Yöntem makalesi

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

DOI:

10.3791/53676

⸱

28 Kasım 2015

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvar son doğal katil (NK) hücreler, kanser hücrelerinin β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin salgılamasında eksiklik kılınmış halinde intrakranial engraftment sonra merkezi sinir sistemi 1 malign gliomalar yakında ortotopikal implante fare ve sıçanı GL26 yok etme kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamaktadır -1 (gal-1). Daha yeni iş artık Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bir popülasyonu bu yönde önemli olduğunu göstermektedir. Daha NK ve miyeloid hücrelerin, izolasyon ve glioma infiltre periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) analizi için geniş kapsamlı bir protokol geliştirilmiştir gal-1-eksikliği olan tümör reddinin kazandırmak için ortak olarak kullanmaktadırlar mekanizmalarının anlaşılması. Yöntem tümörün mikro içine PBMC sızmasını karşılaştırarak burada gösterilmiştir ShRNA demonte aracılığıyla gal-1 eksikliği hale olanlarla GL26 gliomalarda gal-1 ifade. Protokol bir bilgi ile başlar nasıl kültürü ve GL26 ce hazırlamaksingeneik C57BL / 6J fare beyin aşılama için lls. Daha sonra erken beyin tümörü mikroçevresinin gelen glioma-infiltre PBMC'lerin izolasyon ve akım sitometri analizi yer alan adımları açıklar. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo deney tasarımları bir dizi uyarlanabilir. Glioma süzücü PBMC'ler bağımsız deneyler boyunca zaman noktası eşleşen tümörlerden gözlenen benzer hücre sayısı ile 24 saat sonrası tümör melezleme olan en kısa sürede, kafatası tümörlerinden izole edilebilir bir yöntem, hassas ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat yöntemi gerçekleştirebilir. Alternatif glioma modeller ve / veya hücre spesifik saptama antikorları ayrıca birçok Immun süzülmesini değerlendirmek için deneysel çalışan takdirine kullanılabilirGenel prosedüre değişiklikler gerektirmeden ilgi e hücre tipleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gliomalar, merkezi sinir sistemi (CNS) dönüştürülmüş glia kaynaklanan nöroepitelyal Beyin kanserlerinin sınıfıdır. Tüm Gliomaların, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Evre IV glioma veya glioblastoma (GBM), en yaygın ve 1 ölümcül olanıdır. GBM temozolomidin 2 ile radyasyon artı eşzamanlı ve adjuvan kemoterapi takiben ölçüde mümkün tümör rezeksiyonu oluşan mevcut standart-bakım son derece dirençli olduğunu. Bu ölümcül kanserler 5 yıl sonra 3 hastalık hayatta kalan hastaların sadece% 5 ile ilk tanı anında hayatta kalma, sadece 15-18 ay kasvetli prognoz taşır.

Kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı, profesyonel antijen sunan hücreler eksikliği (APC'ler) ve beyin 4 içindeki niyetli lenf yapılarının daha önce tanımlanmamış varlığı ayrıcalıklı immün GBM kavramına yol açmıştır. Ancak, çok sayıda çalışmalar artık shobu beyin kanserleri gerçekten de, monositler, makrofajlar, ve miyeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSCs) 5 içerir kökenli ağırlıklı miyeloid periferal bağışıklık hücrelerinin alınmasını doğurmak bu w. GBM de 6,7 yanlısı tümörijenik olmak için beyin ikamet mikroglia aktivitesini etkilemektedir. Örneğin CD8 + T hücrelerinin CD56 + 8 ve doğal öldürücü hücrelerin 9 lenfatik hücreler de tümörün mikro-ortamı içinde mevcut olan, ancak çok daha az sayıda, düşünülen bir gerçektir (nedeniyle tümör bağlantılı makrofajlar üzerinde glioma türetilmiş faktör tarafından teşvik bağışıklık işlevine olduğu TAM) 10. CD4 + T hücreleri GBM de mevcut, ancak bu nüfusun çok da CD25 ve Foxp3, immünosupresif T regülatör (T reg) hücrelerinin 11 yapımcıları ifade eder. GBM genel bağışıklık durumu immünolojik kaçış ve tümör ilerlemesi 12. promosyon sona eriyor.

GBM immunsupresyonun mekanizmaların daha iyi anlaşılması tümöre karşı bağışıklık sistemini uyarmak için tasarlanmış etkili immunoterapötik stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Son 15 yılda bizim laboratuvar etkili yeni bir anti-GBM immünoterapötiklerin 13-19 geliştirmek için beyin tümörü immunosuppresson mekanizmalarını aşmak için çalıştı. Bu eserin doruk noktası artık yeni teşhis GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov Identifier) ​​olan hastalar için kombine sitotoksik ve bağışıklık uyarıcı terapötik değerlendirmek için tasarlanmış bir klinik çalışmaya yol açmıştır.

En son çalışmalar, fare ve sıçan CNS GL26-1 GBM hücreleri β-galaktozid bağlayıcı lektin galektin-1 (gal-1), 20, büyük miktarlarda üretilmesi anti-tümör NK hücre immün gözetim bloke olduğunu göstermektedir. Bu shRNA aracılı gen demonte kullanılarak glioma hücreleri gal-1 ekspresyonunu bastırmak ile gösterilmiştir. İn vitro experiments gal-1 eksikliği glioma hücreleri kültürde normal çoğaldı gösterdi, ancak genetik olarak özdeş C57BL / 6J veya RAG1 içine intrakranial engraftment kısa bir süre sonra hızlı ret uygulandı - / - farelerin, böylece bu formda T veya B hücrelerinin bağımsızlığını kuran tümör rejeksiyon. Anti asiolo GM 1, anti-serum veya gal-1-eksikliği olan glioma reddi NK hücrelerinin rolünün oluşturulması intrakraniyal gal-1-eksikliği olan glioma büyümesinin komple restorasyonuna yol açan monoklonal NK1.1 antikorları ile NK hücre bağışıklık sistemine. Şimdi Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin bu bağışıklık sistemindeki durumu göstermektedir, böylece, NK-aracılı gal yardımında miyeloid hücreleri için bir vazgeçilmez yardımcı bir rol ortaya NK hücrelerin varlığına rağmen gal-1-eksikliği olan gliom reddini önlemek için yeterli olan -1 eksik tümör lizis (yayınlanmamış veriler). Bu beklenmedik sonuç, periferik kan mononükleer hücrelerin izolasyonu ve analiz (PBMC) için kapsamlı bir protokol geliştirmek için yol olduğudaha iyi gal-1 eksik glioma reddini yüklem bağışıklık sızma olayları karakterize böylece yakında intrakranial engraftment sonra beyin tümörü mikro sızmak.

