Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

11.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53705

⸱

8 Ocak 2016

 ,  , 
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

Bu makalede

Özet

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Özet

In vivo görüntüleme Fonksiyonel fonksiyonu ve beyin hücreleri ve ilgi yapıların fizyolojisi incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. En son ışıldar haberci GFP Aequorini (GA) kullanılarak -imaging Ca 2 yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kofaktörü koelenterazin ilavesi ile - - foton toplayıcı ile izlenebilir parlak ışık yayan Bu yeni teknik kalsiyum bağlanması ve bir moleküldür üreten GFP ve aequorin genlerin füzyonu kullanır. GFP-aequorin geni taşıyan transjenik çizgiler fareler ve Drosophila hem de üretilmiştir. Drosophila olarak, GFP-aequorin geni beyin içinde hedeflenen ifade ve görüntüleme için izin GAL4 / UAS ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında yerleştirilmiştir. Bu yöntem, daha sonra tespit etme kabiliyetine sahip olduğu gösterilmiştir hem Ca içeri 2 + -transients ve Ca +2, iç depolardan -released. En önemlisi de sürekli kayıt, beynin içinde büyük derinliklerde görüntüleme daha büyük bir süre için izin verir, ve (8.3 milisaniye kadar) yüksek temporal çözünürlükte kayıt. Burada kayıt ve Ca mantar organları içinde 2+ -Aktiflik, sinek beyinde öğrenme ve hafıza merkezi bir yapı analiz etmek bioluminescent görüntüleme kullanılarak temel yöntem mevcut.

Giriş

Temel desenlendirme ve beyin ve ayrık yapı içinde faaliyet işlevi uzun nörobilim alanındaki yoğun bir çalışma alanı olmuştur. Belki de bu sorunu gidermek için kullanılan en eski başarılı yaklaşımların bazı elektrik aktivitesindeki değişikliğin doğrudan fizyolojik ölçümü vardı - ek yetenekleri getirdi (aktivite için proxy olarak) gerilim, pH veya kalsiyum konsantrasyonları değişikliklerin canlı görüntüleme izin ancak alternatif yöntemler nöronal aktivitenin 1 çalışma. Görüntüleme teknikleri, azaltılmış invaziv ve bütün beyin yapıları içinde etkinliğini izlemek için yeteneği gibi avantajları geniş bir yelpazeye taşırlar. Ayrıca meyve gibi uysal genetik hayvanlarda Drosophila gibi cameleon, GCaMPs ve diğerleri gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, gelişimini sinek 1 tek nöronlar, nöronal nüfus ve tüm beyni izlemek için araştırmacılar izinyapıları. Daha geleneksel floresan kalsiyum görüntüleme yöntemleri (kalmodulin kaynaştırılmış CFP ve YFP) (kalmodulin erimiş GFP) ya da FRET GCaMPs kullanırken iyi mekansal ve zamansal çözünürlük sağlayan kullanışlı teknikler olduklarını kanıtladılar, ışık uyarma altında yatan sürecinin deneysel bazı sınırlamalar doğurur uygulamaları. Nedeniyle sonuç görüntülü olabilir yapıların derinliğini sınırlar kaçınılmaz üretilen hafif uyarma, otofloresansı, fotoğraf ağartma ve fototoksisite doğası için, kayıtların süresi yanı sıra kayıt gerçek zamanlı süreklilik. Diğer bir deyişle, kayıtlar genellikle bu istenmeyen yan etkileri önlemek için aralıklı olarak gerçekleştirilmelidir.

