moleküller ekleyerek (C) siklizasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Mikrodalga destekli böylece organik kimyasal hızlandırıcı, sentez reaksiyonlarını ısıtmak için mikrodalga ışıması kullanan 40,41 dönüşümler. Mikrodalga kimyası absorbe çözücü reaktif yeteneği / dayanmaktadırmikrodalga enerjisi ve dönüştürmek 42 ısıtmak için. Teknoloji yaygınlaşmadan önce, önemli dezavantajları kontrol edilebilirlik ve sentez protokolleri tekrarlanabilirlik ve yeterli sıcaklık ve basınç kontrolleri 43,44 mevcut sistemlerin eksikliği de dahil olmak üzere, aşılması gerekiyordu. Mikrodalga destekli peptid sentezi ilk rapor birleştirme verimlilik ve saflıkta 45 arasında önemli bir gelişme ile birkaç kısa peptidlerin sentezlenmesi için bir mutfak mikrodalga (7-10 amino asit) kullanılarak yapıldı. Ayrıca, mikrodalga enerjisi, zincir agregasyonunu azaltmak yan tepkimeleri azaltmak rasemizasyon sınırlandırılması ve tüm zor ve uzun sekanslar 46-53 için kritik olan birleştirme oranlarını geliştirdiği gösterilmiştir.

Şu anda, bir katı destek üzerinde peptitler veya ilgili bileşiklerin sentezi için mikrodalga ışınlama kullanılması, bir organik çözücü 54 yerine su içinde (A) sentezi de dahil olmak üzere, geniş; (B) peptitlerin sentezi ileBu tür sentez, sterik olarak engellenmiş bir amino asit türevlerinin, düşük bağlanma verimliliği tipik olarak zordur glikopeptidler 55-58 veya 59-61 phosphopeptides, ortak post-translasyonel modifikasyonlar; (C) olan bir yan zincir ile bağlı olan bir azot atomu 62 veya peptoidler, bir amino asit kalıntısının C (α) değiştirilmesi ile oluşturulabilir örneğin azapeptides olarak omurgasındaki modifikasyon ile peptidler, sentezi yerine Ca'sına atomu 63,64 daha amid nitrojen; (D) siklik peptit 65-71 sentezi; birleşimsel kütüphanelerin 51,72 ve (E) sentezi. Birçok durumda, yazarlar daha yüksek verim rapor geleneksel protokole göre, mikrodalga ışıma altında sentez süresini düşürmüştür.

Rasyonel tasarımı 73-75 kullanarak, fo skafold L eishmania en reseptörden elde edildi, anti-parazitik peptidleri gelişmişr C-kinaz (EKSİKLİĞİ) aktif. LACK Layişmanya enfeksiyonu 76 erken fazında önemli bir rol oynar. LACK düşük seviyelerde ifade Parazitler EKSİKLİĞİ temel parazit sinyal süreçleri ve protein sentezinde 78 katılır bile immün tehlikeye farelere 77 parasitize başarısız. Bu nedenle, EKSİKLİĞİ önemli bir iskele protein 79 ve değerli bir ilaç hedefidir. Ancak ev sahibi memeli benzerinin RACK olarak, parazitler korunan LACK diziler üzerinde yoğunlaşırken, biz 8 amino asit peptid kültüründe Leishmania sp. Canlılığını azalma (RNGQCQRK) belirledi.

Burada, yukarıda tarif edilen LACK proteini dizisi elde omurgası siklik peptit sentezi için bir protokol açıklar. Peptidler, Fmoc / tBu protokolü ile SPSS metodolojisine göre mikro dalga ısıtma kullanılarak katı bir destek üzerinde sentezlendi. Peptidler, bir amid bağı olarak aracılığıyla bir TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) taşıyıcı peptide konjuge edildiSPPS'si parçası. Hücre içine yüklerin çeşitli TAT merkezli ulaşım 15 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve hücre içi organellere içine kargo teslim 80 teyit edilmiştir. Dört farklı bağlayıcılar, süksinik ve glutarik anhidrid gibi adipik ve pimelik asit, iki ila beş karbonlu karboksilik asit bağlayıcılar oluşturmak için siklizasyonu gerçekleştirmek için kullanıldı. Siklizasyon mikrodalga enerjisi kullanılarak yapıldı ve son ayırma ve yan zincir koruma giderme adımları, mikrodalga enerjisi manuel olarak yapıldı. Otomatik bir mikro dalga sentezleyicisi kullanımı, ürün saflığı geliştirilmiş ürün verimini ve sentez süresini kısalttığını göstermiştir. Bu genel bir protokol, in vitro ve in vivo önemli moleküler mekanizmasının anlaşılması ve daha fazla insan hastalıklar için potansiyel ilaçların geliştirilmesi peptidleri kullanan diğer çalışmalar için uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekipman ve Reaktifler Hazırlık

