Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

(C I) Viral Mimik Poli ile Orta gebelik Sahnesi'nde Farelerde Anne Bağışıklık aktivasyonu indüksiyon

19.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53643

⸱

25 Mart 2016

 ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Maternal immün aktivasyon (MIA), otizm ve şizofreninin çevresel risk faktörü için bir modeldir. Bu makalenin amacı, bu modelin tekrarlanabilirliğini arttırmak için hamile farelerde MIA'nın nasıl indükleneceğine dair adım adım bir prosedür sağlamaktır.

Özet

Maternal immün aktivasyon (MIA) modeli, çeşitli psikiyatrik bozuklukların çevresel risk faktörü için bir kemirgen modeli olarak giderek daha fazla takdir görmektedir. Çok sayıda çalışma, MIA modelinin otizm ve şizofreni ile ilgili yüz, yapı ve öngörücü geçerlilik gösterebildiğini göstermiştir. MIA'yı modellemek için, araştırmacılar genellikle hamile kemirgenlerde bağışıklık sistemini aktive etmek için viral taklit poliinosinik: polisitidlik asit (poli (I: C)) kullanırlar. Genel olarak, immün aktif barajdan gelen yavrular, otizm ve şizofreni ile ilişkili davranışsal anormallikler ve fizyolojik değişiklikler sergiler. Bununla birlikte, farklı dozajlarda ve farklı zaman noktalarında poli (I: C) enjeksiyonu, farklı aşamalarda beyin gelişimini bozarak farklı sonuçlara yol açabilir. Burada, orta gestasyonel embriyonik 12.5 günde (E12.5) 20 mg / kg poli (I: C) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile MIA'yı indüklemek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin maternal-plasental-fetal eksende akut inflamatuar yanıtı indüklediği gösterilmiştir, bu da sonuçta otizm ve şizofreni ile ilişkili beyin bozulmaları ve davranışsal fenotiplerle sonuçlanır.

Giriş

Maternal immün aktivasyon kavramı (MIA) otizm ve şizofreni 1 ile maternal enfeksiyon dernek epidemiyolojik çalışmalar kaynaklanır. Plasentanın veya maternal viral enfeksiyondan 2,3 sonrasında fetal beyninde tespit replike viral patojen olmaması, yavru enfeksiyon etkisi oldukça patojenlere kendisinden daha anne bağışıklık sisteminin aktivasyonu neden olduğu varsayılmaktadır .

polisitidilik asit: MIA ve psikiyatrik bozukluklar, kimyasal olarak sentezlenmiş viral taklit çift iplikli RNA Poliinosinik enjeksiyonu arasındaki neden-sonuç ilişkisini aydınlatmak için: Hamile kemirgenler içine (poli (C)) yaygın MIA için hayvan modeli olarak kullanılmıştır 4,5. Poli (I: C) Toll-benzeri reseptör 3 (TLR3) ve poli sistemik uygulama tarafından kabul edilmektedir (I: C) viral benzeri akut inflamatuar yanıtı indükler. mekanizmalardan biri olan poli (l: C) PRyavrularda oduces davranışsal anormallikler ve nöropatolojiler anne-plasental-fetal eksen 6 yanlısı ve anti-inflamatuvar sitokinlerin bir dengesizlik neden gereğidir. Çeşitli gruplar psikiyatrik bozuklukların 7 etiyolojisi anlamak için MIA modelini benimsedik ve bağlı araştırma grupları arasındaki farklı ilgi alanlarına, immün aktivasyon çeşitli zaman noktaları beyin gelişimi ve davranışları 7 farklı tedirginlikler elde etmek için kullanılmıştır.

