Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

Summary

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Abstract

Bu protokol, bir yöntem olup sayısal gerçekleştirmek için sunulur, yerinde tek hücre hattı özellikleri çalışma protein ekspresyonu analizi Fare preimplantasyon embriyolarında. Embriyo toplama, immünofloresans, bir konfokal mikroskop görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ve analiz için gerekli işlemler anlatılmaktadır. Bu yöntem, çoklu nükleer belirteçler ifade ve mekansal (XYZ) ve niceleme embriyo tüm hücrelerin koordinatları verir. Bu DAKİKA, özellikle preimplantasyon embriyo ve embriyonik kök hücre (ESC) kolonilerin konfokal görüntülerin analizi için geliştirilmiş bir görüntü bölütleme yazılım aracı yararlanır. MINS X, Y ve Z boyutları arasında denetimsiz nükleer segmentasyonu yürütmektedir ve az kullanıcı girişi ile tüm kanallar için üç boyutlu uzayda hücre konumuna ilişkin bilgiler, yanı sıra nükleer floresan seviyeleri üretir. Bu protokol, görüntü analizi için optimize edilmiş olsa dapreimplantasyon sahne fare embriyoları, kolayca iyi bir sinyal-gürültü oranı ve nerede yüksek nükleer yoğunluk (görüntü segmentasyonu bir engel teşkil örn., embriyonik kök hücre ifade analizini gösteren başka örneklerin analizi (ESC adapte edilebilir ) koloniler, kültür hücreleri, diğer türleri veya aşamaları, vb) arasında embriyolar ayırt.

Introduction

Fare preimplantasyon embriyo hücresi kaderi tarifnamede ve memelilerde de-novo epitelizasyonu çalışma için ortaya çıkışı ve in vivo pluripotensin idamesinde, hem de bir model çalışma için bir örnektir. ve iki extraembryonic soy, trofoektoderm (TE) ve - en somatik doku ve germ hücreleri yol açmaktadır - memeli gelişim preimplantasyon aşamaları blastosist, yani pluripotent epiblast oluşturan üç hücre soylarının kurulması için varız ilkel endoderm (PrE) (Şekil 1A) ^1,2. Bu protokol, (2), ilgilenilen proteinleri etiket immünofloresan gerçekleştirmek (3) z-kesit yetenekleri ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme monte tam yürütmek (1) hasat ve düzeltmek preimplantasyon sahne fare embriyoları prosedürleri açıklamaktadır (4) konfokal görüntüleri ve sonraki kantitatif görüntü analizleri nükleer segmentasyon gerçekleştirin. Bu boru hattı t veriyorO yerinde hücrelerin subpopülasyonunun karakterize hücre kimliklerin atama için protein düzeylerinin ölçülmesi tarafsız. Veri analizi (Şekil 1B) embriyo toplama, (genellikle 10 fare embriyoları kadar) tek bir çöp için 4 gün - Bu protokol az 3 olarak yapılabilir. Birkaç litre eşzamanlı analizi böylelikle protokol genel uzunluğu boyunca uzanan, görüntüleme ve veri analizi zaman yükünü artıracaktır.

Preimplantasyon sahne fare embriyosu kendi küçük boyutlu ve basmakalıp morfoloji ³ verilen tek hücreli çözünürlüğe sahip hücresel süreçlerin toto görüntüleme için çok uygundur, bir deneysel uysal bir sistemdir. Embriyoların istatistiksel ilgili sayısının tarafsız, sistem düzeyinde analiz yürütmek için, otomatik, kantitatif analiz boru hattı arzu edilir. Ancak, iç hücre kütlesinden yüksek nükleer yoğunluk blastosist (ICM) nedeniyle ( Şekil 1A, 2B), geleneksel görüntü bölümleme platformları otomatik veya yarı otomatik iş akışı oluşturmak için yeterli doğruluk sağlamak için başarısız. Öte yandan, manuel segmentasyon, doğru ise, hücrelerin ve embriyoların büyük kohort işleme izin vermez, ne de hücre kimliklerin bir tekrarlanabilir, tarafsız tayini için uygundur - gelişim aşamalarını inceleyerek özellikle önemli olduğu marker desenleri ifadesi tamamen (örneğin, nüfusu karşısında ikili bir dağılım göstermezler) çözülmüş değil. En az kullanıcı girişi ^4-8 gerektiren Biz son zamanlarda, fare preimplantasyon sahne embriyolar için ve yüksek doğruluk elde fare embriyonik kök hücreleri (EKH) için özel bir görüntü segmentasyonu yöntem geliştirdi ve onaylamıştır.