  1. Hazırlama ekipmanları
    1. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir davlumbaz içindeki tüm adımları uygulayın.
    2. Kimyasal olarak (a cam bir sır ile 30 ml), bir Teflon bir reaksiyon kabı içinde, mikrodalga güç iletimi kontrol etmek için bir fiber optik ısı algılayıcı ile teçhiz Discover bir ek modül ile bir mikrodalga Peptid Sentezleyicisi kullanılarak katı destek üzerinde veya tek polipropilen peptidleri sentezler Kartuş (kaba frit ile 12 mi).
    3. Uygun karıştırma için, reaksiyon kabına, azot kaynağı bağlamak, ya da seçenek olarak polipropilen kartuşun her iki ucu mühürlenir, döner bir karıştırıcı üzerinde yer.
    4. Reaksiyon karışımları veya yıkar boşaltmak için, atık tuzağı ev tipi vakum bağlanın.
    5. Reaksiyon kabı içine fiber optik prob yerleştirin.
  2. Reaktif hazırlanması
    1. Rink Amide reçinesi AM 100-200 meş tartılarak reçine hazırlayın (0,204 mg)Doğru şişmesi için 2-4 saat boyunca çalkalanır, aşağı reçine yıkama ve boşaltmak için reaksiyon kabı / polipropilen kartuşa N 1 karışımı, N-dimetilformamid (DMF) / diklorometan (DCM): 1, 5 ml ekleyin.
    2. DMF içinde karşılık gelen Fmoc-amino asit çözülmesiyle asit solüsyonlarının amino 0.2 M 9-florenilmetoksikarbonil (Fmoc) hazırlayın ve amino asitler (Tablo 1) eriyene kadar karışım vorteks.
    3. (Benzotriazol-1-il) - - N, N, N ', N'-tetrametiluronyum heksaflorofosfat (HBTU), 100 ml DMF içinde ve katı kadar karışımı vorteks çözündürülür (Tablo 18.96 g O eritilmesi ile 0.45 M aktivatör çözeltisi karışımı hazırlayın 1).
    4. 65,2 ml 1-metil-2-pirolidinon (NMP) (Tablo 1) 34.8 mi N, N-diizopropiletilamin (DIEA) birleştirilerek 2 M aktivatör baz çözeltisi karışımı hazırlayın.
    5. 3,37 g 1-hidroksibenzotriazol hidrat eritilmesi ile 0.1 M çözelti, koruma kaldırma karışım hazırlayın (HOBt)% 20 h / h DMF içinde piperidin solüsyonu ve katı kadar karışımı vorteks 250 ml (Tablo 1) içinde çözülür.

