Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi İn Vitro

Özet

Mevcut rapor, kemik iliği mikroçevre nişinin lösemik hücreler üzerindeki etkisini, en kemodirençli alt popülasyonun zenginleştirilmesine vurgu yaparak modellemek için kullanılabilecek bir protokolü özetlemektedir.

Özet

Kemik iliği mikroçevresinin, bu bölgede hem başlayan hem de ilerleyen hematopoetik hastalıklar için benzersiz bir sığınak alanı sağladığı iyi bilinmektedir. Mevcut raporda sunulan model, insan primer kemik iliği stromal hücrelerini ve osteoblastları, tümör hücresi fenotipini etkileyen kemik iliği nişinden iki temsili hücre tipi olarak kullanmaktadır. Bu birincil niş bileşenlere sahip insan lösemik hücreleri için tarif edilen in vitro ko-kültür koşulları, çeşitli tekniklerle analiz için kültürden verimli bir şekilde geri kazanılabilen kemorezent bir tümör hücresi alt popülasyonunun oluşumunu destekler. Besin akışlarını önlemek için sıkı bir beslenme programı, ardından jel tip 10 çapraz bağlı dekstran (G10) partikülleri, yapışık kemik iliği stromal hücrelerinin (BMSC) veya osteoblastların (OB) altına göç etmiş tümör hücrelerinin popülasyonunun geri kazanılması, bir "faz dim" (PD) tümör hücresi popülasyonu oluşturur, saflaştırılmış tedaviye dirençli lösemik hücreler için tutarlı bir kaynak sağlar. Klinik olarak anlamlı bu tümör hücresi popülasyonu, apoptotik, metabolik ve hücre döngüsü düzenleyici yolakları araştırmak için standart yöntemlerle değerlendirilebilir ve ayrıca minimal rezidüel hastalığı hedefleyen klinik öncesi araştırmalardan önce yeni terapötik stratejileri test etmek için daha titiz bir hedef sağlar.

Giriş

Açıklanan yöntemin genel amacı, kemoterapiye maruz kalma sırasında lösemik hücrelerin kemik iliği destekli sağkalımının altında yatan mekanizmaların araştırılmasını destekleyen verimli, uygun maliyetli bir in vitro yaklaşım sağlamaktır. Tedaviden sonra devam eden hayatta kalan kalıntı tümör hücrelerinin, genellikle tanı sırasındakinden daha agresif olan ve genellikle daha az etkili bir şekilde tedavi edilen hastalığın nüksetmesine katkıda bulunduğu iyi belgelenmiştir^1-8. Terapötik yaklaşımların test edilmesi için yalnızca ortamdaki hücre kültürüyle sınırlı olanlar gibi izolasyonda lösemik hücreleri içeren modeller, bu kritik sinyalleri veya niş hücrelerle çok spesifik etkileşimlere sahip tümör hücresi alt popülasyonlarının gelişmiş koruma elde ettiği niş türetilmiş ipuçlarının mevcudiyetine yanıt olarak ortaya çıkan hastalığın heterojenliğini hesaba katmaz. Kemik iliğinden türetilmiş stromal hücreleri ve lösemik hücreleri birlikte kültürleyen standart 2D ko-kültür modelleri, kemik iliği nişinin katkısını bir şekilde ele almış ve kemik iliği mikroçevre hücreleri ile etkileşimin kemoterapiye dirençlerini arttırdığını ve büyüme özelliklerini değiştirdiğini göstermiştir^9-14. Bununla birlikte, bu modeller genellikle tümör hücrelerinin uzun süreli sağkalımını özetlemekte başarısız olur ve MRD'ye katkıda bulunan en dirençli lösemik hücre popülasyonları ile ilişkili sonuçları doğru bir şekilde bilgilendirmez. İn vivo modeller kritik olmaya devam etmekte ve klinik çalışmalardan önce yenilikçi tedavilerin araştırılması için "altın standardı" tanımlamaktadır, ancak genellikle dirençli tümörler ve hastalığın nüksetmesi ile ilgili hipotezleri test etmek için gereken zaman ve maliyet ile karşı karşıya kalmaktadırlar. Bu nedenle, daha bilgilendirici 2D modellerin geliştirilmesi, sonraki murin tabanlı klinik öncesi tasarımın tasarımını daha iyi bilgilendirmek için pilot araştırmalar için faydalı olacaktır.

