Method Article

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

DOI:

10.3791/53644

⸱

January 6th, 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İyi geliştirilmiş bir teknoloji olarak antikor mikrodizisi, şu anda birkaç başka yerleşik veya gelişmekte olan yüksek verimli teknoloji tarafından sorgulanmaktadır. Bu raporda, üretim için yeni bir yaklaşım kullanarak ve yeni özellikler sunarak antikor mikroarray teknolojisini yeniliyoruz. Yüksek yoğunluklu antikor mikrodizimizin üretimi, tek sarmallı DNA'ların dikey olarak yönlendirilmiş akış modellemesi ve ardından DNA-antikor konjugatlarının aracılık ettiği dönüşüm yoluyla gerçekleştirilir. Bu protokol, DNA'nın akış modellemesinde, DNA-antikor konjugatlarının üretilmesinde ve saflaştırılmasında ve üretilen mikrodizinin kalitesinin değerlendirilmesinde kritik adımları ana hatlarıyla belirtir. Tekdüzelik ve hassasiyet, geleneksel mikrodizilerle karşılaştırılabilirken, mikrodizi üretimimiz bir dizi yazıcının yardımını gerektirmez ve çoğu araştırma laboratuvarında gerçekleştirilebilir. Diğer önemli avantaj, mikrodizi birimlerimizin boyutunun basılı dizilerden 10 kat daha küçük olması ve genel mikroçip tasarımlarıyla arayüz oluştururken tek hücrelerden fonksiyonel proteinleri analiz etme konusunda benzersiz bir yetenek sunmasıdır. Bu barkod teknolojisi, biyobelirteç tespiti, hücre sinyalleme çalışmaları, doku mühendisliği ve çeşitli klinik uygulamalarda yaygın olarak kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikor mikroarrayleri çok protein biyo-1-3 de dahil olmak üzere hedef proteinler, varlığını incelemek için yıllardır proteomik çalışmalarda kullanılmıştır. Bu alan şu anda böyle kütle spektrometresi (MS) gibi diğer yüksek verimli teknolojilerin büyük zorluklarla karşı karşıya olmasına rağmen, bu cihazlar diğer tahlillerde basit veri yorumlama ve kolay arayüzü göze başlıca nedeni, hala antikor mikrodizilerinin programı için oda bol. Son yıllarda, mikroçip iskelelerinin içine microarrays entegrasyonu antikor mikrodizisini 4-7 gelişmek için yeni bir fırsat sağladı. Örneğin, bir tek hücre mikroçip entegre barkod mikroarray hücre iletişim çalışmaları 8,9 kullanılmıştır. Bu teknoloji mevcut diğer mikroarray teknolojilere kıyasla belirgin avantajları vardır. Geleneksel mikroarray Elemen kullanılan tipik 150 mikron boyutunda çok daha küçük 10-100 um en dizi öğelerine sahipts. Daha küçük dizi elemanlarının yapımında sistematik bir akım-desen yaklaşımlar kullanılarak elde edilir ve bu da tek hücreli salgılanan proteinleri ve hücre içi proteinleri tespit kompakt mikrodiziler yol açmaktadır. Bir başka avantaj, basit bir alet içermeyen kurulum kullanılmasıdır. En laboratuarlar ve küçük şirketler mikrodizin çekirdek tesisleri erişmek mümkün olmayabilir, çünkü bu özellikle önemlidir. Bu barkod antikor mikrodizileri deney hacmi geliştirilmiş özelliği geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent deneyi ile karşılaştırılabilir yüksek hassasiyet ve özgüllük (ELISA 8) elde ederken tek hücreler üzerinde oldukça çoğaltılmış çok katlı testleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji tümör hücrelerini 13 glioblastoma 9-11 proteinleri, T hücreleri 12 tespit ve dolaşımdaki sayısız uygulamaları bulmuştur. Alternatif olarak, barkod DNA mikrodizileri yalnız taklit eden için nöronların ve astrositlerin hassas konumlandırma kullanılmıştırBeyin dokusunda 14 in vivo montajını ing.

Bu protokol, sadece deneysel adımlar ve akışkan numunelerde biyomarkerların tespiti potansiyel uygulamalar vardır, iki boyutlu (2-D) barkod antikor mikroarray birikmesi bloklar ve tek hücre odaklanır. Teknoloji adresli, tek sarmallı tek boyutlu (1-D) DNA mikro-dizisi dayanan cam yüzeylerde mekansal desenli ortogonal oligonükleotidler kullanılarak oluşturulabilir. Paralel akış kanalları akış desen aşamasında kullanılan zaman 1-D desen oluşturulur ve böyle bir model 1-D, Evrensel Ürün Kodu (UPC) barkod görsel olarak benzer ayrı bantlar olarak görünür. 2-D (n x m) antikor dizisinin yapım - 2-B Quick Response (QR) matris kod anımsatan - daha karmaşık desenlendirme stratejilerini gerekiyor, ancak daha yüksek bir yoğunluğa 8,15 olarak antikorların immobilizasyonu sağlar. Uydurmaikinci dik ilk şekil iki DNA model verme adımları gerektirir. Bu iki desen kesişme noktaları dizisi n x m unsurlarıdır. Stratejik akış desen kullanılan tek şeritli DNA (ssDNA) dizileri seçerek belirli bir dizideki her eleman belirli bir adresi atanır. Bu mekansal referans mikrodizi slayt floresan sinyalleri ayırt gereklidir. SsDNA dizisi (İDEAL 16), DNA tarafından kodlanan bir antikor kütüphanesi olarak bir platform oluşturan tamamlayıcı DNA-antikor konjugatları dahil edilmesi yoluyla bir antikor dizisine dönüştürülür.

Bu video protokol iki yönlerde hazırlanması dahil nxm antikor dizileri polidimetilsiloksan (PDMS) barkod kalıpları, akış-desen oluşturma ssDNA antikor oligonükleotid İDEAL konjugatlarının hazırlanması ve 3 içine 3 x 3 DNA dizisi dönüştürülmesi önemli adımları açıklamaktadırx 3 antikor dizisi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli kimyasallar tahriş edici ve ciltle temas halinde zararlıdır. Malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) başvurun ve bu protokolü uygulamadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Aşama (1.1.1) 'da kullanılan pirana çözeltisi yüksek ölçüde aşındırıcı olan ve ajitasyon ile aside yavaş yavaş peroksit eklenmesiyle hazırlanmalıdır. Davlumbaz aşırı dikkatli bu çözüm anlaştım. Uygun göz koruması ve aside dayanıklı eldiven kullanın. Trimetilklorosilan (TMCS) (1.1.6) daha sonra, isteğe bağlı bir aşamada kullanılan aşındırıcı, tutuşabilir bir kimyasaldır. Davlumbaz bu kimyasal Kolu.

Not: partiküler madde ile bulaşmayı en aza indirmek için bir temiz oda barkod slayt imalat ve kritik akış desen işlemleri gerçekleştirin. Toz partikülleri portları ve PDMS kalıp mikrokanallar engellemek ve akış-desenlendirme engel olabilir.

Tek dimensiona 1. İnşaatl DNA Barkod Slide

  1. Barkod akış modelleri için SU-8 master hazırlanması
    Not: dik akış modelleri için çizimler (Şekil 1A-B), bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak oluşturulur. Bu modeller krom photomask işlenir. Maskenin Saydam alanlar SU-8 master özelliklerine karşılık gelmektedir.
    1. 96 ° C'ye kadar ısıtıldı 1% 30 H2O 2 (pirana çözeltisi): iyice 3 H 2 SO 4 oluşan bir karışım içinde, bir silikon gofret (100 mm çapında) temizleyin. Iyonu giderilmiş su ve izopropil alkol ile gofret yıkayın, bir nitrojen üfleme tabancası ile kurutuldu.
    2. Gofret SU-8 2025 fotorezist yaklaşık 4 ml dökün. Muntazam 3000 rpm'de 30 saniye daha sonra, 500 rpm'de 10 saniye boyunca gofret photoresist'i yaymak için programlanabilir bir sıkma kaplayıcı kullanın. Bu ~ 25 um bir kalınlığı olan bir fotorezist tabakası meydana getirir. Yavaş yavaş durmadan önce yavaşlaması eğirme izin - Bu mai içinGofret yüzeyinde eşit kaplama ntain.
    3. Daha sonra 65 ° C 'de 1 dakika süre ile bir sıcak plaka üzerinde, kaplanmış gofret, fırında 95 ° C'de 5 dakika daha karıştırıldı. Bu adım kaplama katılaşmaya sağlar. 5 dakika boyunca oda sıcaklığına soğutun.
    4. Fotorezist ceket krom maskesi (Şekil 1C) yerleştirin. 20 sn için yakın-UV ışığı (350-400 nm, pozlama enerjisi 150-160 mJ / cm2) maske özellikleri Açığa.
      Not: krom maske tasarımı 50 mikron adımlı 20 mikron genişliğinde her biri 20 kanal içerir. Kanal zıt ucuna şeklinin bir ucundan sarma. Toplamda, 20 kanal 40 mm ~ bir uzunluğa ve yaklaşık 20 mm'lik bir genişliği olan bir dikdörtgen alanı kapsar. Her bir kanal, bir girişi ve bir çıkışı karşılık gelen iki dairesel özellikleri tarafından taarruz altında kalır. Giriş ve çıkışları değiştirilebilir.
    5. 95 ° C 'de 5 dakika süre ile bir sıcak plaka üzerinde ortaya gofret fırında. Yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
    6. Ajitasyon ile SU-8 geliştirici gofret daldırın5 dakika karıştırıldı. Izopropil alkol ve ardından taze SU-8 geliştirici küçük bir kısmı ile gofret, yıkayın. Bir azot darbe tabancası kullanarak gofret kurutun. Sabit fırında 30 dakika süreyle 200 ° C bir sıcak plaka üzerindeki bir gofret, gofret oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumaya bırakın.
      Not: beyaz film, bu adımda yıkamadan sonra gözlemlenmesi durumunda geliştirme daha uzun bir süre ile ifa edilebilir.
      İsteğe bağlı: 10 dakika boyunca kapalı bir Petri kabındaki buhar trimetilklorsilan maruz kaldığında SU-8 ana Silanize.
  2. PDMS barkod kalıbının hazırlanması
    1. 4.0 g kür maddesi ile 40.0 gr silikon elastomer tabanı birleştirin. 10 dakika boyunca şiddetli bir şekilde ön-polimer karışımı karıştırın. Vakum altında 20 dakika boyunca gazdan arındırın.
      Not: 1 (baz: sertleştirici madde) kütle oranı, genel bir kural olarak, 10 kullanır.
    2. Barkod deseni SU-8 master ile silikon gofret içeren bir Petri kabı içine prepolimerin dökün. PDMS karışımının yüksekliği yaklaşık 7.5 mm veya üzerinde olmalıdır. Petr karışım gaz çıkışınaikinci bir kez daha sonra PDMS tedavisi için izin vermek için 75 ° C'de 1 saat süre ile bir karışım fırında kalan kabarcıklarını çıkarmak için i çanak.
      Not: adım PDMS kalıp deliklerden pim / tüp sokulması üzerine PDMS-cam bağı çok fazla gerginlik eklemekten kaçının yukarıda ~ 7.5 mm PDMS levhanın yeterli kalınlığının korumak veya önemlidir (1.3.3.1)
    3. Bir neşter kullanılarak, dikkatli bir barkod kalıp özellikleri içerir ve gofret slab soyma PDMS levhanın alanı çevresinde kesti.
    4. PDMS barkod kalıbın istenilen şekil elde etmek için döşemenin kenarlarını kırpın. Dalgıç biyopsi yumruk kullanarak kalıp içinden 20 delik (1.0 mm çapında) Punch. Delikler barkod desen dairesel özellikleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu delikler giriş ve çıkışları olarak hizmet vermektedir.
  3. Poli-L-lizin tek boyutlu desen (PLL)
    1. Bir azot darbe silah kullanarak bir poli-L-lizin kaplı cam slayt yüzeyinde türlü tozdan arındırın. Attach temiz bir cam slayt PDMS kalıp. Kalıp ve slayt kenarlar hizalanmış emin olun.
    2. PDMS kalıp ve PLL kaplı slayt arasındaki bağı güçlendirmek için 75 ° C'de 1.5 saat fırında. Bu arada, (0,5 mm'lik bir iç çapa ve 1,5 mm'lik bir dış çapa sahip olan 4-inçlik parçalar halinde 3-), esnek, polietilen boru 20 adet hazırlar.
      Not: boru parçalarının sayısı PDMS barkod kalıpta girişi sayısı karşılık gelir. Boru çift bir basınç regülatörü ile donatılmış bir azot gazı tankına PDMS barkod kalıp kanalları ile hizmet vermektedir.
    3. Borunun her parçasının bir amaçla, paslanmaz çelikten içi boş pim (1 mm çapında) ekleyin. Aspire steril filtrelenmiş borunun en az 1 cm çözeltisi ile dolana kadar, poli-L-lisin iğne yoluyla çözeltisi.
      1. PDMS barkod kalıbın (Şekil 1E) girişlerine (çözelti ile doldurulmuş boru bağlı) işaretçilerini sabitleyin. Borular diğer ucunu iliştirinbir basınç ayarlı azot tankı set-up. Çözelti, en az 6 saat boyunca 0.5-1 psi'lik bir basınç aralığı ile kalıp içinden akmasına izin verir.
        Not: Tüm akış desen prosedürleri için (1.3.3) adımına bakın.
  4. SsDNA 14 Tek boyutlu desen
    Not: daha sonraki kademelerde kullanım fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 137 mM NaCI, 10 mM Na-2 HPO 4, ve 2 mM KH 2 PO 4 tampon, pH 7.4 hazırlanır.
    1. PBS içinde 2 mM bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) çözeltisi hazırlayın. PBS veya aşırı saf su içinde A, B, ve C ssDNA (5'-amin, 80 nükleotid değiştirilmiş) 300 uM solüsyonları hazırlayın.
      Not: N-hidroksisukinimid esteri kolayca hidroliz uğrar çünkü hazırlandıktan sonra yaklaşık 30 dakika içinde BS3 solüsyonu kullanın.
    2. 2 mM bis 2,5 ul (sulfosuccinim 300 uM, B veya C ssDNA 2.5 ul birleştirinHer bir kanal. A, B, ve C, DNA PBS içinde idyl) suberat sırasıyla kanal 1, 2 için belirtilen ve 3 vardır. Bu emir ayrıca 3 kanal (Şekil 2A) kalan setleri uygulanır.
    3. Gerçekleştirmek adım (1.3.3). Bu kez, paslanmaz çelik pimleri ile ve polietilen boru içine 5-ul BS3 / DNA çözümleri aspire, nitrojen kaynağına daha sonra çift PDMS kalıp. BS3 / DNA solüsyonu yaklaşık 40 dakika süreyle veya kanallar dolu saatlere kadar barkod kalıp akmasına izin verin.
    4. Bir kez tüm kanallar doldurulur akış durdurma, daha sonra 2 saat boyunca oda sıcaklığında barkod BS3 / DNA çözeltisi inkübe edin. Çözüm kurumasına izin vermeyin. 75 ° C'de 1 saat süre ile bağlanmış barkod slayt PDMS kalıp Bake.
      Not: sonraki akış desen adımlarla uyumu kolaylaştırmak için, barkod slaytta kanal desen kenarları ana hatlarıyla olabilir. Bu dikkatle elmas Scrib kullanılarak cam yüzeyi çizilmeye yapılıre cam slayt alt hizalama işaretlerini üretmek için. Protokolün sonraki aşamalarında Uyum mikroskop altında kontrol edilebilir.
    5. Barkod slayt PDMS kalıp çıkarın. Aşırı saf su ile bir kez ve SDS üç kez% 0.01 ile hafifçe slayt yıkayın.
      1. Bir mikroskop lamı eğiren kullanarak barkod slayt kurulayın. Daha sonraki kullanım için temiz bir 50-ml santrifüj tüpü içinde barkod slayt saklayın.

Barkod Slide One boyutlu Desen 2. Doğrulama

Not: Bu doğrulama protokolü ayrıca müteakip akış desen adımlarla kalitesini değerlendirmek kullanılmak üzere adapte edilebilir.

  1. Slayt Engelleme
    1. PBS içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. Kullanımdan önce 0,45 um şırınga filtre ile bu çözüm filtre. Bir jel yükleme ucu kullanarak, barkod sürgünün bir kenarına% 1 BSA çözeltisi 50 ul geçerlidir.
    2. % 1 BSA solut inkübeoda sıcaklığında 1 saat için ve iyon.
  2. Siyanin 3 (Cy3) ile enkübasyon, tamamlayıcı DNA ile konjüge edilmiş
    1. Bir ucunda Cy3 konjüge edilmiş bir A kokteyli ', B' ve C 'oligonükleotidleri hazırlayın. 'B' ve C 'A sekansları, sırasıyla A, B, ve C tamamlayıcı niteliktedir. Cy3-DNA çalışma konsantrasyonu,% 0.1 BSA içinde 0,05 uM'dir.
    2. Pipetleme slayt BSA çözüm çıkarın, daha sonra slayt aynı kenarında DNA kokteyl solüsyon 30 ul uygulayın. 1 saat boyunca oda sıcaklığında slayt üzerinde Cy3-DNA kokteyl inkübe edin. Photobleaching Cy3 parçasını korumak için karanlıkta bu kuluçka adımı gerçekleştirin.
  3. Floresans yoğunluğunu analizi
    1. PBS- son olarak Cy3-DNA kokteyl üzerinden pipet ve% 1 BSA PBS slayt yıkayın ve (1 p50 parça saf su ile sanat PBS). Bir eğiren kullanarak slayt kurulayın.
    2. Bir floresan mikroskop veya mikrodizi tarayıcı kullanılarak floresan (Şekil 2B) gözlemleyin. Bir mikrodizi tarayıcı kullanırken, 532 nm, 5 mikron piksel boyutu,% 15 photomultiplier tüp (PMT) 450 de kazanç ve güç lazer emisyon dalga boyu ayarlayın.

2-boyutlu (3x3), DNA Dizisi 14 3. Fabrikasyon

  1. PDMS barkod kalıbının hazırlanması
    1. Başka bir SU-8 ana oluşturmak için prosedür (1.1) gerçekleştirin, ancak bu kez dik ilk tasarım olduğu için bir akış deseni ile krom maske kullanın. Dik deseni ile yeni bir PDMS kalıp oluşturmak için prosedür (1.2) gerçekleştirin.
  2. SsDNA'nın İki boyutlu akış desenlendirme
    1. 3 x 3 dizi için, A'-i B'-ii 150 uM stok çözümleri, C'-iii A'-iv, B'-v, C'-vi, vii A'-B hazırlamak% 3 BSA / PBS '-viii ve C'-ix DNA arasında değişir. Bu oligonükleotidler "köprü diziler" (Şekil 2A) olarak hizmet etmektedir. Oligonükleotid çözümleri (Çözümler 1 ila 3) çalışma konsantrasyonu her bir oligonükleotid için 50 uM olacak şekilde birleştirir. Tablo 1'de verilen kılavuzu kullanın.
    2. 0.5-1 psi 1 saat 20 kanala% 3 BSA / PBS engelleme çözümü Akış.
    3. Akış Solutions 1 sırasıyla 2 ve kanal 1, 2 içine 3 ve 3,. 3 kanal daha sonraki setleri için bu siparişi izleyin. Akış genelde yaklaşık 40 dakika içinde tamamlandı. DNA hibridize izin vermek için 2 saat süre ile oda sıcaklığında DNA çözümleri inkübe edin.
    4. Melezleşmemiş DNA kaldırmak için 0.5-1 psi 1 saat 20 kanala% 3 BSA / PBS engelleme çözümü Akış. PDMS kütüğün soyun ve% 3 BSA içinde cam slayt daldırılarak elde edilen DNA mikro-dizi slayt yıkama / PBS kez ve iki kez PBS ile seyreltilmiş PBS (1 kısım PBS ve 50 parça saf su) eklenmiştir. DBir mikroskop lamı eğiren kullanarak slayt ry.
    5. I Cy3-konjüge edilmiş olduğu 'ila ix' bölümü 2. oligonükleotitlerin bölgesindeki benzer ikinci bir doğrulama adımı (Şekil 2C) uygulayın. Daha sonraki kullanım için bir 50-ml santrifüj tüpü içinde 3 x 3 dizisi slayt saklayın.
      Not: DNA mikrodizi ay için bir kurutucuda oda sıcaklığında saklanabilir.

Bir Antikor Array içine 3 x 3 DNA Array 4. Dönüşüm

  1. Antikor-oligonükleotid (İDEAL) konjugatlarının hazırlanması
    1. 200 mM süksinimidil-4-formilbenzoat (S-4FB) ve susuz N, 40 mM süksinimidil-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic), N-dimetilformamid (DMF) oluşan çözeltiler hazırlayın.
    2. PBS içinde antikorlarla 7 ayrı solüsyonları (1 mg / ml) 'ye kadar hazırlayın.
      Not: Antikor stok solüsyonları sodyum azid bakteriyostatik içeriyorsa, spin tuzsuzlaştırma c kullanarak PBS ile tampon değişimi gerçekleştirmek7 kDa molekül ağırlığı kesmesi (MWCO) ile olumns.
    3. I, 'ii' iii 'iv' v ', vi' ve VII 'DNA ayrı 400 mcM çözüm hazırlayın. Bir oligonükleotid dizisi, her bir yakalama antikoru atama. Mikrosantrifüj tüpler DMF 12.25 ul 400 mcM DNA 40 ul birleştirin ve iyice karıştırın aşağı doğru döndürün.
      1. Her bir DNA / DMF çözeltisine, DMF içinde 200 mM S-4FB 2.3 ul ekle. Yakalama antikor her 100 mikrogram için, DMF 40 mM S-HyNic 2.25 ul ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca antikor / S-HyNic ve DNA / S-4FB çözümler inkübe edin.
    5. Antikor-DNA birleştirme reaksiyonunun hazırlanmasında, pH 6'da sitrat tamponu ile yıkanarak yeni spin tuz giderme sütunlar (her bir antikor için, her bir DNA solüsyonu için bir tane ve bir) hazırlar.
    6. İnkübasyondan 4 saat sonra, her antikor / S-HyNic ve DNA / S-4FB çözümü için tampon değişimi. S-4FB-konjuge birleştirin i 'ii "iii", iv', v ', vi ve antikor-S-HyNic konjugatları ile VII' oligonükleotidleri. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe karışımları.
    7. Reaksiyon O / N 4 ° C'de inkübe edin.
  2. Antikor-oligonükleotid (İDEAL) Konjügatların saflaştırılması
    Not: antikor oligonükleotidlerin saflaştırılması Bir Superose 6 10/300 GL kolonu ile donatılmış standart bir FPLC sistemi üzerinde hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) gerçekleştirmek için.
    1. 280 nm FPLC sistemi UV detektörü dalga boyu ayarlayın. Aşırı S-4FB-DNA'dan antikor oligonükleotidlerin ayırmak için 0.3 ml / dk'da PBS (pH 7.4) izokratik akışını kullanın.
    2. Konjugatı içeren fraksiyonlar havuzu ve 10 kDa'lık bir MWCO filtre kullanılarak spin 150 ul bir hacme kadar fraksiyonlar konsantre edilir.
  3. Antikorların İki boyutlu desen
    1. Microchambers veya mikro-kuyuları bize başka PDMS kalıp hazırlayınadımda ing fabrikasyon işlemleri (1,2). PDMS kalıp bağışıklık için nanoliter kuyu mikrolitre içerebilir.
      Not: akışkan numunelerde genel Biyomarker tespiti için birden fazla kuyu ile bir PDMS kalıp dizi slayt ile birleştirilir. PDMS kalıp özellikleri sistem çalışılan bağlıdır. Örneğin, tek bir hücre deneylerden elde edilen proteinlerin tespiti 0,15-nl hacimli microchambers ihtiva eden bir PDMS kalıp ile gerçekleştirilebilir.
    2. (İsteğe bağlı) desenli yüzey hidrofil kılmak 1.5 dakika plazmaya PDMS kalıp temizleme (18 W) Konu. Önce plazma temizleme, doğrudan 3 x 3 dizi slayt bağlı olan tüm diğer yüzeyleri engellemek için yapışkan bant kullanın.
      Not: Aşama (4.3.2) isteğe bağlıdır, ancak PDMS kalıp, tek bir hücre deneylerinde kullanılmak için düşünülmüştür, genellikle gerçekleştirilir.
    3. 3 x 3 dizi slayt PDMS kalıp Mate, daha sonra PBS içinde% 1 BSA ile bloke slayt. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Meanwhile, antikor oligonükleotid konjügatlarının bir kokteyl (200 ul nihai hacim) hazırlar. Her konjügat çalışma konsantrasyonu 1% BSA / PBS içinde 10 ug / ml 'dir.
    4. Daha sonra bu şekilde bir antikor dizisine bir DNA dizisi, dönüştürme konjugatları oligonükleotid parçası 3 x 3 diziler belirli noktalar ile hibridize izin 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe antikor oligonükleotid kokteyl ekleyin.
    5. Temiz ve slayt kuru adımı tekrarlayın (3.2.4). Antikor dizisi derhal kullanılması durumunda en yüksek hassasiyet elde edilebilir. Uzun süreli depolama hassaslık kaybına neden olabilir.
  4. Proteinlerin tespit edilmesi
    1. Rekombinant proteinleri sulandırmak veya filtrelenmiş hücre örneği hazırlamak.
    2. Özel tasarlanmış yongası ile mikrotertibi Mate ve 1 saat PBS içinde% 3 BSA ile yüzeyi engeller. Daha sonra BSA çözeltisi kaldırmak ve örnekleri uygulamak ve 2 saat süre ile inkübe edilir.
    3. PBS içinde% 3 BSA kullanarak örnekleri yıkayın üç kez birsonra ürün veri sayfasında tarafından sağlanan bir konsantrasyonda tespit antikorlar ekleyin d. 2 saat süreyle inkübe edin.
    4. PBS içinde üç kez% 3 BSA ile saptama antikorları yıkayın ve daha sonra 1 saat boyunca inkübasyon takip 1 ug / ml'de -streptavidin siyanin 5 (Cy5) ekleyin.
    5. Temiz ve tarama için slayt kuru adımı tekrarlayın (3.2.4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PDMS kalıplar (Şekil 1A-1B) için tasarımlar CAD programı (AutoCAD) kullanılarak çizildi. Akış desenlendirme, yatay diğeri dikey için özellik kanalları gösterilen iki tasarımlar. Her tasarımın sol ve sağ parçaları simetriktir; ya onları girişleri veya çıkışları olabilir. 20 kanalın her biri tüm yol diğer ucunda bir ucundan virajlı. Her tasarımın bir krom photomask (Şekil 1C) yazılıdır. Bir gofret fabrikasyon SU-8 ana Şekil 1D gösterilmişt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış desen tasarımı 2-D mikrotertibi imalatı ilk kritik adımdır. Bir cam substrat üzerinde iki çakışan DNA desenleri oluşturmak için, ilk tasarım özellikleri, ikinci kanal (Şekil 1A-B) olan dik olmalıdır. Tasarımları da mikrotertibin aşağı uygulamalarını düşünün. Tek bir hücre analizi durumunda, mikro-dizi, bu nedenle kanal boyutları 2-D dizileri aynı hizaya microchambers uyumlu yapılır microchambers içine tek hücre proteinleri tespit etmek için kullanılır. Her tasarım Fotoşablonlarda ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir rakip çıkarı yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, SUNY Albany'den gelen başlangıç fonuna ve Albany Üniversitesi Kanser Araştırma Merkezi'ndeki tesislere erişim için teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 silikon elastomer tabanDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 silikon elastomer kürleme maddesiDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 fotorezistMicroChemY111069
Silikon gofretler Üniversite Gofretleri452
Poli-L-lizin kaplı cam slaytlarThermo ScientificC40-5257-M20
OligonükleotidlerEntegre DNA Teknolojileri*Integrated DNA Technologies'den özel olarak sipariş edilmiştir, bkz. Tablo 2.
Poli-L-lizin yapıştırıcı stok çözeltisiYeni Gelen Tedarik1339
Bis (sülfosüksinimidil) suberate  (BS3)Thermo Scientific21585
1x Fosfat tamponlu salin, pH 7.4Kalite Biyolojik114-058-101
& AUML; kta Explorer 100 Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) SistemiGE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Superose 6 10/300 GL sütunuGE Healthcare Yaşam Bilimleri17-5172-01
Çeşitli çeşitli antikorları yakalayın*Antikor seçimi uygulamaya bağlıdır
Süksinimidil-6-hidrazino-nikotinamid (S-HyNic)SolulinkS-1002
Süksinimidil-4-formilbenzamid (S-4FB)SolulinkS-1004
N, N< / em>-dimetilformamidSigma-Aldrich227056
Sitrik asit, susuzAcros42356
Sodyum hidroksitFisher ScientificS318
Amicon Ultra spin filtresi 10 kDa MWCOEMD MilliporeUFC201024
Spin kaplayıcıLaurell TechnologiesWS-650-MZ
Pistonlu biyopsi zımbası (1.0 mm çap)Ted Pella, Inc.15110-10
Elmas yazıcı (Stil 60)SPI malzemeleri6004
TrimetilklorosilanSigma Aldrich92361

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Related Articles