2. Amino Asit Kavrama Fmoc korumalı

  1. Amino asit bağlama
    1. Reaksiyon kabı / polipropilen kartuş amino asit (2.5 mi) / aktivatör (1 ml) / aktivatör bazı (0.5 mi) ilave edilir ve reaksiyon, 300 sn (25 W, 75 ° C, Tablo 2) devam edelim. Çözüm boşaltın.
    2. DMF ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, RT) DMF ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Beş kez tekrarlayın.
  2. Fmoc korumasının kaldırılması
    1. 0.1 M HOBt reaksiyon kabı / polipropilen kartuş DMF içinde% 20 lik piperidin 7 ml ilave edilir ve 30 sn (45 W, 75 ° C, Tablo 2) inkübe edilir.
    2. Reaksiyon karışımını boşaltın.
    3. Reaksiyon kabı / polipropilen kartuş 0.1 M HOBt, DMF içinde% 20 lik piperidin 7 ml ilave edilir ve 180 saniye süreyle kuluçkalayın (45 B, 75 ° C, Tablo 2).
    4. Reaksiyon karışımını boşaltın.
    5. DMF ile reçine yıkanır. 120 sn (7 ml 0 W, oda sıcaklığı) için reçine DMF ekleyin ve çözüm boşaltın. Beş kez tekrarlayın.
      Not: İsteğe bağlı olarak, burada prosedürü duraklatmak ve daha sonraki bir tarihte yeniden.
  3. Amino asit birleştirme aşamasından sonra, (- 20 ° C 'de daha uzun bir süre deposu için reçine), 4 ° C'de en az birkaç gün, DCM ve mağaza ile reçine yıkayın.
    1. Bir polipropilen kartuşuna reaksiyon kabından reçine taşıyın.
    2. DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın.
    3. Bir üst kapak ve vana ile sıkıca polipropilen kartuşunu kapatılmalıdır.
    4. Yeni bir sentez başlamadan önce, DMF içinde 3-4 saat (7 mi), reçineyi kabartmak.
  4. Sentezini İzleme
    1. Hızla ilerlemesini belirlemek için Kaiser (ninhidrin) testi veya Kloranil testini kullanınsentez. İsteğe bağlı olarak, sentezlenen peptidin saflığı ve kütle belirlemek için küçük çaplı bir parçalanma reaksiyonunu gerçekleştirmek. Bölüm 9'a bakın.
      Not: Daha fazla sorun giderme için Tablo 3'e bakınız.
  5. Hedeflenen peptit sentezleme istediğiniz gibi tekrarlayın 2.1 ve 2.2 adımları: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. anhidrit / asit Kaplin

  1. Anhidrit birleştirme
    1. NMP ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) NMP ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın.
    2. NMP (5 mi) içinde karşılık gelen anhidrit 10 eşdeğer çözülür 1 eşdeğer 4-dimetilaminopiridin (DMAP) ve solüsyona 10 eşdeğer DIEA (Tablo 1) ekleyin.
    3. (25 / DIEA reçinesine anhidrit / DMAP 10 karışımını 300 saniye boyunca inkübe: 1: 10 eklemeW, 75 ° C, Tablo 2). Çözüm boşaltın.
    4. NMP ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) NMP ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın.
  2. Asit bağlama
    1. DMF ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) DMF ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın.
    2. DMF içinde karşılık gelen dikarboksilik asit 10 eşdeğer (5 mi) içinde çözülür. 1 eşdeğer DMAP ve 10 eşdeğer N, çözeltiye N 'diizopropilkarbodiimid (DIC) (Tablo 1) ekleyin.
    3. 30 dakika boyunca karıştırılmasıyla karışımın önceden aktive eder.
    4. Reçinesine eklenir ve 300 sn (25 W, 75 ° C, Tablo 2) boyunca inkübe ve solüsyonu boşaltın.
    5. DMF ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve drenaj çözeltisi DMF ekleyin. Adımı tekrarlayın üç kez.

4. N-metiltritil (Mtt) Grup DEPROTECT Korumaiyon

Not: lisin yan zinciri, N-metiltritil (Mtt) 81, asit labil koşullar 82,83 altında seçici koruması bozulabilir bir koruma grubu ile korundu. Korumanızı Mtt mikrodalga enerjisi olmadan bir çalkalayıcı üzerinde elle koruma grubu.