Yöntem, GL26-Cit olarak adlandırılan bir şekilde eksprese mCitrine floresan protein, floresan mikroskobu 21 doğrudan tümör hücresi görüntülenmesine izin vereceği şekilde bir fare GL26 glioma hücreleri kullanılarak burada gösterilmiştir. Bu hücreler stereotaksi singeneik C57BL / 6J fareler, beyin içine aşılanan ve önceki fare ötenaziye 24, 48 ya da 72 saat boyunca büyümeye bırakılmıştır. Glioma nüfuz eden PBMC'ler daha sonra anti -CD45 kullanılarak izole edilir ve imüno-edilir, -Gr-1, -CD11b ve granzim B hücre içi immunolabeling birlikte -NK1.1 hücre yüzeyi antikorlar (GzmB). Antikorların Bu özel bileşimi Bu var b tümör-süzücü Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücrelerin tanımlanması ve NK1.1 +, NK hücreleri, hücre tipleri için izin verireen gal-1 eksikliği tümör reddi karışmış. Gal-1-eksikliği olan GL26-Cit glioma bağışıklık infiltrasyonu profili, GL26-Cit-gal1i olarak anılacaktır, daha sonra, bir non-içeren gal-1 GL26-Cit-NT adı normal seviyelerini sentezleyen gliomlar ile karşılaştırılır Kontrol ShRNA hairpin hedefleme. Protokol ortotopikal singeneik C57BL / 6J fareler striatumu içine, bu hücrelerin sokmak için nasıl bir açıklama takip eder, in vitro olarak nasıl Kültür GL26-Cit glioma hücreleri üzerinde bir açıklama ile başlar. Daha sonra izolasyon ve akım sitometri analizi için glioma-infiltre PBMC'lerin immunolabeling ilgili adımları saymaya devam eder. Protokol standart veri analizi ve grafik gösterimi bir açıklama ile sona eriyor.

Gösteri ortaya koymaktadır hem Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri tercihen 48 içinde gal-1 eksikliği beyin tümörü mikroçevresinin içinde birikirTümör implantasyonu, bu tümörler hızla tam tümör lizis yaklaşık 1 hafta sonrası tümör melezleme 20 geçmesi açıklamaya yardımcı olan bir sonucun hr. Yöntem, beyin içine bağışıklık infiltrasyonu üzerine geçici veri gerekli olduğu in vivo olarak farklı deney tasarımları bir dizi için de uyarlanabilir. Tek bir Deneyciler analiz edilecek numune sayısına bağlı olarak yaklaşık 4-6 saat içinde, glioma süzücü PBMC akım sitometrik beyin hasat protokolü gerçekleştirebilir. Yöntem aynı zamanda, özellikle tümör mikro-ortamı tarafından uyarılan bağışıklık bastırma fenotipleri tespit etmek, böylece beyin sızmaya olanlar ile karşılaştırıldığında tümör taşıyan farelerdeki PBMC'ler dolaşan profilini karakterize etmek için amaçlanmıştır deneyler ile kombine edilebilir. Bu ve benzeri yöntemlerin uygulanması beyin tümörü mikroçevresinin içine periferik bağışıklık hücrelerinin kaçakçılığıyla faktörlerin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: deneyler gerçekleştirmeden önce tüm protokol gözden geçirin. Hayvanların kullanımı ve refahı üzerinde uygun kurumsal komitesinden omurgalı hayvanların kullanımı için onay Devam öncesinde elde edilmelidir.

Intrakranial Aşı için Tümör Hücrelerinin hazırlanması 1.

  1. Bir sınıf II biyolojik güvenlik kabininde çalışan (% 10 steril filtrelenmiş ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 500 ml'lik bir şişe ilave tarafından GL26-Cit-NT / gal1i hücre kültürü ortamı hazırlanmasıyla FBS başlatmak ), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, mCitrine sentezleme vektörünün seçimi için / ml G418 sülfat (600 ug) ve non-seçimi için puromisin dihidroklorid (3 ug / ml ) hedefleyen veya gal-1 spesifik shRNAs.
  2. Kültür GL26-Cit-NT ve / veya GL26-Cit-gal1i hücreleri (Şekil 1 A ve 1 B ) 37 ° C ve% 5 Şubat 01-02 gün için önceden tümör melezleme prosedürüne kadar veya CO için doku kültür dolabı kümesindeki şişeler 50-80% birleşik duruma ulaştılar.
  3. Ameliyat günü, bir 10 ml serolojik pipet ve pipet tabancası kullanarak glioma hücrelerinin hücre kültür ortamı çıkarın ve atık behere medyayı atın.
    1. Top yan aşağı şişesi ters çevirin ve 10 ml'lik serolojik pipet kullanarak şişenin üst tarafında DPBS 10 ml ekleyin. Yavaşça DPBS hücreleri kapsayacak şekilde şişeyi ters, sonra şişeyi dikey ipucu ve kaldırmak ve atık behere DPBS atın.
  4. Ekle Her T75 doku kültürü şişesine EDTA ile DPBS olmayan memeli tripsin alternatifi (detaylar için malzemeler listesine bakınız) 3-4 ml 2-5 dakika geri doku kültürü kabinin içine yerleştirin. Bir aydınlık alan mikroskobu kullanarak, hücrelerin tümü alt yüzeyinden öncesinde davanın müstakil hale olmadığını kontrol edin.
  5. Furthe inhibeDPBS 6 ml tripsin alternatif seyreltilmesiyle r enzimatik aktivitesi. Pipet yukarı ve şişenin alt yüzeyin durulanması için 10 ml serolojik pipet kullanarak ve mekanik herhangi bir hücresel agrega ayırmak için aşağı. Hücreler aspire sırasıyla etiketlenmiş 15 ml santrifüj tüpleri içine yerleştirin. 4 ° C (Şekil 1C) 5 dakika boyunca 550 xg (maks RCF) hücreleri aşağı spin.
  6. Süpernatantı ve yavaşça un-desteklenmiş DMEM 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için P-1000 mikropipet ile yukarı ve aşağı iyice hücreleri pipetle emin olun.
  7. Tümör hücre süspansiyonu 2 ul ilave edilir, 0.6 ml bir konik propilen mikrotüp içine un takviye edilmiş DMEM içinde 18 ul yerleştirerek 1.6 oluşturulan elde edilen hücre süspansiyonu 1:10 seyreltme olun. Yukarı pipet ve iyice hücreleri homojenize bir P-10 mikropipet kullanarak aşağı.
  8. 10 ul ekleyin ve# 160; ayrı 0.6 ml konik polipropilen mikrotüpe 1.7 oluşturulan 01:10 tümör hücre seyreltme, daha sonra tüp Trypan mavi leke 10 ul ekleyin. İyice bir P-10 mikropipet ile karıştırın ve hava kabarcıklarını (Şekil 1D) tanıtmak için dikkatli olmak hemasitometre üstüne yerleştirilen bir cam kapak kayma altında sonuçtaki tümör hücresi / Trypan mavi solüsyon 10 ul ekleyin.
    1. Verilen hemasitometre ile ilişkili spesifik protokole göre 10X objektif kullanarak parlak alan mikroskobu ile hücre sayımı. Orijinal 1 ml kanın doğru hücre tahmini için hücrelerin hazırlanması sırasında yapılan orijinal tümör hücre süspansiyonu 20 kat seyreltme faktörü emin olun. Hücrelerin toplam sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın: toplam hücre / ml = [((Σcells kare başına sayılır) / sayılan kareler arasında) 20 (yani, seyreltme faktörü) 10.000 hücre / ml x x].
  9. Gün sonradeneyde kullanılan her bir hücre hattı için hücrelerin toplam sayısı etermining, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 550 x g'de (maksimum RCF) aşağı döndürün. Aşağıdaki formüle göre her bir hücre hattı için 3 x 10 4 hücre ul 1 'e göre bir konsantrasyon elde etmek için BM-takviye edilmiş DMEM uygun bir hacmi ile hücrelerin süpernatant (ler) çıkarın ve tekrar süspansiyon (hücrelerin toplam # / 30.000).
  10. Buz üzerinde, sırasıyla etiketlenmiş 0,6 ml konik polipropilen tüpler ve yerine her bir hücre hattı (Şekil 1E) eşdeğer bir hacmi yerleştirin. Ayrı T75s önceden numaralı seribaşı olmasaydı, her hücre hattını anlatmaya devam bazı hücreleri kaydetmek emin olun.

