Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

9.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53659

⸱

4 Ocak 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

Bu makalede

Özet

Genetik olarak kodlanmış bir BAS FRET sensörü kullanarak canlı hücrelerde safra asidi dinamiklerini incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu Safra Asidi Sensörü, çok çeşitli hücre tiplerinde safra asidi taşınmasını ve FXR aktivasyonunu incelemek (düzenlemek) için benzersiz bir araçtır.

Özet

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), tek hücrelerde protein katlanmasını, etkileşimini ve lokalizasyonunu izlemek için güçlü bir araç haline gelmiştir. FRET prensibine dayanan biyosensörler, canlı hücrelerdeki hücre altı sinyalleşme olaylarının yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükle gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlamıştır. Burada, farnesoid X reseptörü ligand bağlanma alanına (FXR-LBD) kaynaşmış iki florofordan oluşan, böylece çok sayıda safra asidi türü ve diğer (sentetik) FXR ligandları tarafından aktive edilebilen bir safra asidi sensörü oluşturan genetik olarak kodlanmış bir Safra Asidi Sensörünün (BAS) uygulamasını açıklıyoruz. Bu sensör, safra asidi konsantrasyonlarını lokal olarak ölçmek için çekirdek (NucleoBAS) ve sitozol (CytoBAS) dahil olmak üzere farklı hücresel bölmelere hedeflenebilir. Floresan etiketler veya radyonükleuslar ile etiketlemeye gerek kalmadan endojen safra asitlerinin hücresel safra asidi akışının, akışının ve hücre altı dağılımının hızlı ve basit bir şekilde ölçülmesine izin verir. Ayrıca, BAS FRET sensörleri FXR ligand bağlanmasını izlemek için faydalı olabilir. Son olarak, bu FRET biyosensörünün, spektral olarak farklı diğer floroforların görüntülenmesi ile birleştirilebileceğini gösteriyoruz. Bu, hücre içi safra asidi dinamiklerinin ve i) ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonu ve/veya bolluğunun veya ii) tek bir hücrede hücre içi sinyallemenin birleşik analizine izin verir.

Giriş

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) yaygın olarak yüksek zamansal ve uzaysal çözünürlüğü 1 ile canlı hücrelerin hücresel fonksiyonları daha iyi anlayabilmek için kullanılır. FRET olarak uyarılmış bir donor-florofor enerji alıcı bir florofor aktarılır. Verimliliği FRET verici ve alıcı bir florofor ve yönelimi arasındaki mesafe sıkı bir şekilde bağlıdır ve bu nedenle, iki florofor etkileyen konformasyonel değişiklikler duyarlı bir değerini göstermektedir. Bu olay küçük moleküllerin görüntüleme için FRET tabanlı biyosensörler oluşturmak için istismar edilmektedir. Artar / verici florofor 2 karşı alıcısı emisyon şiddeti oranı azaldıkça bunların konsantrasyonundaki değişiklikleri takip edilebilir. Örneğin, FRET bazlı kalsiyum biyosensör hücreler 3 canlı M serbest kalsiyum konsantrasyonlarında hızlı ve kararlı bir tespiti için verir. FRET tabanlı biyosensörler diğer avantajları tek canlı hücrelerinde görüntüleme vardır, tvaris non-invaziv, yetenekleri değişik hücre türleri ve hücre bölmeleri 4 hedeflenmesini.

Hücre içi safra asidi dinamiklerinin birçok yönü hala tam olarak anlaşılamamıştır. Örneğin, küçük konjuge ve konjuge olmayan safra asidi taşıma mekanizması altında yatan yönetmelik hakkında bilinmektedir. Teknikleri Mevcut bu taşıma öncelikle lusiferaz-tabanlı gazetecilere, radyoaktif işaretli safra asitlerinin, ya da floresan safra asidi analoglarının faydalanmak izlemek. İkincisi muhtemelen onların özelliklerini etkileyen safra asitlerinin değiştirilmesine gerektirir. Lusiferaz tabanlı muhabirler kötü zaman çözünürlüğe sahip. Bunun yanı sıra, bu teknikler, örneğin kaybına neden olur ve tek hücre görüntüleme için geçerli değildir. Bu nedenle, bu rasyometrik algılama 5, 6 avantajı içerir, çünkü özellikle FRET biyosensörler kullanan taşımacılık faaliyetlerinin canlı tek bir hücre görüntüleme sağlayan yöntemleri kullanmak yararlı olacaktır. Iken CF varyantlarıP / YFP formu en sık FRET çiftleri kırmızı-kaymıştır safra asidi sensörü 7 de dahil olmak üzere yeni sensörler ile FRET araç kutusunun bir genişlemeye yol açmıştır kendini dernek uyaran mutasyonları taşıyan Morange ve mCherry kullanarak yeni stratejiler kullanılmıştır.

