Method Article

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

DOI:

10.3791/53654

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bir yöntem olup sayısal gerçekleştirmek için sunulur, yerinde tek hücre hattı özellikleri çalışma protein ekspresyonu analizi Fare preimplantasyon embriyolarında. Embriyo toplama, immünofloresans, bir konfokal mikroskop görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ve analiz için gerekli işlemler anlatılmaktadır. Bu yöntem, çoklu nükleer belirteçler ifade ve mekansal (XYZ) ve niceleme embriyo tüm hücrelerin koordinatları verir. Bu DAKİKA, özellikle preimplantasyon embriyo ve embriyonik kök hücre (ESC) kolonilerin konfokal görüntülerin analizi için geliştirilmiş bir görüntü bölütleme yazılım aracı yararlanır. MINS X, Y ve Z boyutları arasında denetimsiz nükleer segmentasyonu yürütmektedir ve az kullanıcı girişi ile tüm kanallar için üç boyutlu uzayda hücre konumuna ilişkin bilgiler, yanı sıra nükleer floresan seviyeleri üretir. Bu protokol, görüntü analizi için optimize edilmiş olsa dapreimplantasyon sahne fare embriyoları, kolayca iyi bir sinyal-gürültü oranı ve nerede yüksek nükleer yoğunluk (görüntü segmentasyonu bir engel teşkil örn., embriyonik kök hücre ifade analizini gösteren başka örneklerin analizi (ESC adapte edilebilir ) koloniler, kültür hücreleri, diğer türleri veya aşamaları, vb) arasında embriyolar ayırt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare preimplantasyon embriyo hücresi kaderi tarifnamede ve memelilerde de-novo epitelizasyonu çalışma için ortaya çıkışı ve in vivo pluripotensin idamesinde, hem de bir model çalışma için bir örnektir. ve iki extraembryonic soy, trofoektoderm (TE) ve - en somatik doku ve germ hücreleri yol açmaktadır - memeli gelişim preimplantasyon aşamaları blastosist, yani pluripotent epiblast oluşturan üç hücre soylarının kurulması için varız ilkel endoderm (PrE) (Şekil 1A) 1,2. Bu protokol, (2), ilgilenilen proteinleri etiket immünofloresan gerçekleştirmek (3) z-kesit yetenekleri ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme mo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik deyimi: Tüm hayvan çalışmaları, hayvancılık, damızlık ve kurban olmak üzere Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), protokol # 03-12-017 tarafından onaylandı.

1. Embriyo Koleksiyon

Tüm hayvan çalışmaları, kurumsal ve yerel otoriteler tarafından onaylanmış olması gerekir ve yerel ve kurumsal kurallarına uygun Not:.

  1. İstenilen genotip verimli bir damızlık erkek ile bir bakire kadın fare Mate.
    Not: estral döngünün östrus fazında kadın seçerek, doğal çiftleşmesi kurma istenen tarihte çiftleşme şansın....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veri yorumlama ve sunum kolaylaştırmak için, bakım tüm hücreler ve onların göreli konumu analiz edilebilir, böylece toplama ve manipülasyon sırasında embriyoların zarar vermemek için alınmalıdır Şekil 2A -. D genişletilmiş bir boşluğun farklı aşamalarda sağlam blastosist örneklerini göstermektedir. meydana zarar halinde, ekstra bakım analiz ve sonuçları yorumlanırken alınmalıdır.

Bu protokol kullanılarak oluşt.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol preimplantasyon sahne fare embriyoları üzerinde tüm montaj Immünofloresan bir nicel analizini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanır. Sağlam immünofloresan protokolü 22 yüksek çözünürlüklü takip eder, yazılımın 4 uyarlanmış bir parçası kullanarak konfokal görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ile tüm montaj. Immünofloresan protokolünün seçimi kritik olmasa da, biz, hızlı, güvenilir olmak ve biz test ettik antikorların çoğu için güçlü bir sinyal sağlamak için burada 22 s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, veri işleme, analiz ve gösterim konusundaki katkıları için Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan ve Panagiotis Xenopoulos'a, immünofloresan protokolünün tasarımı ve antikor testindeki yardımları için Berenika Plusa'ya ve el yazması ve bu protokolün geliştirilmesi hakkındaki yorumları için Hadjantonakis laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Laboratuvarımızdaki çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri R01-HD052115 ve R01-DK084391 ve NYSTEM N13G-236 tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Embriyo toplama
Fiş kontrolü için künt probRobozRS-9580
ForsepsRobozRS-4978
Ameliyat makasıRobozRS-5910
Cam Pastör pipetleriFisher13-678-20C
Önceden monte edilmiş aspiratör borusu ve ağızlıkSigmaA5177
Daha uzun kauçuk boruFisher14-178-2AA     
M2MilliporeMR-015-D
FHMMilliporeMR-024-D
Asit Tyrode çözeltisiMilliporeMR-004-D
Penisilin / StreptomisinGibco15140
Sığır Serum Albümini SigmaA9647
4 kuyulu plakalarNunc/Thermo-Fisher12-566-300     
İmmünofloresan< / güçlü>
96 oyuklu U-alt plakalarFisher14-245-73
Triton X-100SigmaT8787
GlisinSigmaG7403
At serumuSigmaH0146
birincil antikorlar< / güçlü> Konsantrasyon< / güçlü >
CDX2BiogenexAM392-5M1:200
GATA6R & DAF17001:100
GATA4Santa Cruzsc-90531:100, 10 dakika sabitleme
GATA4Santa Cruzsc-12371:100, O/N sabitlemesi
SOX17R& DAF19241:100
NanogReproCELLRCAB0002P-F1:500
OCT4Santa Cruzsc-52791:100, O/N fiksasyonuna 10 dakika
DAB2BDBD-6104641:200
İkincil antikorlarYaşam TeknolojileriÇeşitli1:500
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH3570
Görüntüleme
35 mm cam tabanlı çanaklarMatTekP35G-1.5-14-C
Segmentation
64-bit Windows işletim sistemin/ahttp://katlab-tools.org ve Lou et al., (2014) Kök Hücre Raporları
MATLAB (yazılım)Mathworksn/a
MINS (yazılım)Ücretsizn/ahttp://katlab-tools.org
çalıştıran bilgisayar

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Expression AnalysisMouse Preimplantation EmbryosConfocal Microscopy ImagingImage Segmentation AnalysisMINS Software ToolNuclear Marker QuantificationImmunofluorescence ProtocolEmbryo Collection ProcedureBlastocyst Isolation MethodSingle Cell Resolution

Related Articles