C57BL / 6J Farelerinin striatumu içine glioma hücrelerinin stereotaktik Aşı 2. Prosedür

  1. Aşağıdaki gibi cerrahi öncesi cerrahi anestezi, analjezi ve anestezi bozma çözümlerini çalışma hazırlayın:
    1. Ketamin / deksmedetomidin s içinurgical anestezi: steril% 0.9 NaCl enjeksiyon 10 ml şişeden 1.4 ml çıkarın ve ketamin hidroklorür 100 mg / ml stok çözeltisi, 600 | il ve elde etmek için deksmedetomidinin hidroklorür 0,5 mg / ml stok çözeltisi 800 ul ile değiştirin ketamin hidroklorür (6 mg / ml) ve deksmedetomidin hidroklorür (0.04 mg / ml) önceden karıştırılmış bir çalışma çözeltisi.
    2. Buprenorfin analjezi için: steril% 0.9 NaCl enjeksiyon 10 ml şişeden 1 ml çıkarın ve 0.03 mg / ml çalışma çözeltisi elde etmek üzere, tek bir 0.3 mg / ml stok buprenorfin hidroklorür ampul tüm 1 ml hacim ile değiştirin.
    3. Atipamezol cerrahi anestezi ters çevrimi için: steril% 0.9 NaCl enjeksiyon 10 ml şişeden 1 ml çıkarın ve 0.5 mg / ml çalışma çözeltisi elde etmek için atipamezol hidroklorür 5 mg / ml stok çözeltisi, 1 ml ile değiştirin.
  2. Fare hayatta kalma s için onaylanmış bir yerde çalışmakurgery, daha sonra çalışma için gerekli olan yeterli 8-10 haftalık dişi C57BL / 6J fareleri (GL26 glioma ile singeneik) elde (Şekil 2A) 'de gösterildiği gibi Otoklavlanmış veya boncuk sterilize cerrahi aletler ve diğer reaktifler kurarak başlar; Gıda ve su onların sürekli erişim sağlamak.
  3. 75 mg / kg ketamin ve 0,5 mg / kg deksmedetomidin (20 g bir fare için yaklaşık 250 ul) içindeki bir dozunun verilmesi ile çalışan anestezi çözeltisi tek bir intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile birinci fare anestezisi. Daha sonra, karprofen bir 5 mg / kg deri altından (sc) enjeksiyon vermek (20 g bir fare için yaklaşık 100 ul). Fare Devam öncesinde ayak ve kuyruk tutam olmayan duyarlı olduğundan emin olun.
  4. Cerrahi makası kullanarak, kafatası kürk tıraş. Traş alana povidon-iyot antiseptik solüsyon uygulayın,% 70 izopropil alkol hazırlık pad ile fırçalayın, sonra povidon-iyot antiseptik solüsyon yeniden uygulayın. Daha sonra, Steri küçük bir miktar uygulanırle kurumasını önlemek için her gözün oftalmik merhem petrolatumdur.
  5. Aşağıdaki protokole göre stereotaktik çerçeve içinde kafatası Güvenli:
    1. Dikkatle yavaşça dilini dışarı çekin ve boğulma önlemek için ağız bir tarafa geçmek için kavisli diseksiyon forseps bir çift ile ulaşarak ağzını açın. Forseps stereotaktik çerçeve üzerinde diş çubuğunun anahtar deliğine içine üst iki kesici dişler açık çene yaymak ve rehberlik ağızda süre geri çekmek için izin verin. İlgili vidalarını ayarlayarak yatay ya da dikey döner gelen diş çubuğunu sabitleyin. Farenin kafatası tezgah üst düzey olduğundan emin olun.
    2. Güvenli kırma önlemek için kafatası üzerinde çok fazla içe baskı uygulamak için dikkatli olmak kafatası kemiklerinin postorbital karşı kulak çubukları yerleştirin.
    3. Burnu üzerinde burun çubuğunu yerleştirin ve tam oturana kadar aşağı doğru sıkın. Hafif basınç uygulayarak baş dikey / yatay hareket olduğunu kontrol edinBir başparmak ve işaret parmağı ile. Düzgün bir stereotaktik çerçeve içine yerleştirilen bir fare (Şekil 2B) 'de gösterilmiştir.
    4. Bir neşter bıçak kullanarak, oksipital kemik, frontal kemik kafatası üzerinde 1 cm orta hat kesi yapmak. Colibri retraktörler kullanarak kesi cildi geri çekin.
    5. Şirketinden bregma konumuna (Şekil 2C), yukarıda stereotaktik çerçeve dikey koluna bağlanmış bir 33 G iğne ile donatılmış mikrolitre şırınga indirin. Oradan, tümör implantasyonu için hedef sitesine ulaşmak için iğne 0,5 mm AP konumunu, 2,5 mm ML ayarlayın. Yavaşça periost excoriating bu yerini belirlemek için 26 G iğne ile donatılmış bir 1 ml tüberkülin şırınga kullanın.
    6. Bir 1/32 "(0.8 mm) biti ile donatılmış bir akülü hassas güç matkap kullanarak altta yatan duramateri ulaşana kadar hedef mahallinde kafatası içine bir delik delin. Delme birlikte, dri uzaklaştırılarak elde edilmiş, aralıklı basınç uygulamakKafatası yüzeyinden ll biraz aksi altta yatan beyin dokusunu delinmesi matkap yol açabilir aşırı ısı ve kuvvet önlemek için.
  6. Iğne tıkanmış olmadığından emin olmak için bir 1.7 ml konik polipropilen mikrotüp% 0.9 NaCl ile mikrolitre şırınga yıkayın. Yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon tümör hücreleri birkaç kez içeren 0.6 ml konik polipropilen mikrotüpü fiske.
  7. Herhangi bir hava kabarcığı şırınga içine sağlanması mikrolitre şırınga içine hücre 2 ul hazırlayın. Şırınga kalan tümör hücrelerinin tam 1 ul bırakarak% 70 izopropil alkol hazırlık ped üzerine hücrelerin 1 ul koyun.
  8. O duramateri dokunana kadar, daha sonra -3.5 mm ventral beyin içine iğne tanıtmak ve 0,5 mm geri aşağı iğne getir. Yavaş yavaş ve düzgün bir şekilde 1-2 dakikalık bir süre boyunca şırınga itme hücreleri sağlar.
  9. Hücreler Settl izin ver5 dakika önce yavaşça iğneyi çekilmesi için enjeksiyon yerinde e. Temiz bir% 70 izopropil alkol hazırlık pad ile iğne ucu herhangi pıhtılaşmış kan veya beyin konuyu silin. İğneyi durulayın ve iğne sonraki enjeksiyon için tıkalı olmadığından emin olmak için adım 2.6 den% 0.9 NaCl ile iyice şırınga.
  10. Colibri retraktörler çıkarın ve üç 3-0 naylon monofilament sütür kullanılarak kafa derisi sütür. Stereotaktik çerçeve fare çıkarın ve hidroklorür deri altından (sc) buprenorfin, 0.1 mg / kg tatbik (yaklaşık 20 g bir fare için 0.03 mg / ml çalışma çözeltisi 67 ul) 2.5 mg, ardından / kg atipamezol hidroklorür intramüsküler (im) ameliyat sonrası ağrı ve anestezi tersine çevrilmesi için (20 g bir fare için 0.5 mg / ml çalışma çözeltisi, yaklaşık 100 ul). Geri kurtarmak için bir ısıtma lambası altında kendi kafeslerine ameliyat sonrası fareler yerleştirin.