Daha önce farnesoid X reseptörü (FXR) ligand bağlanma domeni ile kaynaşmış bir donor-florofor (cerulean) ve bir akseptör-floroforu (sitrin) oluşan genetik olarak kodlanmış FRET safra asidi sensörüne (BAS) hazırlandı (FXR-LBD) ve bir peptit, bir LXXLL motifi 8 ihtiva etmektedir. Bir safra asidi bağımlı bir şekilde FXR-LBD This peptid ilişkilendirir. FXR aktivasyonu üzerine, sitrin ve Cerulean arasındaki uzaklık şekilsel bir değişikliğe bağlı değiştirecektir. Memeli hücre hatlarında, sitrin / cerulean oranında açık bir şekilde tespit edilebilir bir artış FXR, etkinleştirme, saflaştırılmış sensör ters yönde çalışır ve FXR aktivasyon üzerine azalan bir FRET oranı neden olurken. Bu sensör (CytoBAS)Sitozolik safra asidi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar. Hücre içi hedefleme motifleri karboksil terminal ilavesi ile, BAS konstrukt, farklı hücre bölmeleri safra asidi konsantrasyonlarının ölçülmesini sağlar çekirdeğin (NucleoBAS) ve peroksizom (PeroxiBAS) hedeflenebilir. Peroksisomal hedefleme motifinin eklenmesi safra asitleri olan yanıt zarar vermez, ancak hücre geçirgen FXR-ligandları bir peroksizom 8 içindeki PeroxiBAS değişiklikleri FRET uyarmadı. Bu tutarsızlık doğası bilinmemektedir gibi, protokol aşağıda CytoBAS ve NucleoBAS odaklanmıştır.

Bu genetik olarak kodlanmış FRET sensör kullanımı yakın zamanda safra asidi taşıyıcıları + / taurokolat ko-taşıma polipeptid (NTCP), Na ve organik çözücünün taşıyıcı alfa / beta (OSTαβ) 8 ihtiva eden hücreler gösterilmiştir. NTCP başlıca karaciğer safra asidi ithalatçı ve OSTαβ bir bazolateral bağırsak safra olduğunuelektrokimyasal safra asidi konsantrasyonu gradyanı 9, 10 bağımlı bir ithalatçı ve ihracatçı hem işlev görebilir asit taşıyıcı. Son veriler NTCP ve / veya OSTαβ safra asidi taşıma sırasında, ligand-FXR-LBD etkileşiminin bir sonucu olarak, FRET oranda sağlam ve hızlı yanıt gözlenebilir gösterdi.

Burada, biz böyle odaklı mikroskopik analiz ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) olarak FRET ölçmek için yöntemler ayrıntılı protokoller tanımlayan kritik adımları vurgulamak, olası sorunları çözmek ve alternatif yöntemleri tartışmak. Bu genetik olarak kodlanmış FRET sensörünü kullanarak, FXR-LBD ile safra asidi etkileşimi sayısal ve canlı hücrelerin doğrudan izlenir ve gerçek zamanlı olarak safra asidi taşıma ve dinamiklerini görselleştirme hızlı ve basit bir yöntem sağlar edilebilir. CytoBAS ve NucleoBAS kodlayan memeli sentezleme plasmidleri ticari olarak temin edilebilir. Bu nedenle, bu biyosensör daha katkıdasafra asidi taşıyıcılar veya FXR etkinleştirmek ve safra asidi biyoloji ve sinyalizasyon içine daha derin bir kavrayış sağlayan bileşiklerin anlayış.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Geçici Transfeksiyon

Not: CytoBAS ve NucleoBAS (Malzeme Tablo bakınız) başarılı bir şekilde çok sayıda hücre türleri (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK ve HEK293T hücreleri) kullanılmıştır. Sensör kullanmak için ana şartı o hücreye girmek için kodlama DNA gerektiren ifade edilecek gerekiyor.