Bu raporda sunulan 2D in vitro model, gerçek in vivo mikroçevrenin karmaşıklığından yoksundur, ancak tümör hücrelerinin kemorezit alt popülasyonunun zenginleşmesine özel olarak katkıda bulunan mikroçevre ile tümör etkileşimlerini sorgulamak için uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir araç sağlar. Bu ayrım değerlidir, çünkü tüm tümör hücresi popülasyonunun değerlendirilmesi, en önemli hedefi oluşturan tedaviye dirençli tümör hücrelerinin küçük bir grubunun fenotipini maskeleyebilir. Ek bir avantaj, modelin ilgi analizine uyacak şekilde ölçeklenebilirliğidir. Tümör hücrelerinin önemli ölçüde geri kazanılmasını gerektiren analizler için toplu kültürler oluşturulabilirken, çok kuyucuklu plakalardaki küçük ölçekli ko-kültürler PCR tabanlı analiz veya mikroskopi tabanlı değerlendirmeler için kullanılabilir.

Bu ihtiyaca dayanarak, B-soy akut lenfoblastik löseminin (ALL) karakteristiği olan hastalığın heterojenliğini ele almak için bir in vitro model geliştirdik. Sağlıklı muadilleriyle birçok ortak özelliği paylaşan ALL hücrelerinin, BMSC veya OB ko-kültürünün farklı bölmelerine lokalize olduğunu gösteriyoruz. Terapötik yanıtın araştırılması için değerli olan farklı fenotiplere sahip üç tümör hücresi popülasyonu üretilir. Spesifik olarak, ko-kültürün "faz dim" (PD) popülasyonundan geri kazanılan (ALL) hücrelerin, sitotoksik ajanlara maruz kalmamış tümör hücrelerine yaklaşan sağkalım ile tedaviye tutarlı bir şekilde dirençli olduğunu gösteriyoruz. Bu ALL hücreleri, yerleşik hücre hatlarından veya birincil hasta örneklerinden, yapışık stromal hücrelerin veya osteoblast katmanlarının altına göç eder, ancak kültürlerin tripsinizasyonu ve jel tip 10 çapraz bağlı dekstran (G10) partikül kolonları¹⁵ kullanılarak hücre tiplerinin ayrılmasının ardından yakalanabilir.

Burada, kemik iliği mikroçevresi, stromal hücreler (BMSC/OB) ve lösemik hücreler arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir 2B ko-kültür kurulumu sunuyoruz. Lösemik hücrelerin stromal hücre tek tabakasına göre üç uzamsal alt popülasyon oluşturduğu ve PD popülasyonunun BMSC veya OB ile etkileşimi nedeniyle kemoterapiye dirençli bir tümör popülasyonunu temsil ettiği gözlemi özellikle önemlidir. Ayrıca, lösemik hücre popülasyonlarının G10 sütunları ile nasıl etkili bir şekilde izole edileceğini gösteriyoruz. Dikkat çekici bir şekilde, bu alt popülasyonların izolasyonunun, kemik iliği mikroçevresi, stromal hücreler veya osteoblastlar ile etkileşimleri nedeniyle bu hücrelere verilen potansiyel direnç modlarını belirlemek için en dirençli PD popülasyonunun aşağı akış analizine izin verdiğini bulduk. Bu ko-kültür ve izolasyon modelinin alt akışında kullandığımız teknikler arasında akış sitometrik değerlendirmesi, proteomik analiz ve hedefe yönelik protein ekspresyon değerlendirmesinin yanı sıra daha yakın zamanda geliştirilen lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyonu (LAESI) ve metabolik profilleri değerlendirmek için Denizatı analizi yer almaktadır. Bu modelin yukarıdaki tekniklerle birlikte kullanılmasıyla, lösemik hücrelerin PD popülasyonunun, yalnızca ortamda kültürlenen lösemik hücrelerle veya aynı ko-kültürdeki diğer alt popülasyonlardan geri kazanılan hücrelerle karşılaştırıldığında benzersiz olan kemoterapiye dirençli bir fenotipe sahip olduğunu bulduk. Bu nedenle, bu model, kemik iliği mikroçevresi ile etkileşim yoluyla dirençli fenotiplerini türeten kemoterapiye dirençli lösemik hücreleri hedef alan stratejileri test etmek için daha titiz bir değerlendirmeye elverişlidir.