3. Fare Transcardial PerfusBeyin iyon ve Hasat

  1. Aşağıdaki protokole göre heparinize Tyrode çözeltisi hazırlayın:
    1. 1 L cam vida kapaklı bir depolama şişeye, bir manyetik karıştırma çubuğu koyun ve ultra saf deiyonize su ile hacme kadar doldurun. , Bir karıştırma levhası üzerinde bir şişe yerleştirin.
    2. Karıştırılarak tartılır ve cam şişe için aşağıdaki kimyasal ekleme: 8 g sodyum klorür (NaCl), 0,264 g kalsiyum klorür (CaCl2 • 2H 2 O), 0.05 g sodyum fosfat monobazik (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1.0 g D-glükoz (Cı 6H 12 O 6), 1.0 g sodyum bikarbonat (NaHCO3), 0.2 g potasyum klorür (KCl). Tuzları çözmek için, daha sonra Tyrode çözeltisine heparin sodyum bir 1,000U / ml stok çözeltisi 100 ul izin verin.
    3. Karıştırma plaka kabını çıkarın ve bir manyetik çubuk kullanılarak karıştırma çubuğu ayıklayın. 4 ° C'de heparinize Tyrode çözümü Mağaza° C.
  2. Aşağıdaki gibi terminal anestezi için bir çalışma çözeltisi hazırlayın:
    1. Ketamin / ksilazin terminali anestezi için: steril% 0.9 NaCl enjeksiyon 10 ml şişeden 1.360 ul çıkarın ve ketamin hidroklorür 100 mg / ml stok çözeltisi 1.200 ul ve xylazine bir 100 mg / ml stok çözeltisi 160 ul ile değiştirin hidroklorür ketamin hidroklorür (12 mg / ml) ve ksilazin hidroklorür (1.6 mg / ml) oluşan karışık bir çalışma çözeltisi elde edildi.
  3. Steril plastik kapta aşırı saf deiyonize su (3.93x) 264 ml 90 ml 10x PBS koyarak yoğunluk santrifüj medya mix çözüm hazırlayın. HCI ile pH 7.0-7.2 kadar titrasyon ve 0.22 um'lik bir filtreden filtre sterilize. 4 ° C'de saklayın.
  4. Malzemeler listesini (bkz yoğunluk santrifüj ortamı 30 ml yoğunluk santrifüj ortam karışımı çözeltisi 18 ml birleştirerek% 70 yoğunluk santrifüj ortamı hazırlamak50 ml'lik bir polipropilen santrifüj tüpüne detayları) dir. 4 ° C'de saklayın, ama kullanımdan önce oda sıcaklığına getirmek.
  5. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 10.4 ml% 70 yoğunluk santrifüj ortamı ile DPBS 9,6 ml birleştirilerek% 37 yoğunluk santrifüj ortamı hazırlar. 4 ° C'de saklayın, ama kullanımdan önce oda sıcaklığına getirmek.
  6. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne DPBS (~% 1 FBS), 50 ml FBS 500 ul yerleştirerek akış tamponu hazırlayın. 4 ° C'de mağazasında Mağaza
  7. Buz parçaları ile kapasite bir 4.5 L poliüretan buz kovası doldurun.
  8. 10 mg / ml DNase I stok çözelti 01:10 ve 50 mg seyreltilmesi ile 1 mg / ml kollajenaz ve 1 mg / çalışma beyin örnek başına 1 ml için yeterli miktarda DNase I ml'lik bir Birleştirilen çözelti Yap / Tek bir 15 ml'lik polipropilen santrifüj tüpüne steril DPBS ml kollajenaz stok solüsyonu 01:50. Yavaşça ayağa pipetleme ve P-1.000 mikropipet ile aşağı çözüm karıştırın. Polyureth buz üzerinde saklayınadım 3,7 ane kova.
  9. İki 7 ml cam Dounce doku taşlama edinin. Biri "NT" ve "gal1i" öteki etiketleyin. Buz kovası doku öğütücüler yerleştirin ve her DPBS 1 ml ekleyin.
  10. Buz kovası çalışma ve yerinde her bir fare beyin konuyu toplamak için yeterli 15 ml santrifüj tüpleri edinin.
  11. Buz kovasının içine üç 50 ml santrifüj tüplerine arasında DPBS Yeri ~ 150 ml.
  12. Çalışmada her bir fare için yeterli polistiren altıgen tartı yemekleri (üst iç çapı (ID) 115 mm, taban kimliği 85 mm, 203 ml hacim) edinin. Diseksiyon ve fare beyinleri öğütüldükten için komple set kadar gösterilir (Şekil 3A)
  13. Seçilen zaman noktalarında, 150 mg'lık tek bir ip enjeksiyonunu kullanılarak çalışma ilk tümör taşıyan fare anestezi / kg ketamin hidroklorür ve 20 mg / kg ksilazin hidroklorür (birleşik 12 mg / ml ketamin yaklaşık 250 ul / 1,6 mg 20 g fare için çözüm çalışma / ml ksilizin) derin anestezi uyardığı. Fare öncesinde takibata ayak ve kuyruk tutam olmayan tepki olduğundan emin olun.
  14. Önceden hazırlanmış Tyrode çözeltisi Al ve terminal hayvan cerrahi prosedürler adanmış bir laminer akış başlığı içine koyun. Tyrode çözeltisi bir karbojen tankına bağlı olarak gaz geçirmeyen bir polimerik borunun yerleştirin. Çözelti içine sürekli kabarcık% 95 O 2 /% 5 CO 2 carbogen izin tank vanasını açın.
  15. Peristaltik bir pompa bağlı ilave bir gaz geçirmeyen polimerik boru ucuna bir 20 G alüminyum göbek künt iğne takın. Tyrode çözeltisi içine bir peristaltik pompa diğer ucunda boru yerleştirin ve boru oksijenli ve heparinize Tyrode çözeltisi ile dolmasını sağlamak için pompa açın. Fare transcardial perfüzyon için ayarlanmış (Şekil 3b) 'de gösterilmiştir.
  16. Dört 26 G iğneler kullanarak, aşağı pinlaminer akış kaputu bir bertaraf emici havlu ile örtülü bir ekstrüde polistren köpük blok üzerinde ön ve arka pençeleri ile anestezi fare ventral yüzü yukarı.
  17. Periton boşluğuna yukarıda cilt künt diseksiyon forseps bir çift kullanarak ve diseksiyon makas büyük bir çifti de sonlandırmak için sternum de çatallanan sonra, diyafram delinme cephalically kesme, periton duvar nüfuz ederek bir "Y" kesi yapmak kullanarak kavramak Sağ ve sol aksillada.
  18. Sternum kelepçe ve farenin sol omzunun üzerinden göğüs kafesini yansıtmak için bir hemostat kullanın. Künt diseksiyon forseps çifti ile perikard çıkarın.
  19. Oksijenli ve heparinli Tyrode çözümü (kabaca 2,3-2,5 ml / dak) sabit bir damla başlamak için peristaltik pompa açın.
  20. Kalbin sol ventrikül içine künt iğne takın. Kan kaybından sağlamak için sağ atrium snip diseksiyon makas küçük bir çifti kullanmak (Şekil3C).
  21. Karaciğer ve akciğerler tamamen nedeniyle kan eksikliği blanched kadar Tyrode çözümü iyice fare dolaşım sistemini serpmek için izin verin. Kan hiçbir brüt tutarlar sol ventrikül 20 G alüminyum göbek künt iğne çıkarmadan önce sağ atrium çıkmak için devam etmesini sağlamak.
  22. Ekstrüde polistiren köpük blok fare sabitlemesini ve aşağı fare ventral yüzü çevirin. Diseksiyon makas büyük çiftlerini kullanarak, boyun seviyesinde vücudun geri kalan kafasını ayırın.
  23. Diseksiyon makas küçük bir çifti kullanarak, kafatası açığa amacıyla burun yolunda ileriye çalışan oksipital kemiğin başlayan orta hatta kafa derisi kesilir.
  24. Bir başparmak ve işaret parmağınızı kullanarak kafatasının her iki tarafında cilt çekin ve güvenli kafatası tutun. Tamamen dorsal ve lateral maruz oksipital kemiğin başlayan kafatasının kırmaya ve ileriye çalışmak için kemik rongeurs bir çift kullanınbeyin yüzeyler. Beyin hasarı en aza indirmek için dikkatli olun.
  25. Kranial kemikler çıkarıldıktan sonra, fare ventral yüzü yukarı başını çevirip kafatası onu kurtarmak için beynin tabanındaki kranial sinirler kesmek için diseksiyon makas küçük bir çifti kullanın.

