Yöntem makalesi

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra

13.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53695

⸱

25 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Bu makalede

Özet

Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. Burada, sonra in vitro iskemi erkek ve kadın yeni doğan yavrular astrosit fonksiyonu altında yatan mekanizmaları araştırmak için cinsiyetli hipokampal astrosit kültürü protokolünün pratik bir yöntem bildiriliyor.

Özet

hipoksi / iskemi (HI) ile ilgili beyin hasarını takiben astrogliasis yenidoğanlarda artmış morbidite ve mortalite bir rol oynar. Son klinik çalışmalar beyin hasarının şiddeti seks bağımlı gibi görünen gösterir ve erkek yenidoğanlarda karşılaştırılabilir beyin hasarı olan kadınlara kıyasla daha ciddi nörolojik sonuçlara yol açan, HI-ilişkili beyin hasarının etkilerine daha duyarlı olduğunu. yalıtmak ve cinsiyette hipokampal astrosit zenginleştirilmiş popülasyonları korumak için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi neonatal HI patolojik sonuçları cinsiyet farklılıklarının hücresel temelini anlamak için esastır. Bu çalışmada, reoksijenasyonun ardından in vitro iskemi, oksijen glukoz yoksunluk bir model maruz cinsiyete spesifik hipokampal astrosit kültürleri oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Daha sonra reaktif astrogliasis immunostai ile incelendiGlial fibriller asidik protein (GFAP) ve S100B için Ning. Bu yöntem ayrıca, yenidoğan HI aşağıdaki erkek ve kadın hipokampal astrositler rolünü incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Giriş

Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) en önemli anahtar oyunculardan biri bulunmaktadır. kanıt Büyüyen vücut astrositlerin rolleri nöronal destek sağlama daha olduğunu gösterir. Aslında, fizyolojik koşullar altında astrositlerin rolleri gibi, merkezi sinir sistemi, kan akışını düzenleyen 2, gelişmekte olan aksonlar 1 göçünü yol sinaptik dokulararası sıvının 3 pH homeostazını sürdürmek ve kan-beyin bariyerinin katılmak gibi çok karmaşık olabilir 4 ve sinaptik iletim 5. Patolojik koşullar altında, astrositler astrositler ve fonksiyon (zedelenmesinden mesafeye göre) morfolojisi, sayı, yer, topografya heterojen bir şekilde 6,7 değişebilir olan reaktif astrogliasis adı verilen bir işlem ile hasara yanıt. belki yenidoğanların morbidite ve mortalite katkıda yenidoğan hipoksik iskemik ensefalopati aşağıdaki görüldü astrogliasis 8 yukarı.

Son klinik ve deneysel çalışmalar, beyin hasarı şiddeti ile karşılaştırıldığında erkek yenidoğanlarda daha ciddi nörolojik sonuçlara neden hipoksi / iskemi (HI) ile ilgili beyin hasarı etkilerine daha duyarlı olduğunu seks bağımlı gibi görünüyor ve olduğunu göstermektedir karşılaştırılabilir beyin yaralanması 9-11 ile kadın. Yaralanma lokalizasyonu gestasyonel yaş ve süresi ve hakaret şiddetine bağlıdır rağmen, hipokampus dönem yenidoğan HI sonra MSS en çok etkilenen bölgelerden biri olan ve hipokampal astrogliasis up-regülasyonu ile teyit edilmiştir arttı Glial fibriller asidik protein (GFAP) yenidoğan HI 7,10,12,13 sonra 3 gün. Astrosit fonksiyonunda cinsiyet farklılıkları serebral iskemi 14,15 sonrasında yenidoğanlarda ve yetişkin kemirgenlerde gösterilmiştir. Buna ek olarak, in vitro iskemi erkek astrositik hassasiyeti yükselttiği cel ile gösterilmiştirKültür 16 dişi kortikal astrositler göre l ölümü.