  1. Kapak fiş ve vana ile donatılmış bir polipropilen kartuşuna reçineyi aktarın.
  2. DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın.
  3. Reçinenin bir gramı başına polipropilen kartuş% 1 trifloroasetik asit (TFA),% 5 triizopropilsilan (TIS) ve% 94 DCM karışımı 15-25 ml ekleyin.
    Not: TFA kuvvetli asit ve aşındırıcı cilt, göz ve akciğer dokusuna son derece rahatsız edici.
    1. Her zaman başlığı içinde TFA konsantre solüsyonlar tutun.
    2. Iyi havalandırılan bir başlık uygun kişisel koruyucu donanım (göz koruması, bir laboratuvar önlüğü ve eldiven) ve çalışmayı kullanın. Derhal eldivenleri değiştirinOnlar TFA ve derhal temiz-up herhangi bir dökülme ile temas halinde. Deri veya gözler asit ile temas ederse, su ile hemen etkilenen alanı yıkayın ve ek 15 dakika yıkayın.
  4. Bir çalkalayıcı üzerinde polipropilen kartuşunu ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çalkalanır.
  5. Vakum uygulanarak polipropilen kartuş çözüm boşaltın.
  6. Tekrarlayın 4,3-4,5, üç kez yineleyin.
  7. DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Beş kez tekrarlayın.

Doğrusal Peptid 5. Siklizasyon

  1. DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Beş kez tekrarlayın.
  2. 50 ml'lik bir polipropilen tüpüne, 5 eşdeğer Benzotriazol-1-ly-oksi-tris-pirrolidino-heksafluorfosfat dibromometan GİRİŞ (PyBOP) (DBM, 5 mi) ve solüsyona 10 eşdeğer DIEA ilave (Tablo 1) çözülür.
  3. reçinesine eklenir ve 300 sn (25 W, 75 ° C, Tablo 2) inkübe edilir. Çözüm boşaltın.
  4. DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın.

Yan zincir Gruplarının 6. yarma ve korumanın kaldırılması

  1. DCM ve dietil eter ile reçine yıkanır.
    1. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. İki kez tekrarlayın.
    2. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı), dietil eter ekleyin ve bir çözüm boşaltın. İki kez tekrarlayın.
  2. Potasyum hidroksit (KOH, 1-10 g) üzerinde, en az 3 saat boyunca oda sıcaklığında vakum eksikatörü içinde reçine kurutun.
  3. Kurutulmuş reçine tartılır ve bir polipropilen kartuş aktarın.
  4. Önceden soğutulmuş trifloroasetik asit (TFA) yarılma kokteyli, 10 ml ekleme (örneğin,% 90 TFA,% 2.5 su,% 2.5 ve% 5 TIS fenol) reçine, her bir gram için.
  5. 3 saat çalkalayınızoda sıcaklığında karıştırıldı.
  6. 50 ml'lik bir polipropilen tüpü içine reçine filtre edilerek TFA bölünmesi çözeltisi toplayın. Filtrasyon için, 12 ml polipropilen kartuşunun içinde frit kullanın.
  7. Tüp soğuk dietil eter (35 mi) ilave edilir.
  8. 4 ° C'de 1207 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
  9. Eter tabakası boşaltacaktır.
  10. Adımı tekrarlayın 6,7-6,9, beş kez.

7. omurga Siklik Peptit Kurutma

  1. Aynı tüp içerisinde çöken peptidi tutmak ve 30 dakika için bir başlık kurutun.
  2. Su ve asetonitril (ACN) 1: 1 karışımı peptid çözülür.
  3. Sıvı azot içinde nihai ürün çözeltisi dondurun.
  4. Nihai ürün liyofilize edin.

8. Omurga Siklik Peptit karakterize

  1. Su (400 ul) içindeki ürünün küçük bir örnek (1 mg) çözündürülür.
  2. Bir ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi yolu çözdürülmüştür peptid (10-200 ul) enjektehy (RP-HPLC) sistemi peptit saflığı 34 test etmek.
  3. Kütle spektrometrisi matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MS-MALDI) 84 kullanılarak, peptidin kütlesini kontrol edin.
    1. Asetonitril 1 (v / v) karışımı kullanılarak bir 1: 1 ul (100 uM) peptidi karıştırın su matris 1 ul (5 mg / ml, α-siyano-4-hidroksisinamik asit) ile, 1: 1 (v asetonitril / hac) karışımı: TFA (% 0.1) su.
    2. Nokta MS-MALDI plaka üzerinde 1 ul.
    3. Örnek kurutun ve kütle spektrometresi içine yerleştirin.
  4. Peptid tartılır ve yüzde verim hesaplar.
  5. -20 ° C'de saklayın.