Glioma nüfuz eden PBMC 4 İzolasyon

  1. Temiz tek kenarlı jilet kullanarak, iki hemisfer bisect beynin merkezinde aşağı sagital kesim yaparak tümör içeren beyin alanı izole. Aşağı ipsilateral hemisfer medial tarafını çevirin ve beyincik ve tümör implant (Şekil 4A) içeren hedef doku izole etmek için koku ampul seviyelerinde iki koronal kesim yapmak. Kontralateral hemisferde bir eşdeğer kısmı ayrıca izole edilmiş ve bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir.
  2. 1 ml içeren sırasıyla etiketli cam Dounce doku değirmeni içine hedef dokuya yerleştirin; DPBS, doku başlangıçta bozmak için 7 kez tüm yol aşağı pistonu ve büküm itin. Piston sıvı doku değirmeni dibine geri yerleşmek için izin kaldırın. Üç kere bu adımı yineleyin; ancak sadece doku triturating üzerine önlemek için son tekrar sırasında pistonu önümüzdeki iki tekrarı sırasında 4 kez ve 3 kez çevirin.
  3. P-1000 mikropipet kullanılarak, ardışık olarak doku öğütücü içine durulama pistonun yanları boyunca (3.11 hazırlandı) buz gibi soğuk DPBS üç 1 mi miktarlar geçerlidir.
  4. Pipetleme toz haline beyin madde yeniden süspanse edin ve aşağı doğru ve buz üzerinde, etiketlenmiş bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne koyun. Buz soğukluğunda DPBS ilave 1 ml Dounce doku öğütücü kenarlarını durulayın ve aynı 15 ml santrifüj tüpüne eklenmektedir. Tüm numuneler işlendikten kadar buz üzerinde ufalanarak beyin madde içeren tüm tüpler tutun.
  5. Yineleyin çalışmasında her fare için 3.13-3.25 ve 4.1-4.4 adımları tekrarlayın.
  6. Tüm örnekler ha kez4 ° C'de 20 dakika boyunca 740 x g'de (maksimum RCF) 15 ml santrifüj tüplerine içinde öğütüldü, beyin maddeyi spin işleme ettik.
  7. 10 ml'lik bir serolojik pipet ve pipet tabancası ile Süpernatantı ve önceden hazırlanmış kolajenaz / 1 ml 'de tanecik haline beyin madde tekrar süspansiyon DNase I P-1000 kullanılan enzimleri sindirimi. 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde bir test tüpü raf ve yerine 15 ml santrifüj tüpleri yerleştirin.
  8. Yavaşça doku ayrıştırılmasına yönelik çabalara kolaylaştırmak için tüpler hafifçe vurarak kuluçka dönemi boyunca iki kez numune çalkalayın.
  9. Sindirim enzimleri sulandırmak için her bir tüpe 10 mL serolojik bir pipet kullanarak buz-soğukluğundaki DPBS 6 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı tekrar süspansiyon için, ve buz üzerinde yeni etiketli 15 ml santrifüj tüpleri içine steril 70 mikron naylon örgü filtreler aracılığıyla toplam hacimleri filtre.
  10. Bir elde etmek için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 740 x g'de (maksimum RCF) beyin hücre süspansiyonu SpinTek hücre topağı (Şekil 4B). Santrifüj 15 ml tüpler çıkarıldıktan sonra buz üzerine koyun ve bir sonraki adım için hazırlık yaklaşık 21 ° C'ye santrifüj ayarını sıcaklığını arttırın.
  11. Tam beyin hücreleri içeren her tüpten çıkarın ve ilk olarak bir P-1000 mikropipet kullanılarak% 70 yoğunluk santrifüj ortam 1 ml pelet tekrar süspansiyon. Daha sonra 10 mi serolojik bir pipet kullanarak her bir tüpe,% 70 yoğunluk santrifüj ortam ilave 4 mililitre ekleyin. Güvenli üzerindeki vidalı kapakları ve hafifçe birkaç kez borular için ters çevirerek hücre süspansiyonu homojenize.
  12. RT'de bir test tüpü raf% 70 yoğunluk santrifüj buz medya ve yerinde yeniden süspanse beyin hücrelerini içeren 15 ml santrifüj tüpleri çıkarın. Bir kerede bir dikkatle ac oluşturmak üzere bir P-1000 mikropipet ile% 70 yoğunluğu santrifüj medyanın 5 ml üzerine 2 ml yoğunluk santrifüj medya çözeltisinin% 37 bindirmeİki yoğunluk santrifüj medya katmanları (Şekil 4C) arasında yağsız arayüzü.
    1. Ayrım daha az belirgin hale geldiğinde kolayca, santrifüj sonra tespit edilebilir, böylece arabiriminin konumunu belirtmek için ince uçlu kalem kullanın.
  13. Arayüzü bozmamak için hiçbir break ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 740 xg (maks RCF) 15 ml santrifüj tüpleri aşağı doğru döndürün.
  14. Santrifüj işleminden sonra, dikkatli bir şekilde, lipid tabakanın atlanmasıyla, yan boyunca tüp içine, bir P-200 mikropipet sokulması iki yoğunluk santrifüj ortam katmanları (Şekil 4D) arasındaki arayüzde birikmiş PBMC'ler toplar.
    1. Bir kez PBMC bandın düzeyinde yavaşça% 70 yoğunluk santrifüj medya tabakasının yüzeyinden 200 ul özü ve buz üzerinde, sırasıyla etiketlenmiş polipropilen FACS tüpü içine koyun. Örnek başına 400 ul'lik bir toplam hacimde bir kez tekrarlayın.
  15. Yeterli, daha sonra, yoğunluk santrifüj ortamı seyreltilmiş, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 660 x g'de (maksimum RCF) hücreleri aşağı dönmeye PBMC 400 ul ihtiva eden her bir FACS tüpü akış tamponu 3 ml ekleyin.

