Yöntem makalesi

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

8.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

10 Mart 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

Bu makalede

Özet

Kuş embriyonik gelişiminin geç aşamalarında yolk kesesi zarlarında lipid kullanım mekanizmasını incelemek için, birincil bir Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültürü sistemi kurduk.

Özet

Biz gelişim sırasında kuş embriyolar tarafından besin kullanımı aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir Endodermal epitel hücre kültürü modeli (AET) kuruldu. Döllenmiş Japon bıldırcın yumurta 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edildi ve daha sonra SAC membranları (YSM) EEC kültür sistemi kurmak için toplandı sarısı edildi. Biz YSM embriyonik endoderm katman izole edilir ve 2'ye membran dilimlenmiş - 3 mm parçalar kısmen 24 oyuklu kültür plakaları içinde, tohumlamadan önce kollajenaz ile sindirilir. EECS dokusu içinde çoğalan ve hücre kültür çalışmaları için hazırdır. Bu EECS, örneğin, in vivo olarak YSM tipik özelliklerini, lipid damlaları birikimine, sterol O-asiltransferaz ve lipoprotein lipaz ekspresyonunu olduğu bulundu. Kısmi sindirim tedavisi önemli ölçüde AET kültürünün başarılı oranı arttı. EECS kullanarak, biz SOAT1 sentezlenmesi cAMP d düzenlenir olduğunu göstermiştirependent protein A ile ilgili yol kinaz. Bu birincil Japon bıldırcın EEC kültür sistemi embriyonik lipid ulaşım incelemek ve kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak için bir araçtır.

Giriş

Kuş embriyo önemli beslenme kaynağı% 33 lipit,% 17 protein oluşan sarısı, ve% 1 kül. 1 embriyo gelişimi sırasında, sarısı kese zarının (YSM) embriyonik karın boşluğu içinde yetişen ve yavaş yavaş sarısı kapsar yüzey. Embriyonik gün 2 başlayarak, lipit metabolizması ve anjiyojenez ile ilişkili gen ekspresyonu kademeli YSM artar ve YSM yavaş tüy benzeri çıkıntılar geliştirir. 8,9 Bu çıkıntılar embriyo gelişimini desteklemek için sarısı besin emilimini artırır. YSM üç germ katmanları, endoderm, mezoderm ve ektoderm içeren bir extraembryonic dokudur. 14 yolk kesesi ektoderm nazikçe sarısı kesesi kapsayacak şekilde vitellin membran ile albümin ve bağlantılar ile karşı karşıyadır. Endodermal epitel hücreleri Kadm bölünebilir yumurta sarısı doğru doğrudan karşı karşıya ve besin kullanım portalları olarak hizmet vermektedir. 6 YSM genişledikçe, Endodermal epitel hücre (EECS) vardırİki grup, bölge vitelline ve alan vaskulosa içine e ve işlevsellik. 7

Konum Vitellin endodermal hücrelerden oluşan ve embriyo uzak olmaktadır; Konum vaskulosa mezodermal hücrelerden oluşan ve kan damarları ve bağ dokuları ile farklılaştırılmış EECS kapsar. embriyonik gün 5 ile, yumurta sarısı tamamen YSM ve ektoderm ve endoderm ile kaplıdır ve vasküler alan hızla büyüdü. YSM embriyonik dolaşım sistemine (sarısı türetilen çok düşük yoğunluklu lipoprotein) ve proteinler. 9, 2 Bu nedenle, lipit mekanizmaları incelemek için, birincil Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültür sistemi tesis yeniden oluşturur ve serbest bırakır lipidler, emer kuş embriyonik gelişim sırasında YSM içinde kullanımı.