, Embriyonik 12.5 gün hamile farelere başarıyla MIA davranışsal, nörolojik indükleyebilen olduğunu göstermiştir (E12.5), (C I) California Institute of Technology Paul H. Patterson laboratuvar poli enjekte stratejisini benimsemektedir ve otizm ve şizofreni 8-11 ile ilişkili çocuklarında immünolojik değişiklikler. Bizim önceki çalışmalar MIA yavrular davranışsal anormallikler (örneğin, sosyal impairmen görüntülemek göstermektedirt, iletişim eksikliği, tekrarlayan davranış, anksiyete gibi davranış ve gizli inhibisyon açığı 8,10,12), bağışıklık düzensizliği ve sitokinler dengesizlik 8,13,14, fetal beyin gen ifadesinin 15 değişmesi, lobule VII Purkinje hücresinin kaybı beyincik 11, hipokampus 9 sinaptik özelliklerinin değiştirilmesi, gen x çevre etkileşiminin 13, bağırsak geçirgenliğinin değiştirilmesi ve bağırsak Mikrobiyota kompozisyon 16. Bundan başka, tedavi edici ve önleyici stratejileri, bu model sistemi 13,16,17 arasında geliştirilmiştir. E12.5 MIA uyararak, diğerleri MIA serebral sinaptozomal moleküllerinin 17 fetal mikroglial aktivasyon ve bazal ön beyin 18 kolinerjik gelişimsel değişiklik, soy spesifik etkileşim 19, beyin beyin sinaptozomal ultrastrüktürel anormallikleri, beyin mitokondriyal solunum zinciri hiperfonksiyon abnormalties, infekte ürettiğini göstermiştir ,depresif benzeri davranışlar, biliş ve hipokampal uzun vadeli potensiyalizasyon (LTP) bozulma ve yetişkin hipokampal nöron 20 açığı.

(C I) yanı sıra, otizm ve şizofreni etiyolojisi incelemek için bu modeli uygulamak için nasıl paradigmaları Burada, poli tarafından E12.5 MIA ikna etmek nasıl ayrıntılı bir yöntem sağlar. MIA bozukluklarının 4 çeşitli bir risk faktörü olduğuna dikkat etmek önemlidir, ve sonuçları zaman ve indüksiyon yöntemi yanı sıra hamile barajlardan hayvancılık son derece duyarlıdır. Bu nedenle, laboratuarlar arasında bile küçük tutarsızlıklar genellikle düşük tekrarlanabilirlik ve / veya yavruda farklı fenotipleri neden olur. Bizim yöntem, özellikle otizm ve şizofreni için bir çevresel risk faktörü olarak MIA okuyan ilgilenenler için tasarlanmıştır ve ayrıntılı bir açıklama araştırmacılar verilerinin tekrarlanabilirlik geliştirmemize yardımcı olacaktır sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm protokoller Teknoloji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu California Institute (IACUC) onayı altında gerçekleştirildi.

Zamana-eşleşme çiftleri 1. Hazırlık

  1. gen ekspresyon analizi için en az 6, davranışsal deneyler için baraj ve 3 kullanın.
    Not: farelerin sadece% 50 zamanlı-çiftleşme gelen tıkanırlar olarak, tahmin edilen dişi farelerin iki kat kullanın.
  2. daha önce hiçbir gebelik ve yaş 8-16 haftalık dişi fareler kullanın.
    NOT: Dişi fareler erkek farelere önce cinsel maruz kalma var ama hamile olmamıştır kabul edilebilir.
  3. Ev dişi fareler ve birlikte yanyana onların östrus döngüsü senkronize etmek için kafesleri yerleştirin. 5 yetişkin farelerin konut sağlamak için 5.5 inç üzerinde bir yükseklikte ve 75 inç kare iç zemin ile standart fareler kafes kullanın. bir kulak yumruk kullanarak her kadın fare etiketleyin.

2. Zamanlı-mat kurmaing Çifti

  1. karanlık döngüsü başlamadan önce zamanlanmış-çiftleşme 0-2 saat ayarlayın. Her kafeste iki dişi farelerin yerleştirin. fareler çıkarın ve bunları tek tek tartın. Her dişi fare vücut ağırlığı kaydedin.
  2. İki dişi fareler her kafesin içine bir erkek fare yerleştirin. baba karıştırıcı etkisini en aza indirmek için üçlü çiftleşme kullanın.