  1. % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 FBS,% 1 L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) için uygun olan komple kültür ortamında hücrelerin seyreltilir.
  2. Steril 8 de odacıklı cam kapak (0.8 cm 2) içine istenilen yoğunlukta Plaka hücreleri. Bu gerekli değildir, ancak bir alt-konfluent (% 60-80 konflüansa), deney günü hücre katmanı Amaç.
  3. Oyuk başına 400 ul nihai hacme kadar komple kültür ortamı. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir.
  4. NucleoBAS ve 0.5 ug eklenmesi ile steril tüp içine transfeksiyon karışımı hazırlayınveya kültür ortamının 100 ul CytoBAS DNA (serum / antibiyotik serbest). Iyi girdap. Bir transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks karıştırın. Optimum verim vermek transfeksiyon reaktifleri hücre tipi bağlıdır ve önceki test gerektirebilir.
    1. Örneğin, 1 mg / ml polietilenimin (PEI) 2.5 ul kullanımı ve DNA / PEI 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın inkübe edin.
  5. Hücrelere damlacıklar transfeksiyon karışımı ekleyin ve hafifçe elle plaka sallayarak karıştırın. 9.6 cm 2 ~ bir kuyu için karışımın 100 ul ekleyin. Geçici olarak transfekte hücreler için ayrı ayrı görüntüleme odaları için transfeksiyon karışımı 10 ul kullanın.
    Not: 24-48 saat sonra, hücreler, safra asidi sensörü ifade edecektir ve deneyler için de kullanılabilir.