Çünkü bu zorlukların, kalsiyum görüntüleme ek alternatif yöntemler geliştirilmiştir. En umut verici yöntemlerden biri kalsiyum bağlama sonra enzimatik reaksiyon ile üretilen ışık dayanır biyoluminesen görüntüleme vardır. Bioluminescent görüntüleme geleneksel kalsiyum görüntüleme aynı zorluklar yaşamaya değil dolayısıyla hafif uyarma gerektirmez ve etmez. Bio-ışıldar haberci Aequorin - Aequorea victoria izole λ (GFP da isolated- edildiği aynı Jellyfish üç EF ayak yapılarının ile kalsiyum bağlanır ve kofaktörü koelenterazin oksidasyonu ve mavi ışık serbest bırakılmasına yol açacak bir konformasyonal değişiklik geçirmektedir = 469 nm) 2,3. Aequorin çok az arka plan gürültü üreten ve hücre içi kalsiyum tamponlama sistemi 4 ile karışmaz çünkü geçici kalsiyum kontrolü için ideal hale getirir, kalsiyum (Kd = 10 uM) için çok düşük bir çekicilikleri vardır. Aequorin önce Xenopus yumurta 5 üretilen ışık nöral indüksiyon sürecini izlemek için kullanılır olmasına rağmen nöronal aktivitenin gerçek zamanlı görüntüleme için kullanmak için çok loş. Bu meydan okuma, Philippe Br & gidermek için bir çaba içinde251., Pasteur Enstitüsü'nde izin ve arkadaşları denizanası 4 içinde yerli devlet taklit, GFP füzyon ve genleri Aequorin bir genetik yapının yarattı. Bu füzyon gen ürünü GFP olmayan radyatif enerjiyi aktaran koelenterazin, oksidasyonu için önde gelen bir yapısal değişikliğe uğrar aequorin üç EF eli yapıları, üzerinden tekrar kalsiyumu bağlar. Yerine aequorin mavi ışık GFP yeşil ışık (λ = 509 nm) sürümünde bu enerji transfer sonuçları. GFP ve aequorin füzyon aynı zamanda tek başına 4 Aequorin daha 19 65 kat daha parlak füzyon proteini üretmek ışık yardımcı büyük protein stabilitesini bahşeder. Beynin içinde bir biyolüminesens yaklaşımı kullanarak sürekli kayıt süresi ve kaydedilebilir beyin içindeki yapıların sayısı bakımından hem de kalsiyum görüntüleme mevcut deneysel uygulama genişletir. Geniş önceki çalışmaları bağlamında bu hem küresel hem de daha büyük bir anlamıBeynin bölgeselleştirilmiş "etkinliği" çeşitliliği (kalsiyum transientler proxy üzerinden) izlenebilir. Daha da önemlisi aktivite kolaylıkla beyinde bazal fonksiyon tam bir anlayış peşinde kendisini ödünç bir gerçek zamanlı ve sürekli olarak, içinde, daha uzun süre izlenebilir.

Son birkaç yıl içinde, laboratuar ve diğerleri, ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında GFP-Aequorini (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6 ifade eden transgenik sinekler geliştirdik. Biz doğrudan nikotinik uygulama 9 ile asetilkolin reseptör stimülasyonu aşağıdaki mantar organları Ca 2+ -Aktiflik modüle gibi kokusu 7,8 gibi doğal uyaranlara yanı sıra çalışılan hücresel bileşenleri tarafından üretilen kayıt faaliyetine GFP-aequorin biyoparlaklık kullandık. Buna ek olarak, biz de uzun vadeli gibi önceden ele alınması mümkün olmamıştır deneysel sorular, bir dizi adrese GFP-Aequorini kullanmışSpontan kalsiyum geçici ve derin beyin yapıları 10 görselleştirme görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, biz memeli ATP reseptör P2X 2 11 projeksiyon nöronlarının bir katyon kanalı, (PNS) ifade GAL4 / UAS sistemi kullanılmaktadır ve (MB247-LeXA mantar organları GFP-Aequorini ifade etmek LeXA sistemini kullandık, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. Pfeiffer, Janelia Çiftliği, ABD) bir nezaket. Bu bize böyle bir koku uyarana karşı tepki olarak daha doğal koşullar, taklit, sırayla mantar organları (PNS bir aşağı hedef) aktive ATP, uygulanmasıyla Fiziksel Durum etkinleştirmek için izin verdi. Genel olarak bu P2X 2 birleştirerek tekniği ve GFP-aequorin deneysel olanakları genişletir. Geniş farklı uyaranlar ve tedirginlikler faaliyet bazal desenlendirme değiştirebilir nasıl yeni çalışmaları başlatarak, daha beyindeki aktivite kalıplarını anlamak için bir fırsat sunuyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Numunelerin hazırlanması 1.