Cinsiyet farklılıkları in utero başlar ve ölüm 17 kadar devam eder. Son on yılda, hücre kültürü ve in vivo çalışmalarda deneysel koşullarda cinsiyete dahil önemi Tıp ve NIH Enstitüsü vurgu fizyolojik ve patolojik durumlarda 17,18 görülen cinsiyet farklılıkları temel bilgiyi aramak olmuştur . yalıtmak ve cinsiyette hipokampal astrosit popülasyonlarının korumak için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi neonatal HI patolojik sonuçları cinsiyet farklılıklarının hücresel temelini anlamak için esastır. Bu çalışma Oksijen / Glikoz Yoksunluk (OGD) ve reoksijenasyon (REOX), indükleyici aşağıdaki GFAP-immünoreaktif astrositler rollerini değerlendirmek için yeni doğmuş farelerden zenginleştirilmiş cinsiyete özgü hipokampal astrosit kültürleri hazırlamak için teknikler sağlamak için tasarlanmıştırHücre kültürü ortamı, HI. Bu teknik normoksik ve iskemik koşullarda yenidoğan kadın ve erkeklerde hipokampal astrositler ile ilgili tüm hipotezi test etmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım için Kılavuz önerisi ve Kullanımına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. hayvan protokolü Wisconsin-Madison, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Burada sunulan birincil Astrosit Kültür protokolü Zhang Y 19 vd. Ve Cengiz P 20 vd tarafından sunulan protokolleri kabul edilir. Bazı değişikliklerle.