Böyle triaçilgliserol, lesitin, fosfolipid ve kolesterol esteri (CE) olarak lipidler kuş embriyolar için birincil enerji kaynaklarıdır. gelişiminin erken aşamalarında, yumurta sarısı lipidler c vardırsadece% 1.3 CE omposed ve kuş embriyonik gelişim 3 orta vadede% 10-15 yükselir, 11. Kolesterol ester kuş embriyo YSM sterol O-asiltransferaz 1 (SOAT1) tarafından kolesterolden sentezlenir. 4

Kolesterol depo formu CE, CE lipoproteinler taşınır ve lipoproteinler dokulara dolaşımı ile taşınmaktadır. 13 Bir hafta ambar önce kuş embriyoların hızlı bir büyüme var. Yaklaşık sarısı kalan lipit içeriğinin% 68, bu aşamada emilir. 10 lipidler bir AET araştırma modeli ile açıklık kazanabilir kullanılmaktadır sarısı hangi mekanizma. Bir tavuk EEC kültürü protokolü bu araştırma hedefe ulaşmak için kurulmuştur. 2, 9 Ancak, gelişmiş AET hücre kültürü prosedürü ile besin kullanımını aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için gerekli doku eksplant düşük başarı oranına gelişimi sırasında kuş embriyolar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not:.. Bu prosedür ve Bauer ve ark, 2013 ve Nakazawa ve arkadaşları, 2011 tarafından geliştirilen 2,9 tavuk modeli Kültür Protokolü bir modifikasyonudur

1. Sağlıklı Embriyonik Gün 5 embriyolar Japon Bıldırcınlarında gelen hazırlayın

  1. Aynı kafeste birlikte 1 erkek ve 3 kadın cinsel olgun Japon bıldırcın yerleştirin. Besleme yem ve su ad libitum verilmiştir. Işığın 14 saat ve karanlığın 10 saat hayvan odasında ışık ayarlayabilirsiniz.
  2. öğleden sonra her gün plastik torbalarda döllenmiş yumurta toplamak ve embriyoların büyüme hızını yavaşlatmak için bir 16 ° C buzdolabında saklayın.
  3. İki haftalık bir süre içinde yumurta yeterli sayıda topladıktan sonra, beş gün boyunca iyi bir havalandırma ile 37 ° C inkübatör döllenmiş yumurta kuluçkaya yatmaktadır.

2. Bazal Orta ve Yıkama Çözümleri hazırlayın

  1. Büyüme ortamı olarak (pH 7.2 a ayarlanmıştır), DMEM / F-12 ortamı kullanın, ve ek% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NBCs) ve% 1 Pen-Strep Ampho ile. Çözelti (PSA, penisilin, 10 5 birim / L streptomisin, 100 mg / l; amfoterisin B, 0.25 mg / L).
  2. depolama için 10x konsantrasyonda fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın; yıkamak için (pH 7.2 ayarlamak, KCI, 2,667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM;; Na 2 HPO 4 -7 2 O, 8.06 mM NaCl, 137,93 mM içeren) ve yolk kesesi membran süre nemlendirin 1x PBS çözümü kullanın yumurta sarısı ve albümin gelen endoderm ayıran.
  3. endoderm pelet yeniden askıya (pH 7.2 a ayarlanmıştır) DMEM ortamı kullanın.