Burada sunulan analiz boru hattı MATLAB tabanlı görüntü bölütleme aracı Modüler İnteraktif Nükleer segmentasyon (DAK) ⁴ etrafında döner. MINS pKullanıcı bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) (Tablo 1) ⁴ kullanılarak, görüntü özellikleri az sayıda kurmuştur sonra konfokal Z-yığınlarının büyük gruplar üzerinde denetimsiz nükleer segmentasyon erforms. Bu boru hattı, hem vahşi tip protein ekspresyonu ve hücre lokalizasyonu yüksek kapasiteli veri üretimi için verimli olduğu kanıtlanmıştır, deneysel tedavi ve genetik embriyolar ve EKH ^5-7 güncellenmiştir. Mevcut protokol, preimplantasyon aşamalı embriyo görüntüleri segmentasyonuna DAKİKA uygulanmasını açıklar. EKH üzerinde MINS performans örnekleri için ^4,7 bakınız. Otomatik nükleer segmentasyon adım ölçüde, mekansal ve floresan yoğunluğu ölçümleri embriyoda hücre kimliklerin tarafsız bir kararlılık ve gen ifadesi etki ve hücre pozisyonunun üç boyutlu haritalarının oluşturulmasına izin oysa (Şekil hücre tanımlaması sürecinin zaman yükünü azaltır 1C ). Dahası, bu iş akışının ölçeklenebilirlik deneysel tedavi embriyolar ya da farklı genetik geçmişleri ^5,6 embriyoların büyük kohortlar aracılığıyla bireysel litre analizine de uygulanabilir hale getirir. DAK (yazılım MATLAB lisans gerektirir) http://katlab-tools.org de serbestçe kullanılabilir.

Bugüne kadar geliştirilen hiçbir yaklaşım fare preimplantasyon embriyolar protein ekspresyonu ve hücre lokalizasyonu gibi derinlemesine veri üretimi sağlar. Tüm girişimleri bugüne kadar bu tür verileri miktarının manuel belirlenmesi ve farklı popülasyonlar için hücre sayıları kantitatif embriyoda (ya tamamen elle veya yazılım destekli) ^9-19 sınırlı olmuştur. (DAK yazılımını içeren) Bu yaklaşım için özel ve fare preimplantasyon embriyoları ve EKH üzerinde test edilmiştir; yine yüksek nükleer yoğunluklu diğer sistemlerde performansı, henüz denenmemiş olsa da, eşdeğer olması bekleniyor.

Protocol

Etik deyimi: Tüm hayvan çalışmaları, hayvancılık, damızlık ve kurban olmak üzere Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), protokol # 03-12-017 tarafından onaylandı.

1. Embriyo Koleksiyon

Tüm hayvan çalışmaları, kurumsal ve yerel otoriteler tarafından onaylanmış olması gerekir ve yerel ve kurumsal kurallarına uygun Not:.