Glioma nüfuz eden PBMC 5. ile immün

  1. Deneysel PBMC örnekleri analiz önce, taban kapıları oluşturmak için bir tek, bağımsız hücre yüzeyi izotip kontrol deneyini gerçekleştirmek uygun glioma süzücü PBMC'ler değerlendirilmesi için özel bir akış sitometrik veri analizi şablonu içinde sabit PMT voltajlarının bir dizi ile ilişkili Aşağıdaki protokole:
    1. Tümör büyümesinin 72 saat sonra 2. bölümde izah edilen prosedüre göre GL26-Cit-NT GL26-Cit-gal1i ve diğer bir C57BL / 6J fare sokmak iki fareler ötenazi ve yöntemlere uygun olarak, tümör-süzücü PBMC izole bölümler 3 ve 4 boyunca sıraladı.
    2. İki PBMC örnekleri birleştirin (NTnd bir hacim (örneğin, 100 ul) halinde gal1i), daha sonra, üç FACS tüpler (örneğin, 33.3 "CD45 izotip" etiketli tüp başına ul), "Gr-1 / CD11b izotip" ve "NK1 arasında eşit örnek bölün. 1 izotip ". (A, 1 her: 100 seyreltme ve akış tamponunda 200 ul toplam hacmine seyreltilmiş) Aşağıdaki antikor ekleyin, sırasıyla etiketlenmiş FACS tüpler: "CD45 izotip" Alexa Fluor 700-konjüge sıçan IgG2b, k (klon: RTK4530 ) "Gr-1 / CD11b izotip" Alexa Fluor 700-konjüge sıçan anti-fare CD45 (klon: 30-F11), PE-konjüge sıçan IgG2b, κ (klon: eB149 / 10H5) ve PerCP / Cy5.5 bayır fare IgG2b, κ (klon: RTK4530); "NK1.1 izotip" Alexa Fluor 700-konjüge sıçan anti-fare CD45 (klon: 30-F11), PE-konjüge sıçan anti-fare Gr-1 (klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5 konjuge edilmiş sıçan anti-fare CD11 b (klon M1 / ​​70) ve APC-conjugated fare IgG2a, κ (klon: eBM2a).
    3. PBMC 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde immunolabel izin verin. Hafifçe karıştırın kuluçka dönemi boyunca bir kez yarım tüpleri Flick. Akış 1 ml tampon ile yıkanır, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 660 x g'de (maksimum RCF) durması ve akış tamponunda 200 ul PBMC'ler içeren her FACS tüpü tekrar süspansiyon.
    4. 85 mikron entegre nozul ile donatılmış bir akış sitometresinin kullanarak, bir başlangıç ​​CD45 aralık kapısı kurmak için önce "CD45 isotip" tüp analiz. Sonraki girdi olarak tek gerçek CD45 + hücreler kullanılarak bir temel Gr-1 / CD11b kadran kapısı kurmak için "Gr-1 / CD11b isotip" tüp çalıştırın. Son olarak, tek gerçek CD45 girişi olarak + / Gr-1 düşük / CD11b +/- hücreleri kullanılarak bazal NK1.1 aralık kapısı kurmak için "NK1.1 izotip" tüp çalıştırın.
  2. Gelecekteki tüm deneysel An aşağıdaki yordamı kullanınalysis:
    1. (GzmB izotipi artı 1) 200 ul numune başına hacmi elde etmek için akış tamponu içinde hücre yüzey antikor 100 seyreltme: 1 arasında yeterli bir miktarını sağlayın Alexa Fluor 700-konjüge sıçan anti-fare CD45 (klon: 30-F11 ), PE-konjüge sıçan anti-fare Gr-1 (Klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5 konjuge edilmiş sıçan anti-fare CD11 b (klon: / 70 + -1), APC-konjuge fare anti-fare NK1.1 (klon: PK136).
    2. Menisküs sadece hücre kayıpları önlemek için her FACS tüp (~ 50 ul) alt üzerindedir kadar dikkatlice 4,15 aşağı bükülmüş PBMC'lerin süpernatant kaldırmak. P-200 mikropipet ile artık akış tampon kullanarak her FACS tüp içinde PBMC'leri süspanse ve her FACS tüp (örneklerin 1 / #) hacim değerini kaldırmak ve "toplanmış izotip" etiketli yeni bir FACS tüp içine birleştirmek.
    3. Her PBMC örnek 5.2.1 hazırlanan hücre yüzeyi antikor kokteylinin 200 ul ekle. PBMC 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde immunolabel izin verin. Flick tKuluçka dönemi boyunca yarım hafifçe karıştırın keresinde tüpler.
    4. Akış tamponu 1 ml yıkayın; 660 xg (maks RCF) aşağı dönmeye 4 ° C'de 10 dakika x.
    5. Karanlıkta buz üzerinde 15 dakika süre ile ticari olarak temin edilebilir formalinle göre sabitleyici 200 ul PBMC'ler (ayrıntılar için maddeler listesine bakınız) içeren tüm tüpler FACS yeniden süspanse edin. Hafifçe karıştırın kuluçka dönemi boyunca bir kez yarım tüpleri Flick.
    6. Bir ticari olarak temin edilebilir 1 x permeabilizasyon / yıkama tamponu 1 ml (ayrıntılar için maddeler listesine bakınız) ile yıkayınız ve 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 660 x g'de (maksimum RCF) aşağı doğru döndürün.
    7. Numune başına 200 ul hacim elde etmek için: (GB11 klon), 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu içinde hücre içi antikorlar Pacific Blue-konjuge fare anti-fare GzmB 100 seyreltme: PBMC aşağı iplik olup, bunlara 1 yeterli miktarda hazırlanır.
    8. Pacific Blue-con 100 seyreltme: Ayrı bir tüp içinde, bir 1, tek bir 200 ul hacim hazırlanmasıjugated fare IgG1, κ (klon: MOPC-21) izotip kontrol antikoru.
    9. Izotip antikorlarının 100 seyreltme: 1 200 ul hacimde "toplanmış izotip" etiketli tek FACS tüpü anti-fare GzmB antikorlarının 100 seyreltme ve tekrar süspansiyon: 1 200 ul deney PBMC numunelerin her yeniden süspanse edin.
    10. Tüm PBMC örnekleri 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde immunolabel izin verin. Hafifçe karıştırın kuluçka dönemi boyunca bir kez yarım tüpleri Flick.