3. Vajinal Plug Kontrol (E0.5)

  1. karanlık döngüsü sona erdikten sonra dişi fareler 0-4 saat kontrol edin. Yavaşça kuyruk tabanından kadın fare kaldırın ve kablolu fare ızgara, kafes top, ya da kafes kenar kapmak için izin verir.
  2. Vajinal fiş belirtilerini arayın: vajinal fiş vajinal açılışında görünür beyazımsı kitledir. Fiş açık değilse, yavaşça vajinal açılış içine 200 ul pipet yerleştirin. koagülasyon gelen direnç vajinal tıkacı oluşumunu onaylar. günde bir kez vajinal fişi kontrol edin.
    NOT: Vajinal fişi g nedenle değil çiftleşme oluştuğunu ancak bir göstergesidir veuarantee gebelik. Vajinal tamponun farelerin bazı suşları tespit etmek zor olabilir. Fiş kimlik doğruluğunu artırmak için deneyimli fareler bakıcı yardım isteyin.
  3. Yeni bir kafese takılı fareler taşımak ve grup onlara ev. embriyonik 0.5 gün (E0.5) olarak vajinal fiş görünüm günü belirleyin.

E10.5-11.5 4. Gebelik olup olmadığını kontrol edin

  1. Yavaşça kuyruk tabanını kaldırın ve kablolu fare ızgara, kafes top, ya da kafes kenar kapmak için izin verir. Gebelik, örneğin, karında bir çıkıntı (Şekil 1) belirtilerini kontrol etmek için karın alan gözlemleyin.
    NOT: Gebelik işareti her zaman E10.5 olduğundan daha E11.5 daha açıktır.
  2. gebelik doğrulamak için fareler tartılır. Hamile fare genellikle E10.5 yaklaşık% 20 daha ağır ve bir gebe olmayan fare (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında E12.5% ​​30 ağır bastığından. Tek Evi temiz kafeslerde hamile fareler.

5. 20 mg /kg Poli (I: C):

  1. gen ekspresyon analizi için grup başına en az 6 Davranış deneyler için grup başına baraj ve 3 kullanın. solüsyonu: poli (C I) tekabül eden miktar hazırlayın.
  2. 40 mg / ml bir nihai konsantrasyon yapmak için bir 50 ml konik bir tüp içinde: (Cı) Toz poli tartılır. en aza indirmek ve enjeksiyon hacmi kaynaklanan stres standart poli 5 ul enjekte etmek için (I: C) fare vücut ağırlığı (5 ul / g veya 5 ml / kg) her bir gramı için çözüm. kg'ı başına (Cı) MIA neden olmak için, poli 20 mg enjekte edilir.
    Not: poli konsantrasyonu (I: C) gerekli çözeltisi (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml'dir. poli yana (I: C) Toz,% 10 poli içeren çözelti (I: C), biz (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / poli ml (Cı) bir son konsantrasyon yapmak gerekir.
    DİKKAT: poli (I: C) toz çok hafif. konik tüp spatula aktarma sırasında herhangi bir toz kaybetmemek için dikkatli olun.
  3. Konik küvet içine,% 0.9 sodyum klorid (tuz) karşılık gelen ses eklemeE ve kapağını kapatın. Çözelti berrak olana kadar: (C I) toz hafifçe poli üzerinde tuzlu damlacık haddeleme tozu eritin. 1 dakika boyunca (Şekil 3C) 800 xg'de konik tüp santrifüjleyin. (C I) 0.22 mikron filtre ile çözüm poli Filtre. Bir 1.5 ya da 2 ml mikrosantrifüj tüpüne (Cı) solüsyonu poli aktarın. İsteğe bağlı: Çözüm: poli (C I) 260/280 oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Oranı, üretici tarafından tarif edildiği gibi 1,54-1,82 (Şekil 3) arasında olduğundan emin olun. NOT: (: C I) toz ve steril ve ilaç sınıf olmalıdır kontrol enjeksiyonu olarak hizmet poli eritmek için kullanılan tuz.

6. Salin ya da poli (I: C) E12.5 Enjeksiyon

  1. ölçekte fare tartılır ve kafes içine geri koymak. (C I) fareler: vücut ağırlığı (g) 5 ile çarpılarak = istenen enjeksiyon hacmi (ul) tuzlu ve poli hem de enjeksiyon hacmini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. 0.3 mi Insul kullanın(C I) çözüm, örneğin, bir 30 g fare için 150 ul şırınga tuzlu hesaplanan hacim veya 20 mg / kg poli hazırlamak için.
  2. Yavaşça kuyruk tabanı ile fare pick up ve kafesin üstüne yerleştirin. stresi ile oluşturulan karıştırıcı etkileri önlemek için yavaşça fareyi tutun. Iki üst meme (Şekil 4) merkezi haline fare yaklaşık 20 ° göreceli, yukarı konik, iğne takın ve tuz ya da poli (I: C) enjekte çözüm. Not: iğne enjeksiyonundan sonra her bir fare için değiştirilmelidir.
  3. geri evde kafes fare yerleştirin. diğer karıştırıcı etkilerini önlemek için sessiz, düşük trafik odasında kafesleri yerleştirin.