9. Sentezi İzleme

  1. Kaiser (Ninhidrin) testi 85
    1. Reaktif çözümleri hazırlayın.
      1. Damıtılmış su, 25 ml potasyum siyanit (KCN) 16.5 mg çözülmesiyle çözelti bir hazırlayın. Piridin 49 ml Yukarıdaki çözeltinin 1 ml seyreltilir.
      2. Çözelti B Hazırlama20 ml etanol içinde 1 g ninhidrin çözülmesiyle.
      3. 20 ml etanol içinde 40 g fenol çözülmesiyle Çözelti C hazırlayın.
    2. Amino asit kaplin tamamlamayı veya koruyucu grubun korumasının kaldırılması kontrol etmek için Kaiser testi kullanın.
      1. Bir test tüpüne reçine birkaç boncuk aktarın.
      2. Üç damla her çözeltinin (~ 100 ul) (A, B ve C) ekleyin ve karıştırın.
      3. 5 dakika boyunca 110 ° C'de bir ısıtma bloğu üzerinde test tüpünü ısıtın.
        Not: Mavi renkli taneler (pozitif sonuç) tam olmayan birleştirme tepkimesi ya da Fmoc koruma grubunun deproteksiyonu göstermektedir.
  2. Kloranil testi 86
    1. Her bir test için, taze aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. DMF içerisinde% 2 kloranil bir çözelti hazırlayın, çözelti A
      2. DMF içerisinde% 2 olan bir asetaldehid çözeltisi hazırlandı, çözelti B
    2. Amino asit bağlama veya t tamamlandığının kontrol edilmesinin kloranil testi gerçekleştirmekO koruma grubunun korumasının bozulması.
      1. 1.5 ml bir tüp içinde çözelti B, 100 ul çözelti A 100 ul karıştırın.
      2. Boncuklar bırakın ve yavaşça 5 dakika sallayın.
        Not: koyu kahve renkli taneler (pozitif sonuç) Fmoc koruma grubu veya bir Komple olmayan bir akuplaj reaksiyonunun korumasının kaldırılmasını işaret etmektedir.
  3. Küçük ölçekli bölünme reaksiyonu
    1. Kap tapası ve vana ile teçhiz edilmiş 3 mi polipropilen kartuş reçinenin küçük bir miktar çıkarın.
    2. % 95, 2 mL TFA karışımı,% 2.5 su ve% 2.5 TBS ile tedavi.
    3. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Karışım çalkalanır.
    4. Polipropilen kartuş cam hamuru kullanılarak süzme ile reçineyi çıkarın ve bir azot akımı ile çözücü buharlaşır.
    5. Su içinde eritin ve tortu HPLC ve / veya MS kullanılarak ürünün analizinin yapılması.