Japon Bıldırcın YSMs Primary EECS 3. Koleksiyonu

  1. 5 gün (adım 1.3) için toplanan yumurta kuluçkaya yatmaktadır. normal embriyonik gelişmeyi teyit etmek için bir yumurta Candler tarafından yumurta inceleyin.
    NOT: embriyonik 5. günde, YSM mezodermin sınır çok net ve 3 embriyonik tabakalar daha az birbirine sıkıca bağlı olan, bu nedenle ob kolaydırtain Endoderm. Sadece YSM koleksiyonları normal kapiller dolaşımı gelişim gösteren yumurta kullanın.
  2. dikkatle taze su ve% 75 etanol kullanarak kabuğu temizleyin. nazikçe, bir makas ile hava hücre konumundan yumurta kabuğu açın dışarı soyun ve 37 ° C 1x PBS ile dolu bir 10 cm kültür çanak forseps ve yerine göre bütün YSM toplamak.
  3. bir makas embriyo, yumurta sarısı ve yumurta beyazı kaldırmak ve nazikçe 1x PBS ile YSM yıkayın üç kez ve 10 cm kültür çanak PBS çözüm YSM yerleştirin kullanma.
  4. YSM gelen ektoderm kaldırmak için forseps ve bir makas kullanın. 2 forseps kullanabilir, bir sıkıca endodermal hücre tabakası tutmak için, ve diğer kılcal mezoderm tutun.
  5. bir mikroskop altında ayrı çekin ve embriyo doğru yönde mezodermin kenarından endoderm ayırın. 37 ° C wat büyüme ortamına, 15 ml bir damlalık ve yer kullanarak 50 ml santrifüj tüplerine açık sarı endoderm toplamaker banyosu tüm doku koleksiyonları tamamlanana kadar.

Kollajenaz Sindirim tarafından Endoderm Dilimleri 4. Sindirim

  1. Taze DMEM, 10 ml tip IV kollajenaz 6.5 birim çözülür.
  2. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g'de 50 ml tüpler (3.4) santrifüjleyin. orta aspire ve bir pipet kullanarak 6 cm kültür çanak tüm endoderm yerleştirin. Bu kültür kabı 1 ml kolajenaz çözeltisi ekleyin.
  3. Her dilimin büyüklüğüne kadar kavisli bir makasla 2 bıldırcın embriyolardan alınan endoderm dilimleyin yaklaşık 2 ila 3 mm. Bir damlalık kullanarak taze kolajenaz çözeltisi 9 ml ile birlikte bir 50 ml santrifüj tüpüne tüm dilimleri toplar.
  4. 175 rpm'de 37 ° C'de ve çalkalama su banyosunda 30 dakika boyunca kolajenaz ile doku Digest. kollajenaz ile Bu kısmi sindirim eksplant hücre çoğalmasını iyileştirmek için kullanılır.
  5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj ve yavaşça bir pipet kullanılarak süpernatan fraksiyonu kaldırma. 20 ml DMEM içinde süspansiyon pelet yıkayın ve 3 dakika boyunca 130 x g santrifüj sonra süpernatan fraksiyonu çıkarın.
  6. Yeniden askıya büyüme ortamında (% 10 NBCs ve% 1 PSA DMEM / F12) 12 ml pelet ve 24 oyuklu bir plakaya yavaşça ve eşit (her bir 500 ul hücre çözelti) tohum.
  7. Hücreler doku üzerinden çoğalmaya izin 2 gün boyunca havada% 5, 37 ° C'de CO2 doku eksplantlarında inkübe edin.
  8. Başka bir 2 gün boyunca inkübe hücreleri ve hücre canlılığı tahlil protokolü tarafından hücre canlılığı için karakterize eder. 15
    NOT: Yaşayan hücreler sitoplazmada içinde bir indirgeyici bir ortam sağlamak. Resazurin, aktif terkip maddesi, mavi renkte ve hemen hemen floresan olmayan bir toksik-olmayan, hücre geçirgen bir bileşiktir. hücre kültürlerine eklendiğinde, resazurin mitokondriyal enzimlerin sitosolde resorufine azaltılır. Resorufm kırmızı renkte ve oldukça floresan olduğunu. Canlı hücreler sürekli resazurin Resorufm dönüştürmek, artışlarlahücreleri çevreleyen kültür ortamının genel floresans ve renk asing.
  9. Açıklandığı gibi transkripsiyon ve PCR marker geni mRNA kantitatif gerçek zamanlı ters endoderm epitel hücresi total RNA izolasyonu gerçekleştirin. 16,17
    1. SOAT1 mRNA tespit etmek için ters transkriptaz PCR kullanarak (sens: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisens: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3' PCR ürünü = 168 bp) EEC hücreleri için bir özgün bir işaret olarak. Bir temizlik geni ve iç kontrol olarak β-Aktin mRNA (PCR ürünü = 151 bp: ';; 5'-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 anlamsız' 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 duygusu) kullanın.
    2. RT-qPCR ürün boyutunu tespit etmek için jel elektroforezi kullanın. % 1 agaroz jeli hazırlayın ve 2 ul yükleme boyası 10 ul qPCR karıştırın. Yük 10 ul de% 1 agaroz jeli içinde her birine Karışım 30 dakika süre ile 100V ile jel üzerinde çalıştırıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