  1. Çözeltilerinin hazırlanması ve kurmak
    1. Standart Gıda ortamında 24 ° C'de tüm Drosophila melanogaster hatlarını korumak. Arka ve şişede düşük yoğunluklu onları tutmak standart boyut ve sinekler ağırlığını oluşturmak için.
      1. Bir şişede 10 erkek ile 10 kadın bakire ekleyin, onları dostum izin ve taze bir şişeye 2 günde aktarabilirsiniz. Sinekler Eclose başladığında Sonra 10 gün sonra, her gün sinekleri hasat. Sineklerin yaşı kesin kaydını tutun ve iyi durumda tutmak.
      2. 3. günde, kadınlarda gelen erkek ve dişiler ayrı flakon başına 20 sinekler tutmak. 4 ya da 5 gün eski at sinekleri kaydedin.
    2. Aşağıdaki konsantrasyonları ile Ringer çözeltisi hazırlayın: 130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES ve 36 mM sukroz ve hassas 7.3 çözeltinin pH'ının ayarlanması. 25 mikron perfüzyon çözümleri hazırlayın; Ringer çözeltisi içinde M nikotin ve 100 mM KCI.
    3. Bir eğim ile (ucunun ucundan yaklaşık 35 °) bir jilet şekli ucunu kullanarak ve bahşiş 1 ½ santimetre ötesinde fazla baz kaldırın: 1000 ul pipet hazırlayın.
    4. İnkübasyon süresince numune saklama için kutu (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) hazırlayın. Bunların hazırlanması tamamlandıktan olarak örnekleri yerleştirmek için küçük bir raf aparatı altında [örnek kuruma önlemek için] alt suyla doymuş iki sünger (12 cm x 8 cm x 3 cm) yerleştirin.
    5. GFP-aequorin sentezlenmesini tahrik etmek için bir GAL4 hattının UAS-GFP-aequorin en az 1 kopyasını ve bir kopyasını ihtiva eden ve böylece sinek örnekleri hazırlayın. OK107 Gal4 hattı (öncelikle mantar organları bir çizgi sürüş ifadesi) Bu hazırlık UAS-GFP-aequorin ile çarpı işareti vardır.
      Not: kutusunun içinde su geçirmez olmalıdır ve dış inkübasyon sırasında koelenterazin bozulmasını önlemek için kutuyu girmesini ışık engellemelidir.
  2. HazırlıkNumunelerin preparasyonu
    1. Buz bir cam şişeye aktararak Drosophila uyutmak ve pipet konumlandırma için soğutulmuş Petri kabı taşındı önce 2 dakika süreyle buz üzerinde tutmak. Diseksiyon mikroskobu altında buz üzerinde 100 mi Petri kabındaki hafif nemli filtre kağıdı üzerinde pipet uçları hazırlayın.
    2. Yavaşça forseps yer pipet içine sinek.
    3. Hafifçe bastırın ve baş ucu kenarı geçmiş tamamen ve dorsal bölge kısmen uç şekillendirme (Şekil 2B) sırasında çıkarılan bölüm maruz şekilde sinek hizalamak bir fırça kullanma.
    4. Diş tutkal iki bileşenin, küçük (yaklaşık 3-4 | il) kısımları birleştirin. Pipetlemeyin ucu kenarına ve çevresinde geri aşağı baş ve boyun ön etrafında dikkatli tutkal sürün ve - baş tacı kaçınarak. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin.
    5. Kayıt odasının (Şekil 2D) ve gen delikten yapıştırılmış sinek ile yerleştirin pipettly yerine sabitlemek için düğmesine basın.
    6. Silikon yapıştırıcı (yaklaşık 3-4 ul) iki bileşeni birleştirin. Bölme ve pipet ucu buluştuğu Ringer solüsyonu sızıntısı önlemek için kenarı boyunca odasının düz tarafında tutkal sürün. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin.
  3. Teşrih
    1. Perfüzyon kanalı, kısa kenarı boyunca bandı yapıştırın ve odasının arkasına kadar uzanan.
    2. Floresan lamba mikroskop altında sırayla diseksiyonu blokta sinek odasına yerleştirin. Odasına Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi.
    3. Manikür kaldırmak için ince bir cerrahi bıçak kullanın. Antennal bölgeye başın arka paralel kesiler olun. Sonra sonra önceki kesiler bağlayan anten üzerinde dik bir kesi yapmak gözün kenarında kesti. Başın arka kısmında olduğu için son bir kesi paralel yapın. Manikür (Şekil 2C) kaldırmak için ince sivri forseps kullanın.
    4. Yavaşça bir kavramak ince keskin forseps kullanınBeyin ve [floresanlama] mantar vücut açıkça görülünceye kadar uzak solunum doku maruz temizleyebildiğini d.
    5. Dikkatle kavramak ve koelenterazin nüfuz sağlamak için beyini çevreleyen nöroepitelyal doku çimdik ultra keskin forseps kullanın.
      Not: Alternatif olarak papain neuroepithelia 9 geçirgenliği için kullanılabilir.
    6. Bir pipet kullanarak, karanlık kutu içinde diseksiyon ve yer örneğinden herhangi enkaz kaldırmak için Ringer solüsyonu ile iki kez yıkayın.
    7. Odasına 5 uM benzil-koelenterazin içeren Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi. 2 saatlik bir en az oda sıcaklığında koelenterazin inkübasyon kutusunu kapatmak ve izin verir.