2. Kararlı Transfeksiyon

  1. % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 Fetal Sığır S için uygun komple kültür ortamında pelet seyreltinERUM,% 1, ml başına 150.000 hücre konsantrasyonunda L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) ve 6 oyuklu bir kültür plakasına (2 mi ucu hacim) oyuk başına yaklaşık 300,000 hücre ekleyin.
  2. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir.
  3. CytoBAS veya NucleoBAS DNA 0.5 mikrogram ekleyerek steril tüpe tranfeksiyon karışımı hazırlayın kültür ortamında 100 ul (serum / antibiyotik ücretsiz) için (Malzeme Tablosuna bakınız). Iyi girdap. Bir transfeksiyon reaktif ekleyin ve vorteks karıştırın.
    1. Örneğin, 1 mg / ml polietilenimin (PEI) 2.5 ul kullanımı ve DNA / PEI 15 dakika oda sıcaklığında karıştırın inkübe edin.
  4. Hücrelere damlacıkları içinde transfeksiyon karışımı 100 ul ekleyin ve hafifçe elle plaka çalkalayarak karıştırın. Stabil bir hücre dizisi oluşturmak her zaman bir transfekte edilmemiş kontrol içerir.
  5. 37 ° C'de hücreler O / N büyütün,% 5 CO2.
  6. Hücreleri tripsinize edin üreticinin protokolüne uygun olarak (37 ° C w hücreleri inkübei 1.5 ml 25 cm 2 hücre kültürü başına tripsin önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 250 xg'de onları aşağı doğru döndürün. Tam kültür ortamı içinde 13 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Çeşitli 10 cm çapında kültür yemekleri üzerine hücreler bölün: 0.5 ml (düşük yoğunluklu), 1.5 ml (orta yoğunlukta) ve 4.5 ml (yüksek yoğunluklu). 6.5 ml kalan için de yapın.
  7. 10 ml nihai hacme kadar kültür ortamı. U2OS hücreleri için, örneğin CytoBAS olarak neomisin direnç kaseti ile plasmidler için 800 ug / ml G418 kullanmak NucleoBAS pozitif hücreleri seçmek için inşa eder. Bu konsantrasyonlar hücre tipi bağlıdır ve transfekte edilmemiş hücreler, 2 ila 10 gün (U2OS hücreleri için 800 ug / ml G418) içinde öldü düşük antibiyotik (G418) konsantrasyonu seçilerek belirlenebilir.
  8. Untransfected hücreler ölene kadar uygun antibiyotik (G418) ile kültür ortamı her 72 saat yenileyin.
  9. 20X bir amaç için mikroskop altında kültürü plakası inceleyinpozitif koloniler (floresans, yeşil, mavi veya sarı floresan için kullanılan en filtre kümesi kullanılarak izlenebilir).
  10. Kültür çanak dış altındaki bir kalemle diğer kolonilerden izole yalan olumlu koloniler işaretleyin.
  11. Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile iki kez plaka yıkayın ve aspire. Yaklaşık 15 steril klonlama silindirleri alın ve steril silikon içine batırın. Petri yemek hafifçe basılarak seçilen kolonilerin etrafında onları uygulayın ve birden fazla koloni klonlama halkada yer olduğundan emin olun.
  12. Pipet 20 klonlama silindirde önceden ısıtılmış tripsin (1 x, 0.25%) ve ul ve yuvarlanır hücrelerin çoğu (mikroskopla dikkat edin) kadar 37 ° C'de inkübe edin.
  13. Klonlama silindir (U2OS ve Huh7 hücreleri,% 10 FBS ve 800 ug / ml G418) serumu ve uygun antibiyotik ile kültür ortamında 150 ul ilave edin ve aşağı hücreleri tekrar süspansiyon ve 96- aktarmak birkaç kez pipetleyin veiyi plaka. 4-24 saat sonra orta yenileyin ve hücreler önümüzdeki birkaç gün (37 ° C, U2OS ve Huh7 hücreleri için% 5 CO 2) 'de konfluent büyümeye olanak sağlar.
  14. Her 3 veya 4 gün antibiyotik ile orta yenileyin. Hücreler konfluent büyüdü sonra, daha geniş bir plaka aktarabilirsiniz. Kültür deneyler için yeterince büyük olana kadar bu adımı yineleyin. Yedekleme için bazı şişeleri cryopreserve. Soğukta saklama ortamı takviyesi olmayan ortam (DMEM) içinde% 20 FBS ve% 20 DMSO içerir.
    Not: Şimdi, hücre çizgisi monoklonal ve safra asidi Sensor ifade etmek için kararlı olarak düşünülmektedir. Antibiyotik G418 (400 mg / ml) yarısı konsantrasyonu stabil hücre ekspresyonu sağlamak için artık yeterli olmaktadır.

3. Lentiviral İletimi

Not: Bazı hücre çizgileri, polietilenimin (PEI) yöntemi gibi geleneksel yöntemler ile transfekte etmek zordur olarak kabul edilir. Hücrelerin viral transdüksiyon etkin alternatif bir araç fveya gen dağıtım ve stabil transgen ekspresyon.