tutarlı ve yararlı bir hücre modeli oluşturulması amaca ulaşmak için, biz uzanan ve çoğalma hızı ve avyan EECS performansını stabilize etmek gerekir. Bu kısmen, kolajenaz ya da kollajenaz artı dispase 0.6 U gibi proteolitik enzimler ile sindirilmiş endoderm ile bir enzimi sindirimi ile endoderm doğrudan inkübasyon karşılaştırıldı. Dispase polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize bir amino-endopeptidazdır. Proteaz sindirimi tedavileri Resim sindirim

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önceki kültürü sistemi, sadece sınırlı bir başarı olduğundan, daha iyi bir kültür sistemi gereklidir. Japon bıldırcın YSM endoderm gibi ex-vivo eksplant daha iyi bir büyüme performansı elde etmek için hücre-hücre kavşakları gevşetmek için kollajenaz gibi proteolitik enzimlerle tedavi gerektirir. Verilerimiz kısmi sindirimi tedavi hücre sayısı 2 gün sonra (Şekil 1) için tohumlama sonra sindirilmemiş doku kültüründen daha fazla olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kısmi proteolitik sindirim YSM hücre veri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Rekabet eden finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları yoktur. Hiçbir özel şirketten fon alamadık.

Teşekkürler

Mevcut protokolün geliştirilmesi için finansman özellikle Ulusal Tayvan Üniversitesi, Tayvan (hibe ID-104R350144) yanı sıra, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (hibe kimliği "Top Üniversitesi Planı Amaç" tarafından desteklenmektedir: EN 104 -2313-B-002-039-My3). Biz özellikle mevcut çalışma için bir hayvan odası ve laboratuar alanı sağlamak için Ulusal Tayvan Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'uGibco by Life technologies12800-017 10 X 1 LEEC peletlerini yıkamak için
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 LEEC'lerin kültürlenmesinde bazal ortam olarak
NBCSGibco by Life technologies16010-159EEC'lerin kültürlenmesinde tedarik serumu olarak
Pen-Strep Ampho. SolutionBI (Biological Industries)03-033-1B 100 mlOlası enfeksiyonu azaltmak için 
Kollajenaz Tip IVGibco by Life teknolojileri17104-019 1 g  Kollajenaz, Pro-XGly-Pro dizisinde nötr bir amino asit (X) ile glisin arasındaki bağ için özgüllüğe sahip bir proteazdır. Hücrelerin birincil dokudan ayrılması için proteaz olarak.
24 kuyulu plakaFALCON® REF-353047tüplerini takması ve uzatması için
Corning® CentriStarTM430829Membranların taşınması ve enzim sindirimi için
50 ml Konik Tabanlı Kapaklı TüpPRO TECHCT-50-PL-TWMembranların taşınması ve enzim sindirimi için
Karşılıklı çalkalama banyosuDEAGLESB302Membranlarda daha iyi enzimatik sindirim için
EEC'lerin 50 ml PP santrifüj

Kaynaklar

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kollajenaz SindirimiH cre Proliferasyon AnaliziRT qPCR AnaliziLipid Damlac BirikimiSOAT1 EkspresyonucAMP Yola Reg lasyonuKanatl Embriyonik Geli imi

İlgili makaleler