1. İstenilen genotip verimli bir damızlık erkek ile bir bakire kadın fare Mate.
   Not: estral döngünün östrus fazında kadın seçerek, doğal çiftleşmesi kurma istenen tarihte çiftleşme şansını artırır. Superovulasyon uyaran olursa, ^20'de tarif edilen protokollere başvurun.
2. künt prob kullanılarak sabah vajinal fiş varlığını kontrol edin. copulation fişleri gün boyunca kayıp İdeal olarak, öğlen (12:00) önce bunu. noo düşününVajinal fişi embriyonik gün (E) 0,5 tespiti n.
3. İstenilen gün ve embriyonik gelişim zamanına, M2 veya RT'ye yıkama tutan orta (FHM) veya tercihen 37 ºC ısıtın. Not: her iki M2 veya FHM yıkama ve taşıma embriyolar için kullanılabilir. Kullanılmadığı zaman, 4 ° C'de bu medyayı saklamayın. Her bir uterusa için ortamın yaklaşık 2 ml kullanımını tahmin.
4. Çözülme dondurulmuş% 4 paraformaldehit (PFA), fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da taze solüsyon hazırlanır. 4-iyi levha başına% 4 PFA çözeltisi 500 ul tahmin. 4 oyuklu plakanın her bir ilgili bir çöp düzeltildi. Not: Alternatif olarak, 96 oyuklu bir plaka düzeltmek ve saklamak embriyolar için kullanılabilir. 96 oyuklu bir plaka kullanılması durumunda, 100 PFA çözeltisi ul oyuk başına kullanımı.
5. ucundaki kılcal ucunu çizmek için açık alev kullanılarak cam Pasteur pipeti çekin.
6. Yerel ve kurumsal düzenlemelerin gerektirdiği, ya da servikal dislokasyon veya CO ₂ inhalasyon yoluyla kadın Kurban. Genellikle desirabl olduğue servikal dislokasyon ile hayvan ötenazi onaylayın.
7. saç dökülmesi en aza indirmek ve iç organları ortaya çıkarmak için, ilk deri yoluyla ve daha sonra gövde duvarı (periton) üzerinden, karın bölgesi gerçekleştirmek için% 70 etanol ile hayvanın karın püskürtün.
   Not: Aşağıdaki adımlar E3.25 ve E4.5 (Şekil 1A) arasında herhangi bir aşamada hamile bir kadın fare rahim blastokistlerle toplamak için prosedürü açıklar. Daha önce E3.25 daha preimplantasyon embriyoların toplanması ile ilgili protokoller için, ²⁰ bakın.
8. rahim bulun ve hayvan kaldırmak. Forseps bir çift ile uterusun servikal ucunu tutarak, serviks kesti ve her ikisi de rahim boynuzları germek için yavaşça yukarı çekin.
9. rahim duvarına delmek için özen rahim yağ Trim. hala hayvanın vücuduna bağlıyken rahim uzanmış olabilir gibi bu, kaldırma sırasında kolayca yapılabilir. Alternatif olarak, buRT PBS içinde, bir teşhir mikroskopu altında, daha sonra yapılabilir. Rahim diseksiyon konusunda daha ayrıntılı bir protokol için, bkz Protokolleri 5 ve 8 ²⁰
10. yumurta kanalı üzerinde kes, yumurtalıkların altında, bir petri üzerindeki tüm rahim, yer bırakmak için ve PBS ile kaplayın.
    Not: Bu adım aynı zamanda sonraki blastosist hasat kolaylaştırır rahim, aşırı kan veya diğer enkaz yıkama imkanı sunuyor.
11. serviksin her iki tarafta, proksimal sonuna kadar kesme ve serviks atmak tarafından ayrı hem de rahim boynuzları. Onları (Şekil 1A) bağlayan berzah altında keserek rahim her yumurtalık ayırın. Embriyo toplama ve manipülasyon için manipülasyon ortamı (M2 veya FHM ya) bir damla her iki boynuzları aktarın.
12. Diseksiyon mikroskobu altında, rahim dışına ve 0.5 zorlayarak ortama gömme blastosist - servikal açıklık her uterin boynuz aracılığıyla M2 veya FHM 1 ml. Bir 1 kullanınBir hipodermal iğne ile ml'lik şırınga. Not: Bu kritik olmamasına rağmen iğne, uterus yırtılmasını önlemek için bir dosyalama taş kullanılarak körelmiş olabilir. Rahim yıkama için ayrıntılı bir şema ²¹ bulunabilir.
13. orta damla dağılmış olacak blastokistlerle bulun, diseksiyon mikroskobu kullanarak. blastosist kızarma sonra çanak dibine çöker için 2 dk - 1'e kadar bekleyin. Bir kılcal ucu ile ağız kontrollü, cam Pasteur pipeti kullanarak, tüm blastokist toplamak ve medya taze damlasına kadar aktarın.
14. Taze M2 veya FHM 3 damla - 2 ile taşıyarak blastokistlerle durulayın. Bir seferde 10 blastosist - 5 gruplar halinde embriyolar taşıyın.
    Not: sürecini hızlandırır herhangi bir zamanda büyük gruplar Hareketli, ama aynı zamanda yanlışlıkla birçok embriyolar kaybetme şansını artıracaktır. Embriyo manipülasyon ve transferi pratik, ağız kontrollü pipetler kullanımında eğitimsiz eğer b önce dikkate alınması gerekenDenemeyi eginning.
15. kısaca asitli Tyrode çözüm onları yıkayarak çıkmamış blastokist Zona pellucida (ZP) (genellikle
16. Köreltilmiş blastosist işlerken onlar cam ve plastik yüzeylere çok kolay yapışır gibi özen gösterin. Manipülasyon orta eki önlemek için sığır serum albümin (BSA) 4 mg / ml içerir, ancak asit Tyrode ya da PBS do Dolayısıyla, hasar veya embriyoların kaybı riskini azaltmak için en fazla 2 pick up yok değil - 5 soyulmuş blastokistlerle Aynı anda BSA içermeyen veya serumsuz PBS veya asit Tyrode bunları işlenirken.
    Not: Alternatif olarak, kaplama, kullanımdan önce,% 1 BSA ile bir cam pipet cam yüzeyine embriyo yapışmayı azaltmak için.

Coat her bir alt% 1 agar ince bir tabaka ile, bir 4-yuvalı doku kültürü çanağı içinde,% 0.9 NaCI plastik yapışmasını embriyolar önlemek için. Alternatif olarak, 4 mg / PBS (PBS-BSA) BSA'nın ilave edin.