  1. % 80 konfluent 25 cm2 şişeye Hasat hücreleri. Belirli bir hücre çizgisi (% 10 FBS,% 1 L-glutamin,% 1 pen / U2OS ve Huh7 hücreleri için strep) için tam kültür ortamı içinde hücreler, uygun seyreltilir ve 6 oyuklu bir kültür plakasına oyuk başına yaklaşık 200,000 hücre ekleyin.
  2. Oyuk başına 2 ml'lik bir nihai hacme kadar kültür ortamı. Hücreler, 24 saat boyunca birleşmeye izin verir.
  3. 500 ul CytoBAS lentivirüs (isteğe bağlı olarak) ihtiva eden ortam ile 4-6 saat boyunca kuluçkaya hücreler viral transductions gerçekleştirme 10 ug / ml dietilaminoetil (DEAE) -dextran ya da başka bir lentiviral içeren tam kültür ortamı ile 1 ml 'lik bir toplam miktar kadar doldurulur transdüksiyon arttırıcı. Untransduced kontrol hücreleri ile bir kuyu eklemeyi unutmayın.
  4. Ortamı çıkarın ve istenen antibiyotik (500 ug / ml higromisin) içeren tam kültür ortamı 2 ilave edin. Temin CytoBAS transdüksiyon bir lentiviral yapı kullanaraks hücrelere direnç higromisin. İstenen şartlar altında hücrelerin büyütün.
  5. 3 günde antibiyotik (500 ug / ml higromisin) ile orta yenileyin ve% 80 confluent, tüm negatif kontrol hücreleri ölene kadar (çoğu hücre hatları için yaklaşık 1-2 hafta sürer) ne zaman hücreleri bölme. Hücre hattı artık Safra Asit Sensörü ifade etmek için stabil sayılır.
    1. Seçenek olarak ise, 1-3 gün viral transdüksiyon sonra deneyler için hücreleri kullanır. Canlı virüs mevcut olabilir gibi, bu uygun güvenlik düzeyine sahip odalarda FRET-okuma ekipmanı gerektirir.
  6. Seçenek olarak ise, stabil hücre hatlarının izolasyonu için hızlı, floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) gerçekleştirmek.
    1. Bir konfluan 160 cm 2 şişesi Hasat hücreleri.
    2. Ml başına en fazla 5 x 10 6 hücre bir konsantrasyona <% 5 serum ile Leibovitz kültür ortamı hücreleri (L-15 ortamı) ile seyreltilir
    3. Sıralanan hücrelerin toplanması için toplama orta 1 ml (L-1 ile FACS tüpleri doldurmak5 ortamı +% 1.5 pen / strep,% 1 L-fazlalığı ve% 20 serum).
    4. 405 lazerle heyecanlı sitrin (520-580 nm) veya Cerulean (450-520 nm) için sıralama hücreleri.
    5. Yaklaşık 500,000 hücre sıralama sonra hücreler (5 dakika, 250 x g) durması ve 5 ml bunları tekrar süspansiyon, normal komple kültür ortamı (% 10 FBS, 250 ug / ml Higromisin U2OS ve Huh7 CytoBAS hücreleri) ve bir T25 kültür onları plaka şişe. İstenen koşullar (37 ° C U2OS ve Huh7 hücreleri,% 5 CO2) altında hücre büyütün.

Safra Asit Sensör 4. Canlı Hücre Görüntüleme

Not: safra asidi taşıyıcıları ihtiva eden hücreler, lipofilik bileşikleri çıkaran% 1-10 kömür filtrelendi serumu ile ortam içinde kültürlenebilir. Normal serum sık sık Safra Asit Sensör hücre içi safra asidi birikimine ve doygunluk yol açabilecek safra asitleri içerir.