7. Poli Day After (I: C) Enjeksiyon (E13.5)

  1. Aşağıdaki sabah enjekte edilen fareler kontrol edin. vücut ağırlığını ölçmek için bir ölçek kullanın.
    NOT: Poly: tuzlu inj sonraki gün farelere enjekte daha (C) hamile fareler genellikle daha az kilo enjekteection.
  2. yavrular doğar kadar fareler rahatsız etmeyin.

MIA Offspring 8. Ölçer

  1. MIA indüksiyon karıştırıcı etkilerini en aza indirmek amacıyla, MIA yavruların kullanımını ölçmek için aşağıda listelenen yönergeleri izleyin.
    1. çöp boyutu 5'ten küçük preterm veya gecikmiş doğuştan veya eğer ibrelerin hariç tutun.
    2. Çöp boyutu 10 büyükse CO 2 tarafından aşırı yavrular euthanize.

9. İsteğe bağlı: MIA sonra akut inflamatuar Tepki inceleyin

  1. kurumun Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol anlatılan yöntem kullanılarak enjeksiyon: tuzlu su ya da poli (Cı) sonra hamile farelere 3 saat Kurban.
    NOT: Servikal dislokasyon genellikle baraj ve embriyo üzerinde CO 2 / ötenazi ilaçların etkisini en aza indirir olarak tercih edilmektedir.
  2. plasenta ve fetal sutyen erişkin gebe farelerin dalak toplayın ve izolestereomicroscope altında.
    1. dalak toplama, diseksiyon plaka üzerinde fare koymak ve hamile farelerin karın alanda% 70 etanol sprey. deri yoluyla göğüs kafesi altında karın alanının merkezinde dikey kesim yapmak için steril bir makas kullanın.
    2. Dalak sol üst kadranda oturur. dalak izole etmek için forseps kullanabilir. organın etrafında yağ doku kaldırmak için hassas görev silecekleri üzerinde dalak yuvarlayın. dalak dokusunun yaklaşık 50 mg toplayın ve nükleik asit bozulmasını önlemek için tampon veya TRIzol stabilize 500 ul RNA ile Eppendorf tüpleri tek tek koyun. kullanılana kadar -80 ° C'de derin dondurucuda Örnekleri saklayın.
    3. plasenta toplanması için hafifçe vücuttan rahim boynuzları çekin. otoklavlanmış fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dolu bir Petri kabındaki rahim boynuzları yerleştirin ve buz üzerinde bir çanak bırakın. rahim duvarına açık gözyaşı ve amniyotik kese maruz iki forseps kullanabilir.
      1. Dikkatle plasenta ve fetusun zarar vermeden amniyotik kese açmak için forseps kullanabilir. fetus plasenta ayrılması ve mümkün olduğunca plasentaya yakın göbek kordonu kesti. Plasenta amniyon kesesi enkaz kaldırmak. tek tampon veya TRIzol stabilize 500 ul RNA ile Eppendorf tüpleri plasenta yerleştirin. kullanılıncaya kadar -80 ° C derin dondurucuda de örnek saklayın.