RT, PBS (ya da PBS-BSA) 500 ul ile kaplanmış 4-yuvalı doku kültürü çanağı bir kuyu ve PBS içinde% 4 PFA bir kuyu 500 ul doldurun.

RT PBS blastosistler durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 PFA düzeltin. tespit sonrasında PBS (veya PBS-BSA) aktarın.

Embriyolar hemen işleme olacak değilseniz, (örneğin kurumasına yol açar) buharlaşmasını önlemek ve 4 ºC de plaka saklamak için mineral yağ tabakası ile embriyoları içeren PBS kapsamaktadır.
Not: farklı tespit yöntemleri ve katı deneye bağlı olarak kullanılabilmektedir, ilgi konusu epitopları ve antikorlar kullanılır. eşdeğer deneyler boyama sonuçlarının sonraki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için boyunca seçim Hangi yöntemi tutarlı olmak.
Not: Pausenoktası: Embriyolar bir sonraki aşamaya geçmeden önce, birkaç hafta kadar PBS içinde 4 ° C'de saklanabilir. PBS, steril olduğundan emin olun ve / veya 100 U / ml ekleyin penisilin + 100 ug / ml streptomisin (LTR yükseltici) durumunda (PBS-BSA kullanılarak özellikle) bakteriyel kontaminasyonu önlemek depolama uzun süreli görerek eğer.

2. İmmünofloresan

1. önceden test edilmesi ve tüm montaj imüno sağlam olduğu kanıtlanmıştır herhangi bir protokol kullanılarak immünofloresans gerçekleştirin. Not: ^{22 ve 11'de} tarif edilenler önerilir. Bu yazıda eski tarif edilecektir. eşdeğer deneyler boyama sonuçlarının karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için boyunca seçim Hangi yöntemi tutarlı olmak.
2. immünofloresan protokol ardışık aşamaları gerçekleştirmek için, esnek, polivinilasetat, berrak, U tabanlı, 96 oyuklu plaka kullanınız. 50 ile her iyi doldurun - çözümün 100 ul ve bir çözüm embriyolar taşıyınBir L şeklindeki ağız pipet kullanarak başka. Bu yaklaşım reaktiflerin kullanımını en aza indirir ve izleme adımları yanı sıra çok sayıda deney grupları paralel boyama kolaylaştırır unutmayın.
   1. İsteğe Bağlı: Kat% 1 agar ince bir tabaka ile kuyu alt% 0.9 NaCI plastik embriyo yapışmasını önler. immünfloresans çözümleri BSA katmayın.
3. PBX (PBS içinde% 0.1 Triton X-100) hazırlanması. Birkaç immünofloresan deneyleri performansını tahmin ederse, deneyler arasında 4 ºC de PBX ve mağaza 50 ml hazırlamak.
4. permeabilizasyon çözeltisi (% 0.5 Triton X-100, PBS içinde 100 mM glisin) hazırlayın. 1 ml (ya da hangisi tutar gerekli) her bir deney için taze permeabilization solüsyonu olun.
5. bloke etme çözeltisi (% 2 at serumu (HS) ve% 20 fetal bovin serumu, PBS içinde Pen-Strep (FBS)) hazırlayın. deneyler arasında 4 ° C'de 10 ml ve mağaza hazırlayın.
   1. Herhangi bir fark arasındaki gözlenmiştir yaSerum türü, ancak, eş deneyler için kullanılan çözelti bloke seçiminde tutarlı.
6. PBX oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (~ 100 | il) için sabit embriyolar yıkayın.
7. permeabilizasyon çözeltisi içinde, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (~ 100 | il) için embriyolar geçirgenliği.
8. PBX oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (~ 100 | il) için embriyolar yıkayın.
9. bloklama çözeltisi ~ 100 ul 30 dakika oda sıcaklığında HR 1 için blok embriyolar. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
   Not: Embriyolar O kadar / fark iyileştirme veya zarar vermeden 4 ° C'de N dönemleri 30 dakika bloke adımlara kıyasla için bloke edilebilir.
10. primer antikor 4 ° C'de embriyolar O / N inkübe / antikorlar çözeltisi (~ 100 ul) engelleme seyreltilmiş. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
    1. daha önce her birincil antikor için optimum seyreltme oranını belirler. d BkzAntikorların, bir dizi test dilüsyonları için iscussion ve Malzeme bölümü.
11. O / N inkübasyondan sonra, embriyolar PBX oda sıcaklığında her biri 5 dakika (~ 100 | il) için 3 kere yıkayın.
12. bloklama çözeltisi ~ 100 ul 30 dakika oda sıcaklığında HR 1 için blok embriyolar. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
13. bloklama çözeltisi ~ 100 ul 4 ug / ml'de seyreltilmiş ikincil antikor / antikorlar 4 ° C'de 1 saat ila 2 embriyolar inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
14. Durulayın embriyolar PBX oda sıcaklığında her 5 dakika boyunca 2x.
15. Tercih DNA leke embriyolar taşıyın. Hoechst 33342 kullanılıyorsa, PBS içinde 5 ug / ml'ye seyreltin. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
    Not: noktasını Pause: embriyolar hemen görüntülü değilseniz, onlar u tutulabilirNükleer boyama çözeltisi içinde birkaç hafta s. Bu durumda, PBS, steril sağlamak ve / veya bakteri gelişimini ve kirlenmeyi önlemek için Pen-Strep ve sodyum azid ilave edin.