  1. Konfokal mikroskop kullanılarak FRET ölçümler
    1. Sabit olarak veya transie hücreler plakantly steril 8 kuyu lamel dipli haznesi slayt içine istenilen yoğunlukta sensörü ifade (0.8 cm 2). Tüm kültür ortamı hücreleri büyümek (kömür filtrelendi serum kullanılarak), böylece deney gününde, birbirine karışmaya yaklaşık% 60-70 kadardır.
    2. PBS veya Leibovitz L-15 kültür ortamında 1 x 200 ul ile bir kez oda slayt yapışık hücreler yıkanır.
    3. Herhangi bir CO2 kontrol edilmesi gereklidir, böylece aspire edin ve 300 ul Leibovitz L-15 kültür ortamı ile değiştirin.
      Not: fenol kırmızısı olmadan DMEM da kullanılabilir, ancak CO 2 tamponlu koşulları gerektirir. Safra asidi sensörü gösterileri (bazı) pH duyarlılığı öylesine veri toplama sırasında pH sabit tutmak hedefliyoruz.
    4. L-15 kültür ortamında da konfokal görüntüleme deneyinde kullanılacak bileşikleri seyreltilir. Görüntüleme sırasında, oda içindeki sıvının nispeten büyük miktarlarda numune (50-100 ul), hızlı bir şekilde karışmasını sağlamak için ilave edilmesi gerekir dikkate almakböylece 3-5x çözümler yapmak.
    5. 37 ° C inkübasyon odası ile bir konfokal mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın ve menekşe 405 nm lazer açın. Amaç üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve bunun üstüne 8 odasına yerleştirin. FRET tek hücre görüntüleme için, 63X yağ objektif kullanın. Sensör başarıyla oda sıcaklığında kullanılır olmuştur, ancak hücre davranışı değişmiş olabilir.
    6. Düzgün konfokal mikroskop ayarlarını yapın.
      1. Set Toplama modu: XYT (tek odak düzlemi zaman atlamalı görüntüleme).
      2. Denemeyi duraklamadan bileşikler satın almalar arasında eklenecek izin 20 sn aralıklarla görüntüleri edinin.
      3. Cerulean: Emisyon tespiti için ayarlayın spektral aralık 450-520 nm; Sitrin: 520-580 nm.
    7. Transillüminasyon ışık kullanılarak tek bir hücre tabakası üzerinde odaklanır. Görüntüleme başlatın ve daha doğrusu z-konumunu ayarlamak. Kazanç ayarlayın ve devam ederken arka planda gelen sinyali ayırt etmek her kanal için ofsetilgi hücreleri tüm pikseller için iyi bir doyma aşağıdaki ing.
    8. Faiz (ROI) bölgeyi tanımlamak için daireler çizin. Benzer floresan gösteren hücreleri seçin. Açıkçası boyut ve şekle ortalama hücre farklı hücreler kaçının. Sensörün photobleaching en aza indirmek için mümkün olduğu kadar kısa bir süre boyunca ışığa hücreleri Açığa. Bu hücre çevresine çok yakın değil ROI'leri çizmek tavsiye edilir. Bu alan, fokal sürüklenme (z-yönünde hareket eden hücreler) daha zor deney sırasında flüoresan oranındaki değişiklikleri izlemek için hale getirmek için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle en duyarlıdır.
    9. Konfokal mikroskop ile ölçümler başlayın. Gök mavisi ve sitrin floresan sabit olana kadar bekleyin.
    10. Ölçüm sırasında seçilen zaman noktalarında 50-100 ul safra asitleri veya başka bileşikler ekleyin. Sıvı (nihai hacmin üçte birine beşte biri) nispeten yüksek miktarlarda / p çalkalamadan (10 saniye içinde) de sıvıları karıştırmak için gerekli olanYukarı ve aşağı ipetting. Pipet ile 8-iyi odasının kenarına dokunacak ve hücreler odak dışında alamadım böylece yavaş yavaş sıvı eklemek için emin olun. Plato fazı ulaşılmadan önce yeni bileşikler ilave etmeyin. Bu yaklaşık 200 saniye sürer.
    11. 100 ul GW4064, son konsantrasyonu 5-10 uM (sensör doyurucu doz) eklenmesi ile her deney sonlandırın ve sensör floresan stabil olana kadar bekleyin.
    12. Denemeyi kaydedin ve bir AVI dosyası olarak veri ihracat.
    13. ImageJ aç hem AVI dosyaları (kanal 00, gök mavisi, 01 kanal, sitrin) Eklentiler> Yığınlar> Yığın harmanlayıcıyı seçerek. Alternatif doğrudan Görüntü J, ithalat confocal dosyası (örneğin, .lsm veya .lif dosyaları) (http://www.openmicroscopy.org mevcut) uygun eklentileri kullanarak ve 4.1.14 adıma geçin.
      1. Stack 1: Kanal 01 (sitrin) kullanın.
      2. Stack 2 için: Kanal 00 (cerulean) kullanın.
    14. Düzenle üzerine tıklayın> Seçim> ekleyöneticiye, ROI yöneticisi penceresini açmak için. Onay kutusunu işaretleyin 'Tümünü Göster'.
    15. Oval Seçim aracıyla belirli hücrelerin kapsayan ilgi birkaç bölgelerini (ROI) çizin. Ayrıca hücrelerin dışında veya arka plan sinyalini belirlemek için sensör ifade etmeyen bir hücrenin içerisindeki bir alanda tek daire çizin. Bu bağlı fokal sürüklenme (z-yönünde hareket eden hücreler) ya da hücre göçü için floresan yoğunluğundaki değişiklik belirgin iken deneylerde hücre çevresine çok yakın ROI çizmek için tavsiye edilir.
    16. Tek hücreyi seçin. Eklentiler> Oran Profiler tıklayın. RAW, oran ve Ratio_Profile Bu 3 ekranlar ile sonuçlanacaktır. RAW penceresi FRET varsa sitrin (mavi çizgi) yoğunluğundaki artış ve cerulean (kırmızı çizgi) bir düşüş göstermektedir. Oran penceresi FRET bir artış ile artacağı cerulean oranı sitrin / hakkında bilgi verir. Ratio_Profile penceresi her iki kanal ölçülen floresan yoğunluğunun gerçek sayısını verir. MICROS EğerDosyaları kanal sırası tersine olabilir kullanılan kurulum özgü dosyaları (örneğin, .lsm veya .lif yerine avi) baş.