    4. fetal beyin koleksiyonu için, diseksiyon kadar adım 9.2.2 den tampon stabilize RNA fetusu saklayın. stereomicroscope altında hassas 5. forseps kullanarak beynin ventrikül pial zarı kapalı alay. Dikkatle fetal beyin tüm membran kaldırmak. tek tampon veya TRIzol stabilize 500 ul RNA ile Eppendorf tüpleri fetal beyinleri yerleştirin. kullanılıncaya kadar -80 ° C derin dondurucuda de örnek saklayın.
  3. doku RNA Özü ve cDNA'ya RNA'nın dönüştürün. Gerçek t cDNA Il6 gen ekspresyonunu analizime PCR.
  4. TRIzol imalatı protokolünü takip ederek dokulardan RNA ayıklayın. dokular RNA stabilizasyonu tampon saklanır varsa. örnek çözülme ve tampon aşağı doğru döndürün. 500 ul TRIzol başka Eppendorf ucuyla doku aktarın ve RNA ekstraksiyon devam edin.
  5. konsantrasyon, 260/280 ve 260/230 RNA oranını ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. oranlar 2.0 üzerinde olduğundan emin olun.
  6. 10 | il son hacim olması için işlemden DNase I Karışım 1 ug RNA, RNA, 1 ul 10x reaksiyon tamponu, 1 ul Rnaz içermeyen Dnaz ve nükleaz içermeyen su ile DNA kontaminasyonu ortadan kaldırır. 30 dakika boyunca 37 ° C'de ana karışımı inkübe edin. reaksiyonu sonlandırmak için 1 ul DNaz durdurma çözüm ekleyin. 10 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe karışımı.
  7. cDNA RNA'yı ters. 20 ul reaksiyonları kullanın ve yukarı reaksiyon başına toplam RNA mikrogram ile 1. transkripsiyon (RT) reaksiyon karışımı tampon ters 5x 4 ul karıştırın, 1 ul reverse transkriptaz, DNaz I ve 4 ul nükleaz içermeyen H2O ile tedaviden sonra 11 ul RNA şablonu bir son 20 ul çözelti yapmak için. RT için termal döngü cihazı koşullarını programlayın. Genel bir durumu şunları içerir: Adım 1: 5 dakika boyunca 25 ° C; Aşama 2: 30 dakika boyunca 42 ° C; Adım 3: 5 dakika boyunca 85 ° C; Adım 4: 4 ° C'de tutun. cDNA 5 kez seyreltilir. Kısa süreli depolama için, 4 ° C'de cDNA saklayın. Uzun süreli depolama için, -20 ° C'de cDNA dondurmak.
  8. Gerçek zamanlı PCR ile cDNA Il6 gen ifadesini analiz etmek ve p-aktin için gen ekspresyonunu Il6 gen ekspresyonunu normalize.
    1. IL-6 ve β-aktin tespiti için bir master miks yapın. 25 ul reaksiyonu kullanın, her gen için master miks 12.5 ul SYBR Green Mix, 10 uM ileri primer 0.5 ul, 10 mM ters astar ve 6.5 ul nükleaz içermeyen H 2 O 0.5 ul içermektedir
    2. 5 ul 5x seyreltilmiş cDNA a yerleştirinoptik 96 kuyulu reaksiyon plakası kuyunun dibine t. Pipet her bir kuyunun ana karışımı 20 ul son 25 ul PCR karışımı yapmak. Her bir örnek için her bir genin, üç kopya halinde. Optik yapışkan film ile plaka Seal. 4 ° C kullanımı gerçek zamanlı PCR standart bir program 3 dakika boyunca 800 x g'de plaka Spin: Aşama 1: 50 ° C, 2 dakika için; Aşama 2: 10 dakika boyunca 95 ° C; Aşama 3: 15 saniye ve sıcaklık, 1 dakika boyunca 60 ° C sıcaklıkta 95 ° C 40 döngü. ayrışma eğrisi ek bir adım ekleyin.