    11. Akış tamponu 1 ml yıkayın; Analiz için akış tamponu 200 ul 4 ° C ve tekrar süspansiyon PBMC 10 dakika boyunca 660 x g'de (maksimum RCF) aşağı doğru döndürün.
    12. Daha önce bölüm 5.1 22 yılında kurulan glioma-infiltre 85 mikron entegre meme kullanılarak PBMC'leri ve kapıları ve PMT voltajlarını analiz sitometrik akış. Sitometresi glioma-infilt toplam sayısının adil bir karşılaştırma sağlamak için akışı üzerinde her numunenin tüm hacmini çalıştırmak emin olunHer bir numune derecelendirme PBMC'lerin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki yolluk strateji tipik bir deney için kullanılır: FSC-A SSC-A vs → SSC-H vs SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 vs vs sayım → Gr-1 vs CD11b → saymak vs NK1.1. Kapıları daha sonra GzmB ekspresyonu (Şekil 5A) göre tabakalı Gr-1 + / CD11b + miyeloid hücreleri ve NK1.1 + NK hücreleri yerleştirilir. NK1.1 + NK hücreleri ve Gr-1 + / CD11 b SSC-A NK hücrelerinin küçük lenfoid ve miyeloid hücreler boyutu nispeten büyük boyutu teyit edin FSC A üzerine deneyl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, erken fare beyin tümör mikro sızmış PBMC izole edilmesi ve akış sitometrik analiz için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Glioma hücre süspansiyonları stereotaksi fare beyninin striatumu içine aşılanan deneye ile belirtilen bir konsantrasyonda oluşturulur. Fareler daha sonra deney tasarımı ile belirtilmiş önceden belirlenmiş zaman noktalarında itlaf edilmiş ve beyinleri hasat edildi ve florokrom-eşlenik birincil antikor kombinasyonları ile immunolabeled edilir glioma süzücü PBMC izole etmek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) MGC R01-NS074387, R01-R21-NS057711 ve NS091555 hibe ve / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; NIH / NINDS PRL için R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21-NS082311 ve NS084275 verir; Leah Mutlu Kalpler gelen hibeler, MGC ve PRL layık Michigan Kapsamlı Kanser Merkezi'nde Üniversitesi; Nöroşirürji Tıp Michigan Okulu Üniversitesi Anabilim Dalı; NIH hibe 2UL1-TR000433 tarafından desteklenen Klinik Michigan Enstitüsü ve Sağlık Araştırması; NIH / NCI (National Cancer Institute) hibe T32-CA009676 tarafından desteklenen Michigan Üniversitesi Kanser Biyolojisi Eğitim Hibe; NIH / NINDS tarafından desteklenen Klinik ve Temel Nörobilim Michigan Eğitim Üniversite T32-NS007222 hibe; ve NIH / NIGMS (Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü) tarafından desteklenen Michigan Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı Üniversite T32-GM007863 hibe. YazarlarDr Karin Muraszko ve Nöroşirürji Anabilim alınan akademik liderlik ve destek için müteşekkir yeniden; M. Dahlgren, D. Tomford ve mükemmel idari destek S. Napolitan için; üstün teknik yardım için, M. Dzaman için; ve bir Zeiss 3D Taramalı Elektron Mikroskobu satın alma yönünde cömert destek için Phil F. Jenkins için. Biz de beyin mononükleer hücrelerin izolasyonu için yoğunluk santrifüj medya aracılı stratejinin değiştirilmiş bir versiyonu çizilmiş olan Harvard Tıp Okulu'nda Kuchroo laboratuvar kabul etmiş sayılırsınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco' Eagles MediumGibco12430-054'ün4.5g/L D-glikoz, L-glutamin, 25 mM HEPES ve fenol kırmızısı ile modifikasyonu 
Dulbecco' s Fosfat tamponlu Salin Gibco14190-144 kalsiyum klorür veya Magnezyum klorür olmadan
Fetal sığır serumuOmega Scientific Inc.FB-11
Penisilin Streptomisin Gibco15140-12210.000 U/ml Penisilin; 10.000 μ g/ml Streptomisin 
L-glutaminGibco25030-081200 mM
G418 sülfat ve nbsp;Omega Bilimsel A.Ş.GN-04
Puromisin dihidroklorür ve nbsp;  Streptomyces albonigerSigma-AldrichP8833
memeli olmayan tripsin alternatifi Thermo ScientificSV30030.01DPBS'de EDTA 
Faz kontrastlı hemositometreSigma-AldrichZ3596290,1 mm derinliğinde
Tripan mavisi lekeGibco15250-061
Steril% 0.9 NaCl enjeksiyonu, USPHospiraNDC: 0409-488810 ml şişeler
0.6 ml konik polipropilen mikrotüplerGenesee Scientific22-272
Atipamezol hidroklorür enjeksiyonuOrion PharmaNDC: 52483-62985 mg / ml çözelti
Ketamin hidroklorür enjeksiyonuFort DodgeNDC: 0409-2051100 mg / ml çözelti
Deksmedetomidin hidroklorür enjeksiyonuZoetisNDC: 54771-28050.5 mg / ml çözelti
Ksilazin hidroklorür enjeksiyonuLloydNDC: 61311-481100 mg / ml çözelti
Carprofen enjeksiyonuPfizerNDC: 61106-850150 mg / ml çözelti
Buprenorfin hidroklorür enjeksiyonuReckitt BenckiserNDC: 12496-07570.3 mg / ml ampul
1 ml tüberkülin şırıngaları ve nbsp;Covidien8881501400
26G x ½ (0,45 mm x 13 mm) şırınga iğneleri BD305111
Cerrahi makaslar3M9661
Providon-iyot çözeltisiAplicare82-217NDC: 52380-1905
Steril vazelin oftalmik merhem DechraNDC: 17033-211
%70 izopropil alkol hazırlama pedleriKendall6818
Steril gazlı bezCovidien8044dokumasız, 4" x 4", 4 katlı 
1.7 ml konik polipropilen mikrotüplerGenesee Scientific22-281
Fare stereotaktik çerçevesiStoelting51730
Cerrahi lambaPhilips BurtonCS316WCoolspot II Değişken Spot Işığı
Kavisli diseksiyon forsepsTed Pella, Inc.5431
Colibri ekartörleri FST17000-03
Akülü hassas elektrikli matkapDremel 1100-01Stylus modeli; 7,2 Volt Lityum-İyon Bağlantı İstasyonu
Gravür KesiciDremel1051/32" veya 0,8 mm uç çapı
Mikrolitre şırıngaHamilton75Hamilton Mikrolitre Şırıngalar 700 serisi; 5 & mu; l hacim
Mikrolitre şırınga iğneleriHamilton7762-0633 G, küçük göbek RN NDL, 1.5 inç, nokta stili 3, 6 / PK
Ethilon 3-0 siyah monofilament naylon sütürler ve nbsp;Ethicon1663
Manyetik karıştırma çubuğuVWR74950-2967,9 mm çap x 50 mm uzunluk (5/16" çap x 2" uzunluk)
1 L cam vidalı kapaklı saklama şişesiCorning1395Tip 1, Sınıf A borosilikat cam
Heparin sodyum SagentNDC: 25021-4001.000 U/ml çözelti
Peristaltik pompaCole Parmer Instruments Group77200-60Master Flex Easy Load II konsol sürücüsü
sıkıştırılmış karbojen (%95 O2 %5 CO2)yerel satıcıdan temin edilebilirN/Atipi, büyük silindir 
20 G x 1 ve frak12; » alüminyum göbek künt iğnelerKendall88812023630,9 mm x 38,1 mm
Poliüretan buz kovasıFisherbrand02-591-45Kapasite: 0.152 oz. (4.5L)
Kollajenaz (Tip I-S)Clostridium histolyticum'danSigma AldrichC1639
Deoksiribonükleaz IWorthington Biyokimya A.Ş.LS002007>mg kuru ağırlık başına 2.000 Kunitz birimi
Antistatik polistiren altıgen tartı kaplarıTed Pella, Inc.20157-3üst iç çap 115 mm, taban iç çapı 85 mm, 203 ml hacim 
Paslanmaz çelik tek kenarlı tıraş bıçakları Garvey40475
Kemik rongeurlarıFST16001-15
HemostatFST13014-14
Büyük diseksiyon makasıTed Pella Inc.1316
Küçük diseksiyon makasıFST14094-11
Künt uçlu forsepsTed Pella Inc.13250
7 ml cam Dounce doku öğütücüKontesKT885300-0007
Percoll Yoğunluk Santrifüj Ortamı GE HealthcareGE17-0891-01
10 ml serolojik pipetlerGenesee Scientific12-104tek kullanımlık; steril
70 & mu; M Steril Naylon Mesh Hücre Süzgeçleri Fisherbrand22363548
Alexa Fluor 700 konjuge sıçan anti-fare CD45 (klon: 30-F11)Biolegend103128
APC konjuge fare anti-fare NK1.1 (klon: PK136)eBiosciences 17-5941-82
PE konjuge sıçan anti-fare Gr-1 (klon: RB6-8C5)BD Pharmigen553128
PerCP / Cy5.5-konjuge sıçan anti-fare CD11b (klon: M1 / 70) Biolegend101228
Alexa Fluor 700 konjuge sıçan IgG2b, κ (klon: RTK4530) izotip kontrolü Biolegend400628
APC konjuge fare IgG2a, κ (klon: eBM2a) izotip kontrolü eBioscience17-4724
PE konjuge sıçan IgG2b, κ (klon: eB149/10H5) izotip kontrolü eBioscience12-4031-82
PerCP / Cy5.5 konjuge sıçan IgG2b, κ (klon: RTK4530) izotip kontrolüBiolegend400632
Pasifik Mavisi konjuge fare anti-fare granzim B (Klon: GB11) PasifikMavisi
; (Klon: MOPC-21) izotip kontrolü Biolegend400151
Cytofix/CytopermBD554714
15 ml polipropilen santrifüj tüpleriGenesee Scientific21-103konik tabanlı 
50 ml polipropilen santrifüj tüpleriGenesee Scientific21-108konik tabanlı
12 mm x 75 mm yuvarlak tabanlı polipropilen FACS tüpleri Fisherbrand14-956-1B
FACSAria Özel Sipariş Araştırma Ürün akış sitometresi/hücre sıralayıcıBD 
Sınıf II Biyolojik Güvenlik KabiniThe Baker CompanySG603modeli: SterilGARD III Advance
HyClone HyQTase'den ,   konjuge fare IgG1, &kappa 515403 Biolegend650033

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
  3. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
  4. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  5. Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912(2013).
  6. Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
  7. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
  8. Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
  9. Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
  10. Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
  11. El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
  12. Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
  13. Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10(2009).
  14. Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
  15. Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
  16. Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
  17. Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983(2008).
  18. Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
  19. Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
  20. Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
  21. Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
  22. Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
  23. Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
  24. Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528(2013).
  25. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
  26. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
  27. Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
  28. Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
  29. de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
  30. Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
  31. Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
  32. Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gliyoma nfiltre PBK H creleriBeyin T m r Mikro evresiDoku DisagregasyonuYo unluk Gradyan Santrif gasyonuNK H cre AnaliziMiyeloid H cre nfiltrasyonuStereotaktik T m r mplantasyonuTranskardiyal Perf zyon

İlgili makaleler