Protokol

1. Gelişmiş Hazırlık

1. dekstran G10 parçacıklarının hazırlanması.
   1. 10 g G10 parçacıklarına PBS 1X 50 ml ekleyerek G10 bulamaç hazırlanır. tersine çevirerek karıştırın ve G10 4 ° CO / N fosfat tamponlu salin (PBS) üzerinden yerleşmek için izin verir.
   2. G10 sütun ayrılık günü, yerleşmiş G10 parçacıklar aspirat PBS ve 50 ml taze PBS ekleyin. tersine çevirerek karıştırın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de yerleşmiş G10 parçacıklar ve saklamak için 50 ml taze PBS eklenerek, iki kez tekrarlayın.
2. BMSC ve OB Kültürleme.
   1. % 90 kaynaşma elde edilene kadar% 6 _CO2 ve 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde büyütülmüş, 37 ° C 'de BMSC veya OB hem koruyun.
   2. Yeni 10 cm plakalar üzerine 2: Trypsinize BMSC veya OB hücreleri ve 1 ayrıldı. lösemi ko-kültür için gerekli olana kadar hücreleri bu standartlara göre yetiştirilir.

2. oluşturulması ve Co-kültür bakımı

1. 5-20 ^x 10 6 lösemi hücreleri ekleyin in,% 80-% 90 konfluent BMSC veya OB plakasına tümöre özgü kültür ortamı 10 mi.
   NOT: Lab daha% 1 ila% 7 ^16-18 arasındadır gösterilmiştir kemik iliği mikro-özetlemek için,% 5 _O2, 37 ° C 'de ko-kültürler tutar. Ancak, bu oksijen gerilimi ile ortak kültürlerini koruyarak üç lösemi alt popülasyonlar kurulması için kritik değildir ve laboratuar takdirine bağlıdır.
2. Her ^4. gün (süspansiyon lösemik hücreler de dahil olmak üzere), 1 ml'lik ortam, ancak kaldırmak ve 9 ml taze lösemi kültür ortamı ile değiştirin. plakadan medya 9 ml çıkarırken, BMSC veya OB yapışık katman rahatsız etmemek için dikkatli olun.
   1. plaka köşesinde yan ve aspirat medya plaka eğerek ortamı çıkarın. Taze medya ekleyerek, ayrıca, BMSC veya OB yapışık tabakanın en az kesintiye sağlamak için yan duvar karşı plaka köşesinde damla damla eklemeyi unutmayın.
3. Ko-kültür ^12. günün ardından, yaklaşık 5 ila 10 kat çanak up kültür ortamı ve aşağı pipetleme hafifçe çanak üzerinde tarafından BHYK veya OB katmanından lösemik hücreleri yıkayın ve daha sonra 15 ml konik tüp içinde toplamak. aşama 2.1 'de tarif edildiği gibi, yeni% 80-% 90 konfluent BHYK veya OB plaka üzerine reseed.
   NOT: BMSC veya OB tek tabaka bozmadan S ve PB lösemi hücreleri kaldıracak adım 2.3 açıklandığı gibi ko-kültür yumuşak durulama. Bu, sadece tümör hücreleri aşağıdaki ko-kültür plakasına aktarılır sağlar. Bu 12 gün döngüsü kullanıcı ihtiyaçlarına göre gerektiğinde kadar birçok kez tekrar edilebilir.

3. Hazırlanması G10 Boncuk Sütunlar

NOT: Steril aşağı analiz veya kültür G10 sütun ayrılması aşağıdaki gerekiyorsa aşağıdaki adımlar steril tekniği kullanılarak yapılmalıdır ve G10 sütunları steril biyolojik kaputu kurulum olmalıdır.