10. MIA Yetişkin Offspring Davranış Patolojilerin (İsteğe bağlı) inceleyin:

  1. 8-12 hafta yaşlarda davranış testleri gerçekleştirin. en az 3 gün test öncesi kafes yatakları değiştirin. En az 30 dakika test öncesi davranışsal test odasına fareler alıştırıldı.
  2. prepulse inhibisyonu (ÜFE) için, bunun altında bir piezo-elektrikli sensörü ile pleksiglas silindir fareler dizginlemek. ÜFE fareler alıştırıldı5 dakika için bir oda oluşmaktadır. 120 dB beyaz gürültü (irkilme) 6 çalışmalar ile fareler Açığa.
  3. Ardından 15 dB (15 dB daha yüksek arka plan gürültüsü 14 çalışmalarda, irkilme 14 çalışmalarda, prepulse 5 dB (5 dB arka plan gürültü daha yüksek) + irkilme (PPI5) 14 denemeler ve prepulse 14 çalışmaların randomize karışımları ile fareler maruz arka plan gürültüsü + irkilme (PPI15) daha.
  4. 120 dB çalışmaların ilk 6 denemeleri için irkilme tepkisi ortalama. diğer bireysel uyarımlar için irkilme tepkisi ortalama. (- PPI5 veya PPI15 irkilme) / irkilme tarafından prepulse inhibisyonu değeri gizli.
  5. Açık alan testi için açık bir kare arena (50 x 50 x 50 cm 3) köşesinde fare yerleştirin. Bir tavana monte kamera ile 10 dakika fare yörüngesini kaydedin. Merkez bölgesi (17 x 17 cm 2) olarak arena merkezini tanımlayın. manuel veya görüntü tabanlı otomatik analiz yazılımı tarafından merkez bölgede harcanan katedilen mesafeyi, merkez bölge girişleri ve zamanı ölçmek.
  6. mermer gömme testi için 10 dakika boyunca sıkıştırılmış 5cm derin, temiz, Aspen çam yatak ile bir test kafesine fare gelmesini. onun homecage fare dönün. Yavaşça 4 x 5 düzenlemenin moda 20 lacivert 1.5 cm çapında cam bilye yerleştirin. 10 dakika boyunca mermerler test kafesine geri fare yerleştirin. 10 dk test süresi gömüldü mermerler sayın.

11. MIA Yetişkin çocuklarında Serebellar nöropatoloji (İsteğe bağlı) inceleyin:

  1. anestezi ile tuzlu ve MIA yetişkin döl euthanize. kalp-damar sistemi boyunca 50 mi, PBS ile fare ve daha sonra 50 mi% 4 paraformaldehid serpmek.
  2. dikkatle beyin çıkarın ve 4 ° C'de gece boyunca 4% paraformaldehid beyin postfix ° C. PBS ile üç kez beyin durulayın ve kullanılana kadar 4 ° C'de buzdolabında% 0.02 sodyum azid içeren PBS beyin saklayın.
    NOT: sabitlendi beyin% 0.02 çim ile PBS içinde saklanabilirBir ay kadar buzdolabında yum azid.
  3. Bölüm 50 mikron ince dilimler halinde beyin sagittally vibratome kullanarak. yumuşak bir fırça kalem kullanarak beyin bölümleri toplayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için% 0.6 hidrojen peroksit bölümleri inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini iptal eder.
  4. gece boyunca oda sıcaklığında bloke edici tampon (PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ve% 0.02 sodyum azid ile% 10 keçi serumu) içinde seyreltilmiş anti-kalbindin antikoru bölümleri inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 2 saat süre ile blokaj tamponu içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor tekabül eden bölümleri inkübe edin.
  5. Avidin DH bölümleri inkübe - Biyotinile peroksidaz lH kompleksi tamponu, oda sıcaklığında 1 saat süre ile biyotin tespit etmek. antijeni görselleştirmek için peroksidaz substrat kullanılarak bölümleri geliştirin. adımlar arasında PBS ile üç kez bölümleri yıkayın. mikroskop lamı üzerine bölümleri monte edin. Resim mikroskop altında kesitler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

/ Kg poli 20 mg Enjeksiyon: E12.5 (C) anne-plasental-fetal ekseninde bir akut enflamatuar yanıtı uyandırmak ve beyin gelişimi ve davranış fenotipleri 12,13 bir kronik etkisi hızlandırabilir olabilir. proinflamatuvar sitokin yüksek seviyeleri, İnterlökin (IL) -6, MIA sonrası akut inflamatuar yanıtın güvenilir bir göstergesidir. Enjeksiyon 12,13: Il6 gen plasenta ifade ve fetal beyin için zirve zamanı 3 saat sonrası poli (C I) yer almaktadır. Biz poli g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