Kültür Tahlili 10. Layişmanya donovani promastigot canlılığı

  1. Leishmania donovani (L. donovani) büyüme ve tedavi koşulları
    1. Kültür L. 26 ° C 'de 4,5 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile Eagle Medium (DMEM) ve Dulbecco Modifikasyonunda donovani promastigotları.
    2. L. davranın donovani 26 ° C 'de 24 saat süre ile, siklik peptitler (100 uM) ile promastigotlar.
  2. Layişmanya donovani (L. donovani) canlılık testi
    1. Üreticinin protokolüne uygun olarak AlamarBIue 20 ul parazit uygunluğunun değerlendirilmesi.
    2. (570 nm'de uyarma ve 590 nm'de emisyonla) floresans ölçümü ile AlamarBIue azalma belirlenir. Daha yüksek flüoresans değerleri daha yüksek metabolik aktivitesi ve artan parazit yaşayabilirliğini göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada özellikle Leishmania parazitinin hayati PPIs hedef ve (antiparaziter ajanlar 87 olarak PPIs hedef peptidler hakkında inceleme için) antiparaziter ajanlar gibi hareket omurga halkalı peptidler odaklanmış küçük bir kütüphane gelişimini açıklar. Yeni bir omurga siklik peptit sentezi yoluyla farmakoforlar, uzatılabilir büyüklükte bir iskele halinde muhafaza edilmektedir. Burada önerilen odaklanmış kütüphanenin gücü siklizasyonu yoluyla yapısal serbestlik kısıtlı bir derecede izin verirken peptid i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam otomatik bir sentezleyici kullanılarak mikrodalga Layişmanya parazitin LACK proteini elde edilen omurgası, siklik peptitlerin odaklanmış bir kütüphane sentezi tarif edilmektedir. Siklik peptidlerin bir odaklanmış kütüphanesi korunmuş pharmacophores ve çeşitli bağlayıcılar ile geliştirilmiştir. Örneğin glutarik anhidrit, süksinik anhidrit, adipik asit, pimelik asit, lizin, ornitin, ve diğer yapı blokları gibi çeşitli bağlayıcıların eklenmesi siklik peptidlerin konformasyonal alan çeşitliliğini artırmak için ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz yararlı tartışmalar için Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang ve Daria Mochly-Rosen teşekkür ederiz. Fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı NQ için çalışma Sağlık Hibe NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< güçlü > REAKTİFLER< / güçlü >
Katı destek, Rink Amid reçine MLCBLBR-1330yükleme: 0.49 mmol / g
Fmoc-Ala-OHGelişmiş ChemtechFA2100
Fmoc-Arg (Pbf) -OHGelişmiş ChemtechFR2136
Fmoc-ASN (Trt) -OHGelişmiş ChemtechFN2152
Fmoc-ASP (OBut) -OHGelişmiş ChemtechFD2192
Fmoc-Cys (Trt) -OHGelişmiş ChemtechFC2214
Fmoc-Gln (Trt) -OHİleri ChemtechFQ2251
Fmoc-Glu (OtBu) -OHİleri ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHGelişmiş ChemtechFG2275
Fmoc-His(Trt)-OHGelişmiş ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHGelişmiş ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHİleri ChemtechFL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OHİleri ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHGelişmiş ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHGelişmiş ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHGelişmiş ChemtechFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHGelişmiş ChemtechFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHGelişmiş ChemtechFT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OHİleri ChemtechFW2527
Fmoc-Tyr(Ama)-OHGelişmiş ChemtechFY2563
Fmoc-Val-OHGelişmiş ChemtechFV2575
1-Metil-2-pirolidinon (NMP)Sigma328634Dikkat< / güçlü> Toksik / Son derece yanıcı / Tahriş edici.
N, N< / em>-Dimetilformamid (DMF)Alfa Aesar43465< güçlü > Dikkat< / güçlü> Toksik.
DMF ayrışmasından kaynaklanan dimetilamin izlerinin bir sonucu olarak Fmoc çıkarılması gibi yan reaksiyonları ortadan kaldırmak için yüksek kaliteli DMF kullanın.
Diklorometan (DCM)SigmaD65100 Dikkat< / güçlü> Zararlı
Dibromometan (DBM)SigmaD41868 Dikkat< / güçlü > Zararlı
Trifloroasetik asit (TFA)SigmaT62200 Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Toksik
Trifloroasetik asit, HPLC sınıfı (TFA)Sigma91707 Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Toksik
DietileterSigma31690Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Zararlı