    17. Ek veri olarak ekli e-tabloda Ratio_Profile penceresinden verileri kopyalayın. Diğer tüm hücreler (ve arka plan ROI) için de yapın.
      Not: Online e-tablo, tüm veri maksimum BAS aktivasyonu beklenen hangi duruma normalize edilir. GW4064 FXR en güçlü bir aktivatör olduğu göz önüne alındığında, GW4064 bir fazlalık ile inkübe edildikten sonra flöresan oranı Bu GW4064 ilavesiyle deney sonuna tek önemlidir 1 olarak ayarlanır. Bunun avantajı, verileri artık daha kolay bir şekilde kıyaslanabilir farklı günlerde lazer yoğunluğu ya da dedektör kazanç ve deneyler bağımlı olmasıdır. Ayrıca, elektronik tablonun alt grafikte, bir çalışan ortalama deneysel gürültü eğrileri düzeltmek için de kullanılabilir. Çalışan Avera beri, kinetik veriler analiz Ancak, bu grafiği kullanmayınge pürüzsüz, hızlı kinetik tepkiler de olacaktır.
  2. Kontrol THP kullanılarak FRET ölçümleri (FACS)
    1. Steril FACS alım tamponu (0.3 mM EDTA,% 0.5 BSA,% 0.01 NaN3 ve 10 mM D-glukoz) FACS deneyi için tüm bileşikleri seyreltilir.
    2. PBS içinde 5 mM EDTA kullanılarak% 80 birbirine bağlı T-160 cm 2 hücre kültür şişesi Hasat hücreleri. 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje hücreleri. Oda sıcaklığında 5 ml FACS alım tamponu içinde yıkayın hücre topağı 2x.
    3. Coulter Sayacı veya sayma odacığı kullanılarak hücre sayımı.
    4. 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar FACS alım tamponu pelet seyreltin. Tek hücre homojen bir süspansiyon oluşturmak için yukarı ve aşağı pipet ve. Hücreler ayrıştırmak zordur iseniz, meme takunya en aza indirmek için sıralama önce hücre süzgecinden örnekleri koydu.
    5. Pipet 200 ul FACS tüpü başına hücre ve ışıktan koruyunuz.
    6. Bileşiğin istenen konsantrasyonu ekleme (örneğin,, Safra asitleri, sentetik FXR ligandlar, taşıyıcı inhibitörleri). Vortex. (Karanlıkta) çalkalayarak oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkalayın.
    7. Bu arada, FACS (lazerler ısınmak için zamana ihtiyacım var) başlatın.
    8. Deney (bakınız Şekil 3) için yolluk parametreleri flow sitometri ayarlayın:
      1. Kapıları belirlemek için hücreleri transfekte 100.000-200.000 NucleoBAS veya CytoBAS etrafında yükleyin.
      2. İlk arsa merkezinde hücreleri çizmek için FSC ve SSC gerilimler ayarlayın.
      3. Menekşe lazer kullanarak Cerulean (450/40 nm) gerilim değeri ve sitrin (525/20 nm) gerilim ayarlamak ve tüm NucleoBAS veya CytoBAS pozitif hücreler dağılım arsa içinde çizilen emin olun.
      4. Bakınız Şekil 4, doğru kapıları (Gate P4 kadar Gate P1) ayarlayın.
        1. SSC-A / FSC-A arsa ortasında ana nüfusu seçerek genellikle sol alt köşesinde görüntülenen ölü hücreleri, dışlamak için kapı P1 kullanın.
        2. Gate P2 kullanınFSC-H / FSC-bir pencere analizinden duplets kaldırmak için. Tek hücreler çiftler daha diyagonal çizgi sunulmuştur.
        3. Sitrin Gate P3 (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) pencere citrine ve gök mavisi yüksek hücrelerin yolluk, NucleoBAS / CytoBAS pozitif hücreleri seçmek için kullanılabilir, bir nüfus sağ üst köşesinde çaprazdan görüntülenen arsa.
        4. Mümkün olduğunca yakın nüfusun sol üst, kapısının P4 çizin ve hücrelerin en fazla 5% Bu kapının içinde kalan emin olun.
      5. Otomatik floresan belirlemek için bazı untransfected hücreler (CytoBAS veya NucleoBAS hiçbir ifadesi) yükleyin. Untransfected nüfus kapısı P3 bulunan olmayabilir. Otomatik floresan hücreleri hariç gerektiğinde kapı P3 ayarlayın.
    9. FACS tüpleri koymadan önce örnekleri Vortex. Her bir örnek için, kapı P3 en az 10,000 hücre ölçer.
      Not: Nüfus Hiyerarşi Pencere olayların sayısını verirebeveyn kapısının her kapısı ve% için görüntülenen. Kapının 4'te, ebeveynin% Tüm NucleoBAS pozitif hücrelerin yüzdesi olarak artan bir sitrin / cerulean oranı hücreleri belirtmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sunulan FRET BAS sensörü, iki florofor sitrin ve gök mavisi) ile bir LXXLL motifi bağlı FXR (LBD-FXR) ligand bağlanma dayanmaktadır. Bu sensör, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe (Şekil 1 A) canlı hücreler safra asidi taşıma soruşturmalar izin verir. Gök mavisi ve sitrin mutasyonlar molekül içi kompleksi (Şekil 1 B) oluşumunu teşvik etmek için uygulanmıştır. Safra asitleri ve diğer F...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada canlı hücrelerin safra asidi taşıma uzaysal dinamiklerini izleme yeteneğine sahip yeni bir genetik olarak kodlanmış safra asidi sensörü kullanılması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu biyosensör böylece FRET tabanlı safra asidi sensörüne (BAS) oluşturulması, FXR-LBD'sine füzyonla birleştirilir gök mavisi ve sitrin floresan proteinlerden oluşur.