farklı zaman camlara MIA indüksiyon kemirgenlerde farklı beyin geliştirme etkinlikleri bozan ve dolayısıyla yavrularda farklı davranış anormallikleri ve nöropatolijilerin yol açar. E12.5 enjeksiyon: Burada, poli (Cı I) farelerde MIA uyarılması için bir protokol tarif. MIA indüksiyon Bu yöntem davranışsal, nörolojik, immünolojik ve yavrularda 8,10,11,16 yılında otizm ve şizofreni ile ilişkili gastrointestinal anormallikler yol açar. MIA bir çevresel risk faktörü olduğu için, dikkat etmek önemlidir, yavru fenot...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz MIA modeli, otizm ve şizofreni araştırma ilerleme katkılarından dolayı merhum Dr. Paul H. Patterson onurlandırmak istiyorum. Biz bu protokole onun büyük destek Sarkis K. Mazmanian kabul; idari yardım için Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni ve Leslie A. Neumann; filme yardım için Ali Khoshnan ve Jan C. Ko; MIA indüksiyon onların tavsiye için Elaine Y. Hsiao ve Natalia Malkova; kendi uzman hayvancılık için Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, ve Natalie A. Verduzco. Bu eser (Paul H. Patterson NIH 5P50MH086383-04) NIH Conte Merkezi Ödülü ile desteklenmiştir; Otizm (Paul H. Patterson # 7670) konuşuyor; (Sarkis K. Mazmanian için # 322839), Simons Vakfı; NIH Eğitim Grant (K.-HC NIH / NRSA T32GM07616); (ZY için) Caltech Yaz Lisans Araştırma Bursu (SURF); Amgen Akademisyenler Caltech'te (ZY için) Programı; ve Doktora Sonrası Araştırma Bursu from Ulusal Bilim Konseyi, Tayvan (MGK 101-2917-I-564-039 W.-LW için).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Poliinosinik– polisitidik asit potasyum tuzuSIGMAP9582
%0.9 sodyum klorür INJ. USPHOSPIRANDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2"COVIDIEN8881600145
50 ml konik vidalı kapaklı tüplerABD BİLİMSEL1500-1211
Nanodrop 1000 spektrofotometreTHERMO SCIENTIFIC1000Opsiyonel
StereomikroskopWild HeerbruggM5AOpsiyonel
Dumont #5 Forseps Inox Uç Boyutu .10 X .06 mmRobozRS-5045Opsiyonel
RNAlater RNA stabilizasyon reaktifiQiagen76104Opsiyonel
TRIzol reaktifiLife Technologies15596-026 opsiyonel
RQ1 Rnaz içermeyen DNasePromegaM610Aİsteğe bağlı
iScript cDNA sentez kitiBio-Rad170-8891İsteğe bağlı
FastStart evrensel SYBR yeşil ana karışımı, ROX  ile;Roche4913922001Opsiyonel
Gerçek Zamanlı PCRABI7300Opsiyonel
Astar: Il6 ileriYaşam TeknolojileriTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCOpsiyonel
Astar: Il6 TersYaşam TeknolojileriTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCOpsiyonel
Astar: beta-aktin ileriYaşam TeknolojileriAGAGGGAAATCGTGCGTGACOpsiyonel
Astar: beta-aktin TersYaşam TeknolojileriCAATAGTGATGACCTGGCCGTOpsiyonel
MicroAmp optik 96 kuyulu reaksiyon plakasıLife Technologies4306737Opsiyonlu
MicroAmp optik yapışkan film Yaşam Teknolojileri4311971Optionl
EthoVisionNoldusEthoVisionOptionl
SR-LAB aparatı (PPI)San Diego Instruments SR-LABOpsiyonlu
MermerlerPENN-PLAXMavi değerli taşlar mermerlerOptionl
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)Yaşam Teknolojileri21600-069Opsiyonlu
ParaformaldehitMACRON2621-59Opsiyonlu
VibratomLeicaVT1000 SOpsiyonlu
Sodyum azidSigmaS2002Optionl
Triton x-100SigmaX100Optionl
Hidrojen peroksit çözeltisiSigma18312Optionl
Keçi serumuVektörLaboratuvarları S-1000Optionl
Tavşan anti-kalbindin antikoruAbcamab11426Optionl
Biyotinli keçi anti-tavşan IgGantikorVektör LaboratuvarlarıBA-1000Opsiyon
VECTASTAIN ABC KitiVektör LaboratuvarlarıPK-4000Opsiyon

Kaynaklar

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98(2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380(2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240(2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363(2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Poly I C EnjeksiyonuEmbriyonik G n 12 5ntraperitonal EnjeksiyonVajinal T ka TespitiZamanlanm iftle men uyaran nhibisyonuA k Alan TestiBilye G mme TestiIl6 Gen Ekspresyonu
(C I) Viral Mimik Poli ile Orta gebelik Sahnesi'nde Farelerde Anne Bağışıklık aktivasyonu indüksiyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.