Triizopropilsilan (TIS)Sigma233781 Dikkat< / güçlü> Tahriş Edici / Yanıcı
Su, HPLC sınıfıSigma270733
Asetonitroil, HPLC sınıfı (ACN)Fisher BilimselA998-4< güçlü > Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Tahriş Edici / Zararlı
< >N, N< / em >-Diizopropetilamin (DIEA)Sigma3440 Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Yüksek yanıcı
PiperidinSigmaW290807Dikkat< / güçlü> Toksik / Yüksek derecede yanıcı
PiridinSigma270970Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Zararlı
Etanol (EtOH)Sigma459844Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Tahriş edici
1-Hidroksibenzotriazol hidrat (HOBt)Sigma157260 Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Tahriş edici / Zararlı
O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N′,N′ - tetrametiluronyum hekzaflorofosfat (HBTU)Sigma12804Dikkat Tahriş Edici/Zararlı
Benzotriazol-1-ly-oksi-tris-pirolidinfosfonyum hekzaflorfosfat (PyBOP)Gelişmiş ChemtechRC8602Dikkat Tahriş Edici
NinhidrinSigma454044Dikkat Zararlı
FenolSigmaP3653Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Toksik
Potasyum siyanür (KCN)Sigma11813 Dikkat< / güçlü> Çok Toksik
Potasyum hidroksit (KOH)Sigma221473 Dikkat< / güçlü> Toksik
N, N' < / em>-Diizopropilkarbodiimid (DIC)Sigma38370 Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Toksik
4-Dimetilaminopiridin (DMAP)Sigma522805 Dikkat< / güçlü> Toksik / Tahriş
Edici Glutarik anhidritSigmaG3806 Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Tahriş Edici / Zararlı
Süksinik anhidritSigma239690Dikkat Tahriş edici/Zararlı
Adipik asitSigmaA26357Dikkat Toksik / Tahriş edici
Pimelic asitSigmaP45001Dikkat Toksik / Tahriş Edici
KloranilSigma23290Dikkat< / güçlü> Toksik / Tahriş Edici
AsetaldehitSigma402788Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Toksik
EKİPMANLAR< / güçlü>
SantrifüjBeckman CoulterAllegra 6R santrifüj
LiyofilizatörLabconcoserbest bölge 4.5
Vakum pompasıFranklin Electricmodel 1101101416, 3/4 HPAlcatel ile Franklin Motorlu pompa 
Polipropilen kartuş 12 mlUygulamalı Ayırma2419
12 ml polipropilen kartuş için kapak tapasıUygulamalı Ayırma8157
Polipropilen kartuş 3 mlUygulamalı Ayırma2413
3 ml polipropilen kartuş için kapak tapasıUygulamalı Ayırma8054
Durdurma muslukları PTFEUygulamalı Ayırma2406
Düz tüpler, 50 mlVWR21008-240
Ekstraksiyon manifoldu, 20 kutup, 16 x 100 mm tüplerSularWAT200609
Çalkalayıcı, BD adams nutator karıştırıcıFisher scientific22363152
Nalgene HDPE dar ağızlı IP2 şişeler, 125  mlFisher scientific03-312-8
Erlenmeyer şişesiFisher ScientificFB-501, 500 ml
Isıtma bloğuThermolyne1760 dri banyosu
Düz uçlu tek kullanımlık borosilikat cam tüplerFisher Scientific14-961-25
Mikropipetler ve uçlar FinnpipetteThermo20– 200 ve 100– 1.000 μ l
HPLC şişeleri - mikro vl pp 400 ve mikro; l PK100   VWR69400-124
HPLC şişesi- Mavi Geçmeli KapakVWR66030-600
Analitik HPLC sütunuPeeke ScientificU1-5C18Q-JJultro 120 5 & m C18Q, 4,6 mm İç Çap 150 mm
Hazırlık HPLC kolonu, XBridge SularOBD C18 5 & mikro; m sütun19 mm ve zamanlar; 150 mm
Kütle spektrometresiUygulamalı BiyosistemlerVoyager DE-RP 
Azot silindiri
Kurutucu
Analitik RP-HPLC sistemi Shimadzu LC-20aşağıdakilerle donatılmıştır: CBM-20A sistem kontrolörü, SPD-20A dedektörü, CTO-20A kolonlu fırın, 2 x LC-20AD solvent dağıtım ünitesi, SIL-20AC otomatik numune alma cihazı, DGU-20A5 gaz giderici (Shimadzu, MD, ABD).
Hazırlayıcı RP-HPLC sistemi Shimadzu LC-20aşağıdakilerle donatılmıştır: CBM-20A sistem denetleyicisi, SPD-20A dedektörü, CTO-20A kolon fırını, 2 x LC-6AD solvent dağıtım ünitesi ve FRC-10A fraksiyon toplayıcı (Shimadzu, MD, ABD).
, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112(2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710(2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373(2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Backbone Cyclic PeptidesMicrowave IrradiationProtein Protein InteractionsLeishmania ReceptorPeptide CyclizationSolid Phase SynthesisMass SpectrometryHPLC AnalysisAntiparasitic TherapeuticsConformational Diversity

Related Articles