Hücre kültürü ve FACS veya (konfokal) mikroskopi temel deneyime sahip olduğunda Safra Asit Sensör kullanımda nispeten basit ve kullanı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, ERC başlangıç hibeleri (ERC-2011-StG 280255 ve ERC-2013-StG 337479) ve Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü (Vidi 91713319) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CytoBAS Addgene62860
NucleoBAS Addgene62861
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagles ortamı (DMEM)LonzaBE12-614FL-glutamin içermeyen yüksek glikoz
Penisilin-Streptomisin (kalem / strep)Lonza17-602E
L-glutamin (200mM)Lonza17-605E
Fetal Sığır Serumu (FBS)İnvitrojen102-70
Tripsin-EDTA (10x)LonzaCC-5012
T-25 hücre kültürü şişesiVWR uluslararası392-0253Laminin kaplı
T-175 hücre kültürü şişesiVWR uluslararası392-0238Laminin kaplı
6 oyuklu plakaVWR uluslararası734-0229Poli-L-lizin ve Laminin kaplı
10 cm çanakVWR uluslararası392-0243Laminin kaplı
Dietilaminoetil (DEAE) - DekstranSigma-AldrichD9885
Polietilenimin (PEI) Brunschwig23966-2
G418 (genetik) 50 mg / mlInvitrogen10131-027
Higromisin B, 50 mg / mlInvitrogen10687-010
Klonlama silindiri (6 x 8 mm)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz kültür ortamıInvitrogen21083-027Fenol kırmızı
Polistiren yuvarlak tabanlı tüp (5 ml) Facs tüpüFalcon BD352008Kapaksız, steril olmayan
Falcon 2,063 tüp (5 ml)Falcon BD352063Çıtçıtlı kapak, steril
Nunc Lab-Tek 8 kuyulu kapak camıThermo scientific155409Steril
Kömür filtreli FBSLife teknolojileri12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCASigma-AldrichT6260
CDCASigma-AldrichC9377
Diğer kimyasallarSigma-Aldrichnv t.

Kaynaklar

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FRET GörüntülemeGenetik Olarak Kodlanmış SensörFXR Ligand BağlanmasıKonfokal MikroskopiCanlı Hücre GörüntülemeCerulean Citrine FRETHücre Altı LokalizasyonSafra Asidi Transportu
Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.