Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Summary

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Abstract

Kriyo-elektron tomografisi (Cryo-ET), makromoleküler kompleksleri doğal bağlamlarında moleküler düzeyde görselleştirmek için güçlü bir üç boyutlu (3-D) görüntüleme tekniğidir. Teknik, başlangıçta numuneyi camsı buz içinde hızlı bir şekilde dondurarak numuneyi doğal durumunda korumayı, daha sonra yüksek büyütmede farklı açılardan bir dizi mikrograf toplamayı ve son olarak bir 3 boyutlu yoğunluk haritasını hesaplamalı olarak yeniden oluşturmayı içerir. Donmuş hidratlı numune elektron demetine karşı son derece hassastır ve bu nedenle radyasyon hasarını sınırlamak için mikrograflar çok düşük elektron dozlarında toplanır. Sonuç olarak, ham kriyo-tomogram, doğası gereği gürültülü bir görüntü ile karakterize edilen çok düşük bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. İlgilenilen konuları daha iyi görselleştirmek için, hem kontrastı hem de çözünürlüğü iyileştirmek için deneğin alt tomogramlarının ilk tomogramdan çıkarıldığı ve hizalandığı ve ortalamasının alındığı geleneksel görüntüleme analizi ve alt tomogram ortalaması kullanılır. Tilt serilerinin büyük veri kümeleri, farklı durumlarda, koşullarda veya mutasyonlarda kompleksleri anlamak ve çözmenin yanı sıra ortalama alma ve sınıflandırma için yeterince büyük bir alt tomogram koleksiyonu elde etmek için gereklidir. Bu verilerin toplanması ve işlenmesi, daha fazla analizin önünde büyük bir engel olabilir. Burada, bilgisayar kontrollü bir 300kV kriyo-elektron mikroskobu, bir doğrudan algılama cihazı (DDD) kamera ve tomoauto'nun kendi geliştirdiği son derece etkili, yarı otomatik bir görüntü işleme boru hattı yazılımı sarmalayıcı kitaplığına dayanan yüksek verimli bir kriyo-ET protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, Shigella flexneri mini hücrelerinde bozulmamış tip III sekresyon sistemini (T3SS) görselleştirmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Cryo-ET için uygun olan herhangi bir projeye uygulanabilir.

Introduction

Tip III salgılama sistemleri (T3SS), birçok Gram-negatif patojenlere için gerekli hastalık oluşturma etkenleridir. Ayrıca, iğne kompleksi olarak bilinen injectisome, ökaryotik konakçı hücreler ^{1, 2} içine bakteri efektör protein doğrudan translokasyon için gerekli olan santral T3SS makinesidir. Injectisome hücre dışı bir iğne, bir taban gövde ve sitoplazmik bir kompleksi içerir, bilinen sıralama kompleks ³ olarak. Daha önceki çalışmalar, önemli bir bazal vücut proteinleri ^{4, 5} atom yapılarla birlikte, Salmonella ve Shigella saflaştırılmış injectisomes 3-D yapılar ortaya çıkarmıştır. Salmonella, Shige....

Protocol

1. Minicell Hazırlık

1. S. yapmak flexneri minicells, yapısal olarak spektinomisin dayanıklı plazmid, 5 | il elektro Streptomisin dayanıklı serotip 5a (M90T-Sm) elektroporasyon ile hücrelere düşük kopya Escherichia coli hücre bölünmesi genleri ftsQ, ftsA ve ftsZ ifade plazmidi pBS58, 1 ul dönüşümü 1 mm küvetler 5 ms için 2.5 kV.
2. 1.5 ml kriyojenik mikrotüp% 15 gliserol içinde -80 ° C'de mağazanın Minicell örnekleri. Kullanılmak üzere, 4 ml hücreleri bir pipet kullanarak unthawed mikrotüpünden hücrelerin yaklaşık 5 ul kazıyın ve askıya hazır olduğunda spectinomycin ile triptik soy broth / ml konsantrasy....

Results

Minicells S. numuneleri flexneri toplandı ve Şekil 2'de ayrıntılı olarak boru hattı, aşağıdaki tomoauto kullanılarak şeması, Şekil 1 'de gösterdiği gibi işlenmiştir. Tilt-serisi düşük büyütmeli montaj haritalar üzerinde kullanıcı tarafından belirlenen noktalarda yüksek verimlilik tilt serisi edinimi için izin veren SerialEM ^10, (Şekil 3) kullanılarak toplanmıştır. Mikrograf.......

Discussion

Burada açıklanan yüksek verim yöntemi 1917 cryo tilt-serisi işlemek ve bozulmamış S. 4500 üzerinde alt tomogram üretmek için etkin flexneri ¹⁹ injectisome. Toplanan veriler kompleksi sıralama sitoplazmik dahil in situ injectisome içinde detaylı karakterizasyonu, yol açtı. Yöntem ayrıca injectisome sıralama platformun bileşimi aydınlatmak yardımcı varsayılan protein bileşenlerinin belirli bir silinmesi, birkaç mutant hücreleri görselleştirmek için kullanılmıştır. Bi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gliserol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soya Suyu	Sigma-Aldrich	22092
Spektinomisin	Sigma-Aldrich	S0692
Elektroporasyon Cihazı	Bio-rad	165-2100
1 mm Küvet	BTX	45-0124
1.5 ml Kriyojenik Tüp	Termobilimsel	5000-1020
1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpü	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Karbon Izgaraları	Quantifoil (Elektron Mikroskobu Bilimleri)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Kızdırma Deşarj Cihazı	Şirket		İçi Ticari Alternatif Mevcut
Vakumlu Kurutucu	Sigma-Aldrich	Z119016	Ev İçi Kızdırma Deşarj Cihazında Kullanılır
Yüksek Frekanslı Jeneratör	Elektro-Teknik Ürünler	BD-10A	Kurum İçi Kızdırma Deşarj Cihazında Kullanılır. DİKKAT: Bu cihaz yüksek voltaj üretir.
Santrifüj
Forseps	Dumont (Elektron Mikroskobu Bilimleri)	72705-D	Stil 5 Anti-manyetik
Kolliyodal Altın	Aurion		BSA 10nm
Filtre Kağıdı	Whatman		#2
Etan	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrojen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Piston Cihazı	Şirket		Ticari Alternatif Mevcut
Kriyojenik Izgara Saklama Kutusu	Elektron Mikroskobu Bilimleri	71166-30
Transmisyon Elektron Mikroskobu	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Doğrudan Algılama Cihazı Kamera	Gatan		K2 Zirve
Tomogram Satın Alma Yazılımı	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatifleri: UCSF Tomografi, Leginon, FEI Toplu Tomografi
Işın Kaynaklı Hareket Düzeltme Yazılımı	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html, >2 GB Nvidia GPU
Tilt Serisi Hizalama Yazılımı	GerektirirIMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatifleri: XMIPP, Protomo
Otomatik Referans İşaretleyici Modelleme Yazılımı	IMOD		Alternatifleri: RAPTOR (IMOD0 'a dahildir (Tomoauto'da kullanılabilir)
CTF Belirleme Yazılımı	IMOD		Alternatifleri: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Tomoauto'da kullanılabilir)
Tilt Serisi Rekonstrüksiyon Yazılımı	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatifleri: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es, Protomo
Tilt Serisi Otomatik İşleme Yazılımı	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Parçacık Toplama Yazılımı	i3		http://www.electrontomography.org Alternatifleri: IMOD
Alt Hacim Ortalama Alma Yazılımı	i3		Alternatifleri: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dinamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, PyTom http://pytom.org