1. Ön-WARM hücre kültür ortamı, su banyosu içinde 37 ° C (~ 30 mi kolon başına). 10 ml'lik tek kullanımlık şırınga kullanarak, kaldırmak ve pistonu atın. şırınga, cam yünü ekleyin.
2. cımbız kullanarak, ince gevşek ipliklerini içine cam yünü dışında çekin. Şırınga 2/3 cam yünü ile dolana kadar şırınga hafifçe dolu cam yünü çoklu katmanlar ekleyin.
   NOT: cam yünü lösemik hücre toplama kirletmesini gevşek G10 partikülleri önlemek için çok önemlidir. Emin cam yünü G10 parçacıkları desteklemek için yeterli dolu, ama çok yoğun sütun aracılığıyla medya akışını engellemek için dolu değil emin olun.
3. kapalı konumda bir şırınganın ucu 1 yollu valf ekleyin.
4. halkaya Kelepçe şırınga sütunu yani 50 ml konik tüp (toplama tüp) musluk altına yerleştirilebilir yeterince yüksek duruyor. şırınga sütununda toplama tüpü yerleştirin.
5. 10 ml'lik bir pipet üstünde sütun PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, G10 parçacıkları ekleme damla damla kullanılmasıcam yünü. cam yünü üzerine G10 partikülleri form (şırınga mezuniyet ile ölçülen) bir p 2 mi pelet kadar G10 parçacıklarının eklenmesi devam edin.
6. önceden ısıtılmış medya ile G10 sütun dengeye.
   1. sütununa önceden ısıtılmış ortam 2 ml ilave edilir. Bu kadar açık musluk vana yavaş medya damla damla sütunun dışarı akar.
   2. önceden ısıtılmış ortam 10 ml'lik bir toplam kadar adımı tekrar 3.6.1 sütun karşılaşıncaya edilmiştir.
      Not: G10 partikülleri toplama tüpü boyunca akış görülen ya 1) + G10 parçacıklarının eklenmesi durumunda ek bir G10 taneciklerinin kolona kaçmasına emin ~ 2 mi pelet korumak ya da 2) kullanılmayan bir ve tekrar ile sütun yerine 3.4-3.6.1 adımları.
   3. sütunundan önceden ısıtılmış medya tahliye ettikten sonra, stopcock kapatın ve içinden akışı ile toplama tüpü atın. sütununda yeni koleksiyonu tüp ekleyin. Kolon ortamı + hücre karışımı ile yüklenebilir hazırdır.
      NOT: Kolonlarhemen kullanılmıştır ve kurumaya izin verilmelidir.

4. Co-kültür içinde 3 alt popülasyonlar ayırmak

1. Süspansiyon (S) tümör ICSI'nin toplanması.
   1. ko-kültür plaka aspire medya pipet ile ve yavaşça plaka yıkayın ve bir 15 ml konik tüp lösemi hücreleri içeren medya toplamak için aynı medya uygulamak yeniden. Toplanan lösemili hücreler S ICSI'nin vardır.
2. Faz Parlak (PB) tümör ICSI'nin toplanması.
   1. ko-kültür plaka üzerine geri 10 ml taze medya ekleyin. yapışık lösemi hücreleri ancak yapışık BMSC / OB bileşeni çıkarmak için yeterince sert değil kaldırmak için yukarı ve aşağı yaklaşık 5 kat eklendi medya pipetleme kuvvetlice çalkalayın.
   2. pipet ile aspire ve 15 ml konik tüp medya toplamak. Toplanan hücreler PB ICSI'nin vardır.
3. Faz Dim (PD) tümör ICSI'nin toplanması.
   1. rem 1 ml PBS ile durulayın plakaove kalan ortam. 5 dakika için 37 ° C inkübatör içine 3 mi tripsin ve yeri ile tripsinize ko-kültür plakası.
   2. yapışık BMSC / OB çıkarmak için plakanın kenarlarına dokunun yavaşça inkübatör dışına plakasını çıkarın ve.
   3. dışında büyük hücre agrega kırmak için 1 ml fetal sığır serumu (FBS) ve pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez ekleyin.
   4. 15 ml konik tüp hücrelerin medyayı toplayın. Bu hücreler de BMSC / OB ile arıtılmamış PD ICSI'nin vardır.
4. Santrifüj 3 7 dakika boyunca 400 x g'de subpopülasyonunun izole edilmiştir. Aspire ve atın yüzer madde daha sonra tek tek 1 ml önceden ısıtılmış medya pelet tekrar süspansiyon. Hücreler G10 kolona yüklendi hazırdır.

G10 Sütun üzerine 5. Yükleme Co-kültür Hücreleri

NOT: Emin stopcock olun tamamen G10 sütun medya içeren hücreleri eklemeden önce kapatılır. Ayrıca, her subpopülasyonu introduc öyle değil ayrı bir G10 kolonu üzerinde koştu olmalıdıraşağı analizde nüfus arasında herhangi bir önyargı e.

1. 1.000 ul pipet kullanarak, damla damla ayrı bir G10 sütuna önceden ısıtılmış medya her hücre alt populasyonun 1 ml ekleyin. hücreleri içeren medya üstünde veya G10 pelet içinde kalmasını sağlamak. Hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca G10 pelet üzerinde inkübe izin verin.
   NOT: musluğu inkübasyon süresince kapalı kalır.

6. G10 Sütun lösemik hücreler Toplama

1. Her G10 sütun 1-3 ml önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Açık musluk vana ve medya yavaş yavaş kolon damla damla çıkmak için izin verir.
   NOT: sütun veya sütun yıkayın ve izole lösemi hücreleri kirletebilir BMSC / OB içeren G10 pelet yavaş akış hızını korumak için çok önemlidir.
2. 15 ila 20 ml arasında bir toplam kadar G10 kolonuna küçük artışlarla (1-2 mL) içinde önceden ısıtılmış ortam eklemeye devam sütun içinden geçen ve elde edilmiştir. Yakın musluk valve ve kapak toplama tüpü.
   NOT: Bir G10 parçacık pelet toplama tüpün dibinde görülürse, yavaşça G10 parçacık pelet rahatsız ve yeni bir tüpe transfer bırakarak tüpten ortamı çıkarın.
3. Santrifüj oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 400 x g'de medyayı topladı. Süpernatantı ve alt uygulama için uygun tampon hücre pelletini.
4. Hücreler artık BHYK veya OB kirlenme serbest lösemi hücrelerinin saf nüfus ve kullanıcı takdirine aşağı uygulamalara uygulanacak hazırız.
   NOT: G10 sütunlar aracılığıyla hücrelere geçerken lösemi hücre canlılığı değişmeden kalmalıdır.

Sonuçlar

Bu ko-kültür modeli Başarılı kurulum ve kültür. Yapışık BMSC veya OB tek tabaka göre lösemik hücrelerin 3 alt popülasyonlarının kurulması neden 1 BMSC tek tabaka içine numaralı seribaşı ALL hücreleri başlangıçta askıya olarak yalnızca tek bir nüfusa nasıl görüneceği göstermektedir olacak lösemi hücreleri. lösemik hücreler lösemi hücrelerinin 3 mekansal alt-popülasyonunu oluşturulması için BHYK etkileşime 4 gün boyunca ((süspansiyon s), faz parlak (PB), v...

Tartışma

Hastalığın nüks katkıda minimal rezidüel hastalık (MRD) HEPSİ agresif refrakter tedavisinde önemli bir klinik sorundur, yanı sıra, diğer hematolojik maligniteler bir ev sahibi olmaya devam ediyor. Kemik iliği mikro TÜM ^3,8 nüks en sık sitedir. Bu nedenle, kemik iliği mikro modeli modelleri kemoterapi maruziyeti sırasında lösemili tümör hücre canlılığı ve MRD bakımı ile ilgili hipotezleri test etmek için hayati araçlardır. fare modelleri uyuşturucu etkinliği ile ilgili test soruları için altın standart tanımla...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
G10 sephadex boncuk	Sigma	G10120	El yazmasında jel tipi 10 çapraz bağlı dekstran parçacıkları
10 ml steril şırınga	BD	309604
Cam yünü	Pyrex	3950
1 musluklar	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml konik santrifüj tüpleri	Dünya Çapında Tıbbi Ürünler	41021039	Toplama tüpü olarak kullanılır
15 ml konik santrifüj tüpleri	Dünya Çapında Tıbbi Ürünler	41021037	Hücre toplama için kullanılır
Fetal Sığır	Serumu Sigma	F6178
%0.05 Tripsin	Medya Teknolojisi, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Hücre Kültürü Kapları	Greiner Bio-One	664160
Kültür ortamı
osteoblast kültür ortamı	PromoCell	C-27001	İnsan osteoblast ortamı için
RPMI 1640 medya	Mediatech, Inc.	15-040	Tümör besiyeri hazırlığı için
Hücre hatları< / güçlü >
< güçlü > Bağlı Hücreler: < / güçlü >
İnsan Osteoblastları	PromoCell	C-12720	İnsan osteoblastı tedarikçiye göre kültürlendi s önerileri.
İnsan Kemik Morrow Stromal Hücreleri	WVU Biyonumune Çekirdeği		Tanımlanmamış birincil insan lösemisi ve kemik iliği stromal hücreleri (BMSC), Mary Babb Randolph Kanser Merkezi (MBRCC) Biyonumune İşleme Çekirdeği ve West Virginia Üniversitesi Patoloji Bölümü Doku Bankası tarafından sağlandı. BMSC kültürleri daha önce tarif edildiği gibi kuruldu (*)
Lösemik Hücreler:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH hücreleri tedarikçinin s önerileri ve önerilen medya.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1, tedarikçinin özelliklerine göre kültürlendi. s önerileri ve önerilen medya.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Kemik iliği stromal hücre fonksiyonunun etoposid tarafından bozulması. Biol Kan İliği Nakli J Soc Kan İliği Nakli. 1997 Ağustos; 3(3):122–32.