3. Konfokal Görüntüleme

Not: Bireysel konfokal mikroskop yapılandırmaları yerinde sistem ve yazılım için ayarlanabilir özel toplama parametreleri gerektirir. Ancak, aşağıdaki bölümde verilen herhangi bir kurulum için geçerli olmalıdır takip etmek, genel kurallar kümesi sağlar.

1. ince bir ağız pipet kullanarak, PBS veya 35mm cam alt çanak cam yüzeyinde nükleer leke çözümün mikrodamla yapmak ve madeni yağ ile kaplayın. Bir alternatif olarak, embriyolar zarar görmesini önlemek ve bir cam mikroskop slayt ile karşılamak için silikon ayırıcı ile normal bir lamel kullanın. Not: Normal lamel kullanırken, embriyolar daha sonra yeniden konumlandırılmış veya genotipleme için geri alınamaz, bu nedenle şiddetle cam alt kullanımını tavsiyeyemekler.
2. Yeri mikrodamla embriyolar ve tercihen cam yüzeyine ICM-kavite eksenine paralel, tutarlı bir şekilde düzenlemek. mikroskop tutucu çanak ayarlayın. Not: lazer tarama konfokal mikroskoplar elde Görüntüler floresan yoğunluğu bir Z ekseni ilişkili kaybı muzdarip. Bu nedenle düzenleme, tutarlılık farklı embriyo eş bölgeler arasındaki yoğunluklarının karşılaştırılması için önemlidir.
3. gen ifadesini değiştirebilir tedavi herhangi bir tür tabi olmamıştır vahşi tip embriyolar kullanılarak referans parametrelerini ayarlayın.
   1. MINS aracını ^{kullanarak 4} doğru segmentasyon kolaylaştıracak verileri elde etmek amacıyla yüksek büyütmeli objektif (yani, 40X veya üstü) kullanarak görüntüleri elde edin.
      Not: Dk kullanarak segmentasyon için yeterli çözünürlüğe kadar görüntü vermeyecektir 20X objektif dijital zoom özelliğinin kullanılması. Olması gerektiği gibi bir de, amacın çalışma mesafesi (WD) dikkat etmelisiniztüm blastosist yayılan bir Z-yığını böylece uzun bir WD edinilmesine imkan sağlayacak şekilde yeterli (~ 130-150 mikron) amacı genellikle gereklidir. Şekil 2'de gösterilen görüntüler - 4 210 mikron çalışma mesafesi ile 40X / NA 1.30 immersiyon yağı hedefi kullanılarak elde edildi.
   2. fluorophores ağartma olmadan güçlü bir sinyal-noyz oranı temin düşük lazer çıkışını kullanın.
   3. kazanç ayarlayın ve örnek boğulmadan geniş dinamik aralık elde etmek ofset. görüntüleri açığa en karşılamak ya da tüm gri skala aralık görüntüleri arasında yoğunluk küçük farklılıkların tespiti kolaylaştıracaktır span.
   4. Z ekseni çözünürlükte DAKİKA ile doğru segmentasyon için kritik olduğundan, küçük bir (1 mikron) Z-adım kullanın.
      Not: XY boyutları nükleer segmentasyon işlemi, sadece görüntü dosya boyutunu etkilemez. Genellikle, 512 x 512 piksel compromi olmadan yayın kalitesinde görüntüler için yeterli bir XY çözünürlüksabit disk alanı şarkı.
   5. Kritik adım: örnekleri karşılaştırmak mümkün olacak şekilde içinde ve aynı deney görüntüleme oturumları tutarlı parametreleri görüntüleme tutun.
4. Embriyoların toplu Görüntüleme:
   1. tek seansta görüntü tutarlı gruplar (ibrelerin, deneyler) mümkün olduğunca.
   2. Aynı deney çoğaltır için içinde ve görüntüleme oturumları tutarlı parametreleri tutun.
   3. (Tüm Z eksenine) boyunca görüntü embriyolar her hücreyi yakalamak için.
      Not: İstenirse ²³ de tarif edildiği gibi, embriyo genotipleme görüntüleme sonra yapılabilir. içiçe geçmiş PCR için ihtiyaç ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir ve analiz edilecek yeri ve kullanılan primerler bağlıdır.
5. geriye dönük görüntüleri embriyolar maç muktedir emin olun.