2. Görüntüleme

  1. Kurmak
    1. Kayıt sistemini başlatın: 25 ° C mikroskop, bilgisayar, kamera ve drenaj sistemi ve set odaya çevre denetimleri açın.
    2. Açık Ölçme ve bilgisayardaki Otomasyon Explorer programı. Tıkla “ Aygıtlar ve Arayüzler NI Hareket Cihazlar ", ardından çift tıklayın" "ve nihayet sağ tıklayıp" PCI-7334 "ve" aygıt başlatılamadı ".
    3. Foton Imager açın. Yeni bir klasör ve adını ilk kayıt dosyası oluşturun. Sistem çalışabilmesi Kamera -80 ° C ulaşmalıdır.
    4. Set up perfüzyon sistemi - rezervuar için KCl, nikotin ve Ringer çözeltisi ekleyip 2 ml / dak yani her çözüm deşarjları ayarlayın. Deney başlamadan önce Ringer solüsyonu ile yıkayın.
  2. Örnek hazırlayın
    1. Yer görüntüleme 5X büyütmede mikroskop altında montaj blok çanak montajı ve delinme yoluyla kanala perfüzyon tüpü yerleştirin.
    2. Floresan moduna ayarlı mikroskop sonra merkezi ve odak noktası haline mantar organları (MB) getir. 20X ve yeniden merkezi ve odak ayarlayın.
    3. Ucu böylece drenaj havuz üzerinde Pozisyon drenaj cihazı, sadece Abov drenaj şant yüksekliğini ayarlamake havuzu ve yeterli drenajı sağlamak için 30 sn Ringer çözeltisi çalıştırın.
    4. Işıktan aparatı kapatmak için kalkan aşağı çekin. Foton kamera otomatik odaklama sistemi kullanılarak ince ayarlamalar yapmak ve MBs bir referans floresan görüntü almak.
  3. Kayıt
    1. İstenen kayıt hızı (50 milisaniye kadar 1 sn veya daha fazla) için foton hızını ayarlayın. Seçin foton modu ve açık deklanşör. Günlük girişlerini rekor genotip, cinsiyet, yaş ve örneklem sayısı. YG kutuları tıklayarak ve kontrol tutarken sürükleyerek pozisyon ROI çanak ve hücre gövdeleri (CCB) üzerinden kutuları ve medial loblar ayarlayın.
    2. (Arzu edildiği kadar) yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca kayıt taban.
    3. 1 dakika süre ile nikotin uygulanır. Günlüğünde start / stop edin. 5 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır.
    4. Kurtarma için 5 dakika bekleyin ve KCl günlük girişini ve zamanlayıcı hazırlar.
    5. 1 dakika için KCl uygulayın. Günlüğünde start / stop edin. 1 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır.
    6. Şalterfloresan moda, son floresan görüntü almak ve Ringer çözeltisi kapatın.
    7. Basın "Dur". İletişim kutusu sistemi kapatmak isteyecektir. "Hayır" kayda devam etmek seçin.
    8. Açık kalkan, hareket drenaj sistemi, 5X geçiş lens objektif, perfüzyon tüpü çıkarın. , Sahneden örnek / kayıt çanak çıkarın durulama ve su ile iki kez merceği silerek 20X lensi temizlemek.
    9. Bir sonraki kayıt başlatmak için program penceresinin üst kısmında beyaz play butonuna basın.

3. Analiz ve Video Oluşturma

  1. Foton değerleri ayıklamak
    1. Foton analizi programını açın (örneğin, Foton Görüntüleyici) ve açık ilk örnek tablo dosya.
    2. Ekran kontrol sekmesini seçin. Kontrol tutarken bölgeye tıklayarak ROI seçin. GFP ışıklı CCB ve medial lobları kapsayacak şekilde ilgi bölgelerin büyüklüğü, yönünü ve şeklini ayarlayın.
    3. Bir ek eklemeve tıklayarak "yatırım getirisi Define" linkine tıklayarak ve yeni yatırım getirisi oluşturmak için ekrandaki sürükleyerek al ROI.
    4. Foton videoyu oynatmak için "Film" sekmesini seçin. Istediğiniz gibi "sn genişliği" ve "sn adımları" ayarlayın. YG yerleştirme gerektikçe yeniden ayarlayın.
    5. GFP floresan, nikotin tepki ve KCl tepki temsili ekran görüntüleri seçin. Daha sonra analiz ve karşılaştırma için bir sunum slayt içine Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü.
    6. "Sn genişliği" ve saniyeler içinde kayıt hızı "sn adım" hem de ayarlayın. Uyarıcı başlamadan önce ve hemen tepki bittikten sonra dirsek bölgeye üst paneldeki gri işaretçileri hareket ettirerek analiz uzunluğunu seçin.
    7. "> OYUN" basın "<< REW" basın "oynarken görüşlerini Askıya" i seçin. "Puan tablosu Count" ve istenen ve çizgi renkleri ROI rengine uyacak şekilde ayarlayın birimleri sekmesini seçin.
    8. Analiz bittiğindeBasın "İhracat Oranı Verileri Kont". Kombine kayıtlar CCB ve her taraftan ilgi medial lob bölgenin seçin ekran görüntüleri. Cevap görüntüleri ile slayt halinde Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü. Bu kaydırma, daha sonra son tahlilde kullanılır.
  2. Örnek Analizi: detaylı ekstre foton verilerin analizinde bir yöntemdir
    1. "Puan Exports Count" klasöründeki elektronik tablo dosyalarını açın.
    2. Hücreleri saat ve dakika zaman görüntülemek için ilk sütun etiketli zaman biçimlendirin.
    3. Numune için ilgili slayt Referans. Zaman ve iki temsilci ROI için sütunları hariç tüm değerleri kaldırın.
    4. Nikotin stimülasyon başlangıç ​​zamanını belirleme - ana günlük girdisi dosyasında mevcuttur başlatmak veya vurgulamak değeri öncesinde ek verileri kaