Bu protokolün amacı, bir kaybı: tanımlamak ve kazanç-of trofoektoderm ve preimplantasyon fare embriyoları iç hücre kütlesi farklılaşma yol açan bir sahne özgü reseptör olarak neogenin tanımlamak için de geçerlidir fonksiyonu yöntemi etmektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı
Bu makalede
Özet
Özet
Gen susturma ve aşırı ekspresyon teknikleri, embriyonik gelişimde rol oynayan genlerin tanımlanmasında etkilidir. Preimplantasyon embriyolarda doğrudan hedef gen modifikasyonu, örneğin trofektoderm (TE) ve iç hücre kütlesine (ICM) hücresel farklılaşmada rol oynayan genlerin altında yatan mekanizmaları incelemek için bir araç sağlar. Burada, preimplantasyon fare embriyolarında ilk hücre kaderinin belirlenmesi için otantik bir reseptör olarak neogeninin rolünü inceleyen bir protokolü tarif ediyoruz. İlk olarak, neojenin cDNA ve shRNA'yı mikroenjekte ederek neojenin fonksiyonunun kazancını ve kaybını üretmek için kullanılan deneysel manipülasyonları tartışıyoruz; bu yaklaşımın etkinliği, kırmızı floresan proteinin (RFP) veya yeşil floresan proteinin (GFP) çift yönlü ekspresyon seviyeleri ile neojenin ekspresyonunun immünositokimyasal miktar tayini arasındaki güçlü bir korelasyon ile doğrulanmıştır. İkincisi, preimplantasyon fare embriyolarında neogeninin aşırı ekspresyonu normal ICM gelişimine yol açarken, neogenin yıkılması ICM'nin anormal şekilde gelişmesine neden olur, bu da neogeninin blastomerleri erken hücre kaderlerine yönlendirmek için hücre dışı ipuçlarını ileten bir reseptör olabileceğini ima eder. Bu ayrıntılı protokolün yeni bir embriyonik gelişimsel aşamaya özgü reseptörün işlevini araştırmadaki başarısı göz önüne alındığında, embriyogenez sırasında diğer aşamaya özgü genlerin araştırılmasına ve tanımlanmasına yardımcı olma potansiyeline sahip olduğunu öneriyoruz.
Giriş
Pre-implantasyon embriyonik gelişim morula ve blastosist tek hücreli aşamasından, birçok farklı aşamaları ayrılabilir. Çok kanıt polarite ve pozisyon ipuçları ilkel trofoblast (TE) ve iç hücre kütlesinden (ICM) içine erken hücre kaderi belirlenmesinde rol oynadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, selüler sinyallere dönüştürülebilen nasıl ipuçları, doğası ve fizyolojik içerikleri burada bu sinyaller bilinmemektedir hücre soyu farklılaşmasını başlatma yeteneğine sahiptirler. Bu farklılaşmış hücreler daha sonra plasenta 1-3 embriyo oluşumu ve büyümesi için gerekli olan karakteristik yapıları ve fonksiyonları üzerine almaya başlayan, uzmanlaşma uğrarlar.
Pre-implantasyon embriyoları siRNA veya hedef cDNA gibi modifike edilmiş genetik malzemenin doğrudan doğruya enjekte edilerek manipülasyon için özellikle uygundurlar ve bu nedenle belirli bir hedef molekülleri okumak için kullanılabilir. Genetik dair artan bir anlayış vardıromurgalı embriyolarının analizi embriyonik gelişim 4 anlayışımızı ilerleyen için kritik öneme sahiptir. zamanında bağlamında bir embriyo, bir vahşi tip gen veya mutant formunda hassas bir giriş gain- veya zarar fonksiyon-geninin büyük gelişimsel olarak düzenlenen genlerin çalışma kolaylaştırmıştır gerçekleştirmek için. Kaybı: ve kazanç fonksiyon-bağımsız erken memeli olmayan ve memeli embriyolara genetik materyallerin mikro-enjeksiyon için büyük boyutları ve büyük reseptivite 5 oldukça basittir. Mikroenjeksiyon tipik olarak viral vektörler kullanılarak gerçekleştirilir. Özellikli bir avantaj olarak, viral vektörler ve transgenlerin fazla viral olmayan vektörler kullanılarak kolaylığı alınmıştır. Fare embriyoları bir hızlı kaybı: ya kazanç fonksiyon-sentezleme sistemi bize incelemek ve omurgalı embriyoloji 6,7 gen fonksiyonlarını anlamak için izin veren geliştirilmiştir.
embriyoların floresan etiketleme büyük ölçüde MICR seçimini kolaylaştıracakoinjected veya genetik embriyolar manipüle ve aynı zamanda dolaylı olarak floresan yoğunluğu 8 göre mikro-enjekte siRNA veya cDNA ekspresyon seviyesini belirlemek için bir yöntem verin. Bu etiketleme, floresan protein cDNA, GFP veya RFP gerçekleştirmek için, birlikte enjekte füzyon konstruktları ya da ayrı ayrı ya da gibidir. GFP veya RFP floresans yoğunluğu bu kaybı: temin ya kazanç fonksiyon-başarılmıştır için siRNA veya yabancı DNA'nın sentezlenmesi kapsamını ortaya koymaktadır.
Burada, bize preimplantasyon fare embriyoları erken hücre farklılaşmasında önemli hücre dışı ipuçlarını ileten bir reseptör olarak neogenin tanımlamak için izin kaybı: ve kazanç-of fonksiyon tekniği için bir mikromanipülasyon protokol mevcut.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Hayvan ıslahı ve bakımları için tüm prosedürler Sahmyook Üniversitesi, Seul, G. Kore IACUC düzenlemelerine göre yapılmıştır.
1. Süperovulasyon, Islahı ve Ovidukt İzolasyon
- aşağıdaki koşullar altında inbred C57BL / 6 fareleri bakımı: 22 ± 3 ° C, ~% 60 nem, 12 st ışık / karanlık çevrimi ve su ve gıda ad libitum verilmiştir.
- 0.1 mL, 5 İÜ gebe kısrak serum gonadotropini (PMSG) intraperitoneal enjeksiyonu ile 3-5 haftalık dişi farelerin superovulasyon Uyarmaktadır / kafa 0.1 mL, 5 İÜ insan koryonik gonadotropinin bir intraperitoneal enjeksiyon (HCG) 48 saat sonra ve ardından /kafa.
- Hemen hCG enjeksiyonu takiben, bir gecede aynı kafeste tutarak aynı gerginlik cinsel olgun erkeklerle superovulation kaynaklı kadın dostum.
- Ertesi sabah, kadın genital sisteminin bir çiftleşme fişi veya vajinal fiş varlığı ile başarılı bir şekilde çiftleşme onaylayın.
- Hamile kadın fareler kurbanCO 2 zehirlenme hCG enjeksiyonundan sonra servikal dislokasyon 18-20 saat izledi.
- Cildi ve daha sonra ince makasla periton tabakayı keserek karın boşluğuna açın.
- ince forseps ile rahim boynuzları Pick up ve vücut boşluğuna yavaşça rahim, yumurtalık, yumurtalık ve yağ yastığı uzak çekin.
- fallop ve ince makas ile yumurtalık arasındaki alanı kesin. Ekli uterusun üst kısmının en az 1 cm bırakarak, forseps konumlandırmak ve yumurtalık yakın rahim kesti.
- Oda sıcaklığında M16 ortamı içeren 35 mm Petri kabı oviductal ampulla aktarın. Aynı çanak çeşitli farelerden fallop borularına havuz.
- embriyoların alımı için bir stereomicroscope altında yemekler yerleştirin.
2. Alma ve 2-pronüklear Kültür (2-PN) Embriyolar
- , 30 veya 32 G derialtı iğne ucunu kesin bir künt ucu içine eziyet ve bir reçeteye iğne olarak kullanabilirsiniz.
- kullanımince forseps kızarma iğne üzerine yumurta kanalının sonuna doğru kaydırın. Yavaşça bir yerde tutmak için çanak alt karşı kızarma iğne ucu basın. M16 ortamının 0.1 mi, bir Petri kabı içine 2-PN embriyolar serbest bırakmak için ~ sahip yumurta kanalının yıkayın.
- steril bir cam pipet kullanarak yeni bir Petri kabı içine aktarabilirsiniz stereomicroscope altında kızardı M16 ortamdan kümülüs kitleleri çevreleyen birlikte 2-PN embriyoların kurtarın.
- 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde% 0.1-0.5 hyaluronidaz 1.0 ml enzimatik sindirme ile 2-PN embriyolardan kümülüs hücreleri ayırmak.
- yumuşak bir cam pipet ve kümülüs hücrelerin fiziksel ayrılması ile pipetleme embriyolar denude.
- embriyo başına taze fosfat tamponlu salin (PBS) 30-50 ml arındırılır embriyolar üç kez yıkayın.
- 10 mg / ml sığır serumu albümini (BSA, Fract ile takviye M16 ortamı bir 35 mm plastik Petri kabındaki embriyolar inkübeen az 4 saat, daha sonra genellikle mikroenjeksiyon gerçekleşinceye kadar bir nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 içinde 37 ° C'de iyon V).
3. Embriyo revers transkripsiyon (RT) ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
- blastosist aşamasına kadar her aşamada en az 10 embriyo toplamak ve ters transkriptaz, RNaz inhibitörü, oligo dT primeri, rastgele 6mers dNTP karışımını içeren transkriptaz ön kanşım çözelti, ters 5x 4.0 ul bunları havuz ve reaksiyon tamponu PCR tüp.
- W 95 ° C'de 5 dakika inkübasyon ile takip 1 saat boyunca 42 ° C 'de hemen RT reaksiyon başlatılır 200 ° 30 saniye boyunca bir araya getirilmiş embriyolar 20 ul bir toplam hacme RNaz içermeyen damıtılmış H2O ilave edin ve sonikasyon.
- Üretilen cDNA çözeltisi, her 5.0 uL, neogenin için primerler normal PCR yürütmek, CDX2, Sox2 Tead4, Nanog, Oct3 / 4 veya β-aktin (primer dizileri Tablo l'de verilen 1. PCR, 95 ° C'de 15 saniye inkübasyondan 40 döngü oluşur (Tablo 1 'de gösterilmektedir) tavlama sıcaklığında 30 saniye ve 72 ° C'de 30 san.
- % 2 agaroz jeli üzerinde elektroforez ile, ayrı PCR ürünleri ve etidyum bromid ile boyanarak UV ışığı altında jel görselleştirmek.
- β-aktin seviyelerine karşı hedef gen ifadesini normalleştirmek.
Embriyolar 4. İmmünositokimya
- PBS,% 0.01 BSA ihtiva eden bir kısa yıkama ile 3 kez ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile her aşamada embriyolar düzeltildi.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Tween 20 ve% 0.1 Triton X-100 içeren PBS 1.0 ml 10 embriyo inkübe edilerek Permeabilize Hücre zarları.
- PBS 1.0 ml geçirgen embriyolar inkübe spesifik olmayan engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca,% 10 normal keçi serumu ile takviye edilmiştir.
- Engellenen embriyolar zekâ inkübe1 H tavşan anti-neogenin antikorları: PBS içinde 100 seyrelti, gece boyunca 4 ° C'de% 0.1 BSA içeren.
- PBS damla 30 sn her biri için üç yıkamadan sonra, 1 Alexa 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG veya Alexa 568-konjuge keçi anti-tavşan IgG ile ya embriyolar inkübe: PBS / BSA çözeltisi 500 seyreltme, gece boyunca 4 ° C'de .
- aktin filamanlarını görselleştirmek için, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile, PBS içinde 1 ug / ml Phalloidin embriyolar inkübe edin.
- PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür) ihtiva eden 5 ml ekleyerek çekirdekleri leke.
- Yıkama PBS ile üç kez kısaca embriyolar.
- Bir bardak slayt embriyo transferine ve madeni yağ bir damla ile bunları kapatın.
- Uygun dalga boyunda bir uyarma ile konfokal mikroskop ile 1,000X büyütmede görüntü al.
Neogenin-RFP ve Neogenin-siRNA GFP Plazmidler 5. Hazırlık
- AltcDNA Kırmızı Floresan Protein (RFP), vektör ihtiva-eden neogenin-bayrak-RFP sonuçlanan içine fare neogenin kodlama klonlamak.
- Emerald yeşil flüoresan protein (EmGFP), vektör ihtiva-eden pcDNA-EmGFP-miR-neogenin sonuçlanan içine neogenin hedef alan küçük bir saç tokası RNA alt-klonlanmıştır (Şekil 1 'de gösterildiği gibi).
- neogenin-bayrak RFP ve pcDNA-EmGFP-miR-neogenin plazmidler hem yükseltmek ve geleneksel yöntemlerle onları arındırmak.
- Plazmidlerin nihai konsantrasyonlar ayarlama için, steril Tris-EDTA (TE) tampon / ml 1.0 ug.
2-PN Embriyolar içine Plazmidler 6. Mikroenjeksiyon
- Taze M16 medya ile, kısaca bir kez soyulmuş 2-PN embriyoların yıkayın.
- çekirdeklerine gözlem için izin vermek için bir masa üstü santrifüjü içinde 1,000 x g'de 10 dakika süre ile 2-PN embriyolar santrifüjleyin.
- Bir Additi% 5 CO2 37 ° C'de mineral yağ altında embriyo başına M16 ortamı 20-30 ul'lik bir mikro damla embriyolar inkübeÖnal 1-2 saat.
- borosilikat cam kapiller tüp çekerek enjeksiyon pipetler ve holding pipetler imalatı (OD = 1.2 mm; J = 0.94 mm) mekanik bir çekici ile.
- Bir microgrinder ve microforger kullanarak künt ipuçları ve <500 mikron ucu uzunluğu ve 1-2 mikron ucu iç çapı cilalı açıklıklar enjeksiyon pipetler Üretiyor.
- 20 um'lik bir iç çapa ve 100 um arasında bir dış çapa sahip kör ipuçları ve perdahlı açıklıklara sahip olacak şekilde pipetler tutarak imal.
- 1.0 ug / ul plazmid solüsyonu yeterli bir miktarı ile yüklenebilir enjeksiyon pipetler (> 200 nl).
- Microinject ~ motorlu bir mikromanipülatör bağlı bir mikropüskürtücü kullanılarak ön çekirdek birine, her 2-PN embriyo için plazmid solüsyonu 10 uL; Bu işlem sırasında, bir tutma pipeti ile negatif bir basınç uygulayarak pozisyonda embriyolar tutun.
- Mikroenjeksiyon sonra, l taze M16 medya ile 2-PN embriyolar 3 kere yıkayın1 dakika her zaman daha ess.
- Kültür ortamı buharlaşmasını önlemek için bir mineral yağ damlası ile kaplanmış bir plastik kültür tabağına taze M16 ortamının bir damla 2-PN embriyolar.
- Bir diferansiyel girişim kontrast altında 24 saat aralıklarla (DIC) 200X büyütme ters mikroskop embriyolar gözlemleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz o neogenin geçici olarak erken 2-hücreli aşamada olduğu gibi ve kalıcı erken morula kadar görünen ama geç morula ve blastosist aşamaları (Şekil 2A) de eksik olma, preimplantasyon fare embriyoları erken gelişim aşamalarında ifade edilir keşfetti. Buna ek olarak, neogenin uzamsal dağılımı esas olarak dış hücrelerine sınırlandırılmıştır. RT-PCR analizi sonuçlarını 4-hücre aşamasında zirve ama tamamen sonra (Şekil 2b) 16-hücre aşamasında hiç ya da, neoge...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mevcut protokol, fare embriyogenez sırasında erken hücre farklılaşmasında neogenin rolünü araştırmak için 2-PN fare embriyoları içine genetik materyallerin mikroenjeksiyon yeni yöntemler, cDNA veya shRNA ya göstermektedir. preimplantasyon embriyoların genetik modifikasyon, örneğin altında yatan moleküler mekanizmaları, ilk hücre soyu belirlenmesi hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarmada güçlü bir tekniktir. Genetik modifikasyonlar gen fonksiyonu tespit etmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. yabancı genetik ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa etmek rakip mali çıkarlarını yok yok.
Teşekkürler
Yazarlar ayrıca imalat ve cDNA ve shRNA vektörler neogenin için yapıları paylaşımı için Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi'nden Dr. Xiong'un grubu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Kore Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A4A01012572) hibe yoluyla ve Sahmyook Üniversitesi'nden bir araştırma hibe ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| M16 orta, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT # 11A832 | |
| Keçi serumu, | Dako (Glostrup, Danimarka) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Hollanda | G4877-1000IU LOT # SLBD0719V | |
| Mineral yağ | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT # SLBC6783V | |
| insan koryonik gonadotropin ve hamile kısrak serumu gonadotropin | (Intervet, Hollanda) | (invitrogen, 15596-026) | |
| SuperScript® III Ters Transkriptaz | yaşam teknolojileri | 18080-044 | |
| PCR ön karışımı | ( Bioneer, Daejon, G. Kore) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agaroz (moleküler derece) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehit Çözeltisi, PBS | Affymetrix USA | 19943'te | |
| poliklonal tavşan anti-neojenin antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji, ABD | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 etiketli anti-tavşan antikoru | Moleküler Problar (Invitrogen, ABD) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 etiketli anti-tavşan antikoru | Moleküler Problar (Invitrogen, ABD) | A-21428 | |
| Alexa Fluor ® 555 Phalloidin | Moleküler Problar (Invitrogen, ABD) | A34055 | |
| DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) | Invitrogen, ABD | D1306 | |
| Rekombinant İnsan RGM-C / Hemojuvelin | R&;D sistemler | 3720-RG | |
| tüm plazmid yapıları | Prof. Wen Cheng Xiong, Georgia Sağlık Bilimleri Üniversitesi'nde (Agusta, GA). | çünkü mevcut çalışmalar nazikçe | |
| Neon® Transfeksiyon Sistemi | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Nikon ile mikro ana akım sistemi | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Mikro Enjektör | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Tutucu | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Mikrofüj | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| öğütücü | Narishige | EG400 | |
| Çektirme | Sutter Instrumnet şirketi | P-97 | |
| CO2 inkübatörü | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Kuyulu Termal Döngüleyici ve nbsp; | Yaşam Teknolojileri | 4388444 |
Kaynaklar
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851(2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769(2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989(2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