4. Görüntü Analizi ve Veri Ön işleme

1. Yükleme ve http dakika ⁴ yükleyin: // Katlab-tools.org (MATLAB lisans gereklidir).
2. görüntü bölümleme gerçekleştirin:
   1. Konfokal resim yüklemek veya sabit diskten yığını, çekirdekler ve segmenti görüntüsünü tespit DAKİKA grafik kullanıcı arayüzü (GUI) izleyin. Mikroskobu (.lsm, .lif, .oif, vs.) tarafından üretilen ham verilerin tamamı Z-yığını yükleyin. Http://katlab-tools.org ^ve 4 üzerinde bulunan her adımda ilgili ayrıntılar ve talimatlar için Tablo 2'ye bakınız. Tamamlandığında, karşılık gelen 'Görünüm' butonuna tıklayarak her adımın sonucunu görmek. düğmesinin üzerinde sarı etiket yeşil etiket işlemi tamamlandıktan gösterir süreçte işlemi gösterir.
      Not: MINS halen dizileri ya da multi-pozisyon dosyaları .tiff, .czi dosyalarını desteklemez - her Z-yığını bağımsız bir dosya olması gerekir.
   2. tatmin edici bir segmentasyon sonra, diğer embriyolar veya litre için direkt olarak kullanılabilir, böylece oluşturulan boru hattı kaydedin.
3. Toplu Modu segmentasyon:
   Not: Single dosyaları tek tek segmentlere edilebilir. Ancak, çöp veya deney içinde embriyolar genellikle karşılaştırılabilir aşamanın olduğu göz önüne alındığında, DAK gözetimi olmaksızın onlardan bir grup tek bir görüntü için oluşturulan segmentasyon boru hattı uygulayabilirsiniz.
   1. Toplu Modu Çalıştır menüsünden, 'dosyaları ekleyin' ve tüm dosyalar tek seferde işlenecek yükleyin. Not: Farklı kaynaklardan gelen dosyalar segmentasyon kuyruğuna eklenebilir.
   2. 'Toplu-Mode Çalıştır başlatın' ve dosyaları işlemek için yazılım için zaman tanımak tıklayın. Not: Segmentasyon çıkışı orijinal dosyaların bulunduğu aynı dizine kaydedilir.
4. Segmentasyon değerlendirme ve manuel düzeltme
   Not: çok yüksek hassasiyet (>% 85) ile DAK bölümleri görüntüler, ancak, boyama ve görüntüleme kalitesi yanı sıra embriyo aşamasında, DAK performansını etkileyebilir. Genellikle, embriyonun içinde yüksek nükleer yoğunluk, daha büyük olasılıkla segmentasyon hataları Plac alacakE (Şekil 2B, 3). Böylece, segmentasyon doğruluğu her bir örnek için değerlendirilmeli ve gerekirse elle düzeltilmiş. hatalar iki tür tipik oluşur: segmentasyon-over ve altında segmentasyon.
   1. aşırı segmentasyon çözümleniyor:
      1. Yanlış pozitif tespit - sağlam çekirdekler olmayan apoptotik veziküller (Şekil 3A, B, D, yıldız) ya da diğer elemanları, fakat dakika ile örneğin, tanımlanmış olabilir.
         Not: Genellikle bu tür yanlış pozitif reel çekirdekleri daha küçük boyuta sahip ve vakaların çoğunda, kolayca tespit edilebilir ve e-tabloda sıralanmış olabilir. Küçük, ama geçerli parçalı hacim (Şekil 3A b ok başı) sonuçlanan çekirdekler sadece kısmen parçalanmış olabilir çoğu zaman Ancak, görsel muayene şiddetle tavsiye edilir.
      2. * Statistics.csv dosyasından yanlış pozitif için ilgili kayıtları silin. Orijinal * istatistiklerini koru.csv ileride ve düzenlemek bunun sadece bir kopyası dosyası.
      3. Parçalara aşırı ve 2 veya daha fazla çekirdeklerin (Şekil 3A c, ok ve ok uçları) olarak sunulan, ya onların yoğunluk seviyesini ortalamasını alarak kayıtları birleştirmek veya benzer ise, o hücre için kayıtların bir tutmak ve atın bir çekirdek olmuşsa Gerisi.
   2. altında segmentasyon çözümleniyor:
      1. DAK, iki ya da daha fazla çekirdek arasındaki sınırı tespit etmek için başarısız oldu ve bunun sonucu olarak, tek bir çekirdeği olarak bölümlenmiş olan Etkinlikleri (Şekil 3A d ok ve 3B). Not: ölçülmüş seviyeleri birleştirilmiş hatalı olan hücrelerin ortalaması olacaktır ve farklı soyları hangi ait edilebilir Bu, protein düzeylerinin ölçülmesi için, doğru bir hücre sayımı için bir problem teşkil etmektedir, ancak daha da önemlisi.
      2. MINS tamamen çekirdeği tespit etmek için başarısız oldu olayları belirlemek.
      3. Bu gibi durumlarda (4.4.2.1 ve 4.4.2.2) olarak, f ortalama gri düzeylerini ölçmekveya her bir ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) gibi alternatif bir alet az ya da un segmentli hücre (ler) de bir kanal, ve doğru seviyeleri ile hatalı kayıt değiştirin. İleride başvurmak için orijinal * statistics.csv dosyayı korumak ve bunun sadece bir kopyasını düzenleyin. ImageJ kullanarak Bunu yapmak için şu adımları izleyin:
         1. Sanal yığının ( 'Dosya'> 'Al'> 'TIFF sanal yığını ...') olarak DAKİKA tarafından oluşturulan karşılık gelen * overlaid.tiff dosyası ImageJ alakalı çok kanallı yığını açın ve ithal.
         2. az ya da un-dilimli çekirdeğin medial bölümünü bulun.
         3. serbest seçim aracını kullanarak DNA leke kanalında az ya da un-dilimli çekirdeğin çevresini özetlemektedir.
         4. Basın Crl + M (Macintosh Cmd + M) veya Analiz menüsüne gidin ve 'Tedbir' seçeneğini seçin. Bu eylem belirtilen alan için ortalama gri değerini kaydeder ve yeni bir pencerede gösterecektir. > 'Analiz' git9; Set ölçümleri ... 've emin olun' seçildiğinde 'gri Ortalama değer. başka parametreleri seçin ölçülecek.
         5. Aşama 4.4.2.3.3 yer verilen alan kullanarak, ilgi floresans kanalların her biri için ölçümü tekrarlayın. Sonuçlar ölçümleri 'Sonuçlar' penceresinde bir önceki eklenecektir.
         6. * Statistics.csv dosyasında hatalı kayıtları değiştirmek için elde edilen ölçümler kullanın. çekirdek segmentlere olmasaydı, yeni bir satır eklemek ona yeni bir hücre kimliği atar ve her kanal için gelen sütununda ImageJ elde edilen değerleri tanıtmak. Bu hücre uzamsal koordinatlarını (X, Y ve Z değerleri) olmaz. çekirdek undersegmented olsaydı, onun satır yinelenen her yeni hücreye farklı hücre kimlikleri atamak ve ilgili sütununda ImageJ elde edilen değerleri tanıtmak. Bu durumda, her iki hücreler uzamsal koordinatlarını paylaşacak.
            Not: mekansal dağılımı analiz edilmesi ise, biz rüst üste olacak şekilde ecommend XYZ hariç bu hücrelerin koordine eder. yeni kayıtlar oluştururken Bu amaçla, kolayca (örneğin, tamsayı olmayan sayılar için) orijinal olanlardan ayırt edilir onlara Hücre kimlikleri atayın.
   3. bölünen hücreler puan. Not: MINS mitotik yanı sıra, fazlar arası çekirdekler algılar, ancak aralarında ayrım yapamaz.
      1. mitotik çekirdekler analizinde ayrı ayrı dikkate alınması gereken ise, el ile bu skoru ve veri dosyasına bu bilgiyi ekleyin. mitotik hücreler kaydetmek için, * statistics.csv veri dosyasına yeni bir değişken (sütun) ekleyin ve mitotik ve çekirdekleri interfaz farklı değerler atayın.
5. Veri ön-işleme.
   Not: e-tablolar, aşırı için düzeltildi ve altında bölümleme onlar analiz edilecek hazır olduğunuzda. analiz süreci ve veri sunumu belirli bir denemenin bağlıdır. Ancak, aşağıdaki bazı genel veri dönüşümleri vardırBiz analizinden önce yürüten öneririz:
   1. Verilerin dağılım azaltmak için logaritma veya karekök içine floresan yoğunluğu değerleri Transform. Ham veri arsa eksenlerine yakın konsantre eğilimindedir (Şekil 4B, C bakınız) Bu aynı zamanda, görselleştirme yardımcı olur.
   2. floresan Z-ilişkili zayıflama düzeltin:
      Not: Bir dilim (Şekil 4E, F) bulunduğu eksen lazer tarama konfokal mikroskopi görüntüleri Flüoresan yoğunluğu Z derin azalır.
      1. örneklerde saptanan epitoplardan biri bir yerde ve homojen olarak ifade oda temizliği Nükleer marker olması durumunda, oda temizliği markör mukabil değer tarafından, her hücrede değerlerine bölünmesi ile diğer epitoplar floresan yoğunlukları normalize.
      2. Bu referans bir markör yokluğunda, şu şekilde floresan Z-bağlantılı kayıp telafi:
         1. (Y her bir markörün değerleri Konuarsa tüm kontrol, vahşi tip embriyolar (Şekil 4F) için bir araya değerleri - Z pozisyonu üzerindeki grafiğin) (grafiğin X ekseni) ekseni Z üzerinde şiddetindeki azalma görselleştirmek için.
         2. Her belirteç (Şekil 4F) için (yoğunluk Z üzerinde değerler) önceki aşamada elde edilen arsa için lineer model (regresyon eğrisi) takın.
         3. Aşağıdaki formülü kullanarak her bir marker için tüm değerleri düzeltin:
            log (orijinal değeri) + Z * modelinde (Şekil 4D, G) eğimi.
            Not: (R, MATLAB, vb) kullanılan analiz yazılımı bağlıdır bu düzeltme gerçekleştirmek için belirli adımlar. R kullanıyorsanız, veri bir lineer model sığdırmak için aşağıdaki formülü çalıştırın:
            > Lm (log (kanal) ~ Z, data = dataframe)
            nerede, kanal düzeltilmesi floresan kanal Z Z koordinat, ve dataframe istenen embriyo (lar) (* Stat tüm değerlerini içeren tabloDakika ya da bunun bir modifikasyonu ile oluşturulan istics.csv dosyası).
            Not: Yukarıdaki formül çıktı aşağıdaki biçime sahip olacaktır:
            (Önleme) Z
            4,76373 -,01947
            nerede, değeri Z mutlak değeri (bir örnek için Şekil 4G bakınız) 4.5.2.2.3 verilen formülle orijinal değerini değiştirmek için kullanılması gerektiğini veri kümesi için regresyon hattının eğimi.

Results

Veri yorumlama ve sunum kolaylaştırmak için, bakım tüm hücreler ve onların göreli konumu analiz edilebilir, böylece toplama ve manipülasyon sırasında embriyoların zarar vermemek için alınmalıdır Şekil 2A -. D genişletilmiş bir boşluğun farklı aşamalarda sağlam blastosist örneklerini göstermektedir. meydana zarar halinde, ekstra bakım analiz ve sonuçları yorumlanırken alınmalıdır.

Bu protokol kullanılarak oluşt...

Discussion

Mevcut protokol preimplantasyon sahne fare embriyoları üzerinde tüm montaj Immünofloresan bir nicel analizini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanır. Sağlam immünofloresan protokolü ²² yüksek çözünürlüklü takip eder, yazılımın ⁴ uyarlanmış bir parçası kullanarak konfokal görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ile tüm montaj. Immünofloresan protokolünün seçimi kritik olmasa da, biz, hızlı, güvenilir olmak ve biz test ettik antikorların çoğu için güçlü bir sinyal sağlamak için burada ²² s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embriyo toplama
Fiş kontrolü için künt prob	Roboz	RS-9580
Forseps	Roboz	RS-4978
Ameliyat makası	Roboz	RS-5910
Cam Pastör pipetleri	Fisher	13-678-20C
Önceden monte edilmiş aspiratör borusu ve ağızlık	Sigma	A5177
Daha uzun kauçuk boru	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Asit Tyrode çözeltisi	Millipore	MR-004-D
Penisilin / Streptomisin	Gibco	15140
Sığır Serum Albümini	Sigma	A9647
4 kuyulu plakalar	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
İmmünofloresan< / güçlü>
96 oyuklu U-alt plakalar	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glisin	Sigma	G7403
At serumu	Sigma	H0146
birincil antikorlar< / güçlü>			Konsantrasyon< / güçlü >
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R & D	AF1700	1:100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1:100, 10 dakika sabitleme
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1:100, O/N sabitlemesi
SOX17	R& D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, O/N fiksasyonuna 10 dakika
DAB2	BD	BD-610464	1:200
İkincil antikorlar	Yaşam Teknolojileri	Çeşitli	1:500
Hoechst 33342	Yaşam Teknolojileri	H3570
Görüntüleme
35 mm cam tabanlı çanaklar	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
64-bit Windows işletim sistemi		n/a	http://katlab-tools.org ve Lou et al., (2014) Kök Hücre Raporları
MATLAB (yazılım)	Mathworks	n/a
MINS (yazılım)	Ücretsiz	n/a	http://katlab-tools.org