1. Hipokampal Diseksiyon ve Astrosit Kültür

  1. 2 ml Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) her ile dolu buz üzerinde cerrahi makas, düz ince forseps, düz uçlu forseps, kağıt havlu, çöp torbası,% 70 etanol ve 2 diseksiyon yemekler (3.5 cm çapında) de dahil olmak üzere gerekli tüm reaktifleri ve materyalleri hazırlamak . Emin olun cerrahi aletler en vardır (otoklav) prosedür öncesinde ve Astrosit orta kaplama (tüm diğer malzemeleri kullanın steril: DMEM +% 5 at serumu +% 1 ön steril olarak penisilin-streptomisin, at serumu, HBSS,% 0.25 tripsin, cam lamelleri, petri, 15/50 ml tüpler, T25 şişeleri, vs.).
  2. Yavaşça tutun ve% 70 etanol ile baş ve fare yavru boyun sprey ve keskin steril makas kullanarak decapitate [Şekil 1 (1)].
  3. Beyin [Şekil 1 (2-3)] maruz derisi boyunca küçük makas ile kafatası anterior posterior orta hat kesi gerçekleştirin.
  4. küçük makas ile burun boyun dikkatle kafatası kesti. Sonra kafa tabanı kafatası kesmek için beyincik için kafatası koku ampuller anterior ve inferior kesti.
  5. Kafatasının dibinde küçük bir kesi yapmak ve orta hat boyunca kesilir. kafatasını uzak soyma steril düz uçlu forseps kullanabilir. kavisli bir forseps yardımıyla beyin sapı çıkarın. Kafatası beyin çıkarın ve birinci diseksiyon çanak içine yerleştirin [Şekil 1 (4-9)] 21.
  6. Kavisli bir forseps kullanarak, beynin ventral yüzeyi yukarı bakacak şekilde beyin çevirin ve daha sonra keskin bir steril cerrahi bıçak [Şekil 1 (10,11)] ile her iki yarımkürede ayrı
  7. Peel geri serebral hemisfer ve dikkatle hipokampus, medial temporal lob [Şekil 1 (12-14)], küçük bir denizatı şeklindeki yapıyı ortaya çıkarmak için steril bir düz kavisli bir forseps ile şişkin orta beyin ve talamik doku kaldırmak.
  8. Hem hipokampal lobu [Şekil 1 (15,16)] çıkartın ve dikkatlice ince forseps ile çekerek lob gelen meninksler incelemek. Bu adım Meningeal hücreleri ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültürü kirlenmesini önler.
  9. HBSS ile dolu ikinci çanak içine hazırlanmış hipokampal lobları aktarın ve buz [Şekil 1 (17,18)] üzerine geri. hippo hazırlanması için - tek bir fare Pool hem hipokampal lob (P2 P0)campal astrosit kültürleri. Bu astrosit uygun yoğunluğunu verir. Keskin steril cerrahi bıçak (yaklaşık 4 kat) kullanarak hipokampal lobları kıyma.
  10. Aspire HBSS, 15 ml steril konik tüp transferi ve yavaşça çalkalanarak 20 dakika boyunca 37 ° C'de doku inkübe, karıştırın, çanak 1 ml pipet bağlanmış bir steril bir ucunu kullanarak ve% 0.25 tripsin 3 ml.
  11. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj tüpü. Aspire süpernatan dikkatle bir vakum hattına bağlanmış bir steril bir cam pipet kullanılarak. (- 30 kez 20) doku parçaları homojenize kadar yangın parlatılmış cam pipet kullanarak orta ve çiğnemek kaplama 10 ml astrocyte ekleyin.
  12. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj tüpü. Süpernatant aspire ve taze önceden ısıtılmış astrosit kaplama medya 2 mL ekleyin. Yeni 50 ml konik tüp içine 70 mikron örgü filtre (hücre süzgecinden) aracılığıyla hücrelere geçerler.
  13. 3 mL içeren bir poli-D-Lisin / laminin kaplanmış steril T25 kültür şişelerinde Plaka tüm hücre süspansiyonuastrosit kaplama ortamı, daha sonra bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir balon inkübe edin.
  14. Gün-de aspire tüm ortam i, n-vitro (DIV) 1, DIV 3 ve DIV 7 ve taze astrosit kaplama medya 2 mL ile değiştirin. astrosit kaplama medya değiştirirken ışık mikroskobu altında her zaman ilerlemesi ve astrositik izdiham gözlemleyin.
    Not: DIV 1 'de, tüm canlı astrositler kültür şişesi yüzeyi ve sinir yüzer yüzen dahil ölü veya ölmekte hücrelere eklenir. DIV 3 at, ekli hücreler astrositik hücre tabakası oluşturmak için bölünmeye başlar. elverişli koşullar yokluğunda, kültür bir nöronal büyüme hemen yoksundur. % 90 konfluent ve birkaç mikroglia olarak oligodendrosit ön-madde hücreleri, astrositik tabakanın üstünde bulunan edilir - DIV 7 'de, astrosit tabaka yaklaşık 80'dir.
  15. durulama, şişesi kaplama orta aspire taze önceden ısıtılmış astrosit kaplama orta 2 mL eklemekastrositler birleşen ve kültürü alt hazır olduğunda nd, DIV 11 tekrar kaldırın.
  16. yavaşça şişeye birkaç kez döndürmek ve aspire tripsin steril bir cam pipet kullanarak,% 0.25 tripsin 2 mL ekleyin.
  17. % 0.25 tripsin 2 mL ekleyin ve şişe 4 doku kültürü kaputu bekletin - oda sıcaklığında 5 dakika.
  18. Tripsin çıkarın ve 10 dakika boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir balon tutun. 5 ml orta kaplama astrocyte prewarmed ekleyin ve avucunuzun karşı balon dokunarak astrositik katmanı ayırmak - tam dekolmanı sağlamak ve bir 15 ml konik tüp astrositler toplamak için yumuşak ezilerek (3 4 kez).
  19. Santrifüj tüp, 5 dakika boyunca 300 x g'de, süpernatanı havalandırın, ve 1 mL taze astrosit kaplama ortamı ilave edin.
  20. Bir hemasitometre hücre süspansiyonu 10 mcL ekleyin ve ters bir faz kontrast mikroskobu (10X objektif) kullanarak büyük merkezi Gridlenmiş alana (1 mm 2) hücreleri saymak. Multiply 10 4 tarafından mL başına hücre sayısını tahmin etmek. Bir T25 şişesi ~ 1 x 10 6 toplam ayrışmış hücreleri verecektir. Tohum ~ 1 x 10, 24 oyuklu bir kültür kabı oyuk bir 12 mm çaplı poli-D-Lisin önceden kaplanmış cam lamel 2 mL astrosit kaplama ortamı içinde 5 hücreleri.
  21. % 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. 14 (bölüm 2) - DIV 12, OGD / REOX gerçekleştirin.
  22. mikroglia yoksun hipokampal kültürleri isteniyorsa DIV 11 kadar, 5 mM L-lösin metil ester (LME) hidroklorür ile DIV 3 de astrosit kültürleri tedavi edin. LME inkübasyondan sonra (1 saat 300 rpm) sallayarak tabi kültürler mikroglia kirlenmesine neden kaldırmak için.
    Not: LME mikroglia 22 çoğalan ortadan kaldırmak için bir yöntem olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır, bir mikroglial sitotoksik maddedir.

2. OGD / REOX Tedavisi

  1. Aspire yapışık astrosit kültürü içeren lamel medya (DIV 12 - 14) ve durulama 3 kezhafifçe lamel (mM olarak) 1 ml izotonik OGD çözeltisi (pH 7.4) bir kaç kez tutarak 24 oyuklu kültür çanak döndürerek 0 glükoz, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5.36 KCI, 0.33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl2 ve 0.81 MgSO 4.
  2. CO2 lamel kapak ve% 94 N2,% 1 O 2 ihtiva eden bir hipoksik inkübatörde 2 saat boyunca inkübe ve% 5 oyuğa 0.2 ml OGD solüsyonu eklenir. Yavaşça gaz değişimini kolaylaştırmak için hipoksi ilk 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı (50 rpm) ile karıştırın.
  3. 5.5 mM glukoz eklenmesi dışında OGD solüsyonuna denk bir tampon içinde% 5 CO2 ve atmosferik hava içinde, 2 saat boyunca normoksik kontrol hücrelerini inkübe edin.
  4. ve REOX, aspirat OGD çözümü için orta kaplama astrosit 2 mL ekleyin. 5 saat boyunca 37 ° C 'de% 5 CO2 ve atmosferik hava içinde inkübe edin.

3. İmmünositokimyasal Boyama

  1. bir vakum hattına bağlanmış bir steril cam pipet kullanılarak kültür ortamı aspire ve hızlı bir şekilde 0.1 M Tris tamponlu tuz (TBS) içinde 1 ml ekleyerek lamel kez yıkayın (154 mM NaCI, 16 mM Trizma bazı, 84 mM Tris-HCI, pH 7.4) kuyusuna. Aspire edin ve 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) 2 ml. Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
  2. Aspire ve 0.1 M TBS 1 ml, daha sonra 2 dakika süreyle sallanan bir sallayıcı üzerinde yerleştirin. 3 kez tekrarlayın. çözeltisi (% 10 keçi serumu, 0.1 M TBS içerisinde 10 mg / ml BSA,% 0.025 Triton X-100) bloke 1 ml ilave edilir ve sallanan bir sallayıcı üzerinde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  3. Aspire bloke etme çözeltisi ve primer fare monoklonal anti-GFAP antikoru ilave 60 dakika boyunca: Anti-HIF1α (200 1) veya tavşan poliklonal (1 0.2 mL: bloke etme çözeltisi 500 seyreltme) ve tavşan poliklonal anti-S100b (500 1) sallanan çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de ilave edildi.
  4. ve fare Pazartesi: Alternatif olarak, bazı astrositler tavşan poliklonal anti-IBA1 (200 1) ile inkübe ediliroclonal anti-MAP2 Kültür saflığı ulaşmak için.
  5. Aspire birincil antikor ve 0.1 M TBS 1 mL eklenmesini ve 2 dakika sonra aspirasyon için bir sallanan çalkalayıcı üzerinde koyarak lamel durulayın. İki kez tekrarlayın.
  6. sallanan çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de 60 dakika süre ile çözelti bloke sekonder keçi anti-tavşan 488-konjuge anti-fare 568-konjüge edilmiş antikor 200 seyreltme: 1 0.2 ml ekleyin.
  7. Aspire sekonder antikor ve 2 dakika sonra aspirasyon için bir sallanan çalkalayıcı üzerinde 0.1 M TBS 1 mL eklenmesini ve yer ile lamel durulayın. İki kez tekrarlayın.
  8. Bir slayt-kurutucu üzerinde konumlandırılmış bir slayt üzerinde koyarak iyi ve kuru lamel çıkarın. Vectashield tek bir damla tersini yeni bir slayt Mount lamel DAPI (1.5 ng / ml) ile montaj orta hardset.
  9. ya 20X kuru ya da 60X petrol hedefi kullanarak bir konfokal mikroskop görüntü lamelleri. DAPI (405 nm ex / 450 nm em) ve florokrom 488 görüntüleri (512 x 512) Edinme GFAP antikoru etiketli (488 nm ex / 515 nmem). 20X ve 60X grup içinde sürekli elde etme parametrelerini tutun.

PCR kullanarak 4. Cinsiyet Tayini

  1. Isı yavru ayak ya da 50 mM NaOH, 45 dakika boyunca 95 ° C de parmak kırpıntıları ve 1 M Tris, pH 6.8 eşit hacmi ile nötralize.
  2. Myog, Sry genleri için primerler 5 pmol, 1 x reaksiyon tamponu, 0.2 mM deoksinükleotid 8 U Taq polimeraz: Aşağıdaki karışım 19 uL edilen DNA çözeltisi 1 uL ekleyin.
  3. primerleri dizilerini kullanın; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 '5'CATGACCACCACCACCACCAA3 "ve Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3' 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3 '23.
  4. 1 dakika boyunca 72 ° C'de 15 saniye boyunca 58 ° C 'de 15 saniye, tavlama için 95 ° C' de 3 dakika boyunca denatürasyon, sonra 30 döngü 95 ° C, ve uzama: Aşağıdaki PCR protokolü gerçekleştirin. Bu 30 döngü sonra, reaksiyon 1 dakika boyunca son bir 72 ° C uzatma ile son bulur.
  5. ayrı PCR ürünleri elektroforetik etidyum bromür ihtiva eden% 2 agaroz jeli üzerinde ve UV aydınlatması altında görselleştirmek. (Şekil 2A.) DİKKAT! Ethidium bromür potansiyel bir kanserojen ve dikkatle ele ve kurumun düzenlemelerine uygun olarak düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fizyolojik veya patofizyolojik koşullarda cinsiyetli astrosit fonksiyonlarının rolleri anlamak gayet in vitro koşullarda bu kültür hücreleri tarafından da elde edilmiştir. cinsiyetli Kültürleme gerçekleştirme önemli yönü önce kullanımına fare yavru seks belirlemektir. Biz genetik olarak PCR ile ve görsel değerlendirilmesi (Şekil 2) 16 ile fare seks belirlendi. PCR kullanılarak cinsiyet tayini metodolojisi McClive ve Sinclair gelen değişikliklerle kabu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Fizyolojik ve patolojik koşullar altında astrositlerin cinsiyet özelliklerinin farklılıkları ve fonksiyon çalışma için, hücre kültürü içinde cinsiyette primer astrositler hazırlanması kullanılması için önemli bir araçtır. Bu çalışmada in vitro yenidoğan cinsiyetli hipokampal astrosit yüksek zenginleştirilmiş homojen nüfus (P0-P2) C57BL / 6 (vahşi tip) veya K19F (GFAP null) fare yavrular bir yüksek verimli ve kültürüne bir tekrarlanabilir bir yöntem sunduk. Bu metodoloji oluşturulması araştırmacılar in vitro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

yazarların hiçbiri rakip veya çakışan çıkarları var.

Teşekkürler

NCATS UL1 TR0000427 ve KL2 TR000428'ın (Cengiz P) Klinik ve Translasyonel Bilim Ödül programı, NIH/NCATS'ten UW ICTR'ye UL1TR000427 ve Waisman Center'dan (Cengiz P), NINDS'den K08 NS088563-01A1 ve NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). Bize GFAP nakavt fareleri sağladığı için Dr. Albee Messing'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Astrosit kültür ortamı< / em>< / strong>
DMEM, yüksek glikozcellgro10-013-CV
At SerumuGibco26050-070Nihai Konsantrasyon: %10
Penisilin-StreptomisinCellgro 30-002-CINihai Konsantrasyon:% 1
L-Lösin metil ester hidroklorürAldrichL1002-25GNihai Konsantrasyon: 5 mM
< güçlü > Beyin dokusu sindirimi için çözelti< / em>< / güçlü >
HBSSYaşam Teknolojileri14170-088
Tripsincellgro25-050-CINihai Konsantrasyon:% 0.25
Diğer< / em>< / strong>
70% (hacim / hacim) etanolRoth9065.2
Poli-D-Lizin (PDL) 12 mm yuvarlak lameller Corning354087
SuSigmaW3500Hücre kültürü sınıfı
PBScellgro21-040-CVHücre kültürü sınıfı
% 0.05 Tripsin-EDTA ve nbsp;Yaşam Teknolojileri25300-062
70 μ m Steril hücre süzgeci Fisher scientific22363548
3,5 cm Petri kabıBD Falcon353001
15 mL Falcon tüpüBD Falcon352096
50 mL Falcon tüpüBD Falcon352070
Forseps, ince Dumont2-1032; 2-1033# 3c; # 5
Forseps, düz uçluKLS Martin12-120-11
13 cm cerrahi makasAesculapBC-140-R
Konfokal MikroskopNikonA1RSi 
SantrifüjEppendorf5805000.0175804R
Orbital ÇalkalayıcıTermo BilimselSHKE 4450-1CEMaxQ 4450  
Anti-IBA1Wako019-19741Tavşan monoklonal
Anti-MAP2SigmaM2320Fare monoklonal
Anti-HIF1alphaabcamab179483Tavşan monoklonal
Anti-S100BSigmaHPA015768Tavşan poliklonal
Anti-GFAP (kokteyl)Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC Kiti (Tavşan IgG)Vector LabsPK-61014 Reaktif İçerir 
Keçi Anti Tavşan Alexa-Fluor 488InvitrogenA11070
Keçi Anti Fare Alexa-Fluor 568InvitrogenA11004

Kaynaklar

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294(2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282(2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksijen Glikoz Yoksunlu uAstrosit K lt rReaktif AstrogliyozGFAP EkspresyonuS100B EkspresyonuNeonatal Beyin Hasarmm nofloresan Boyama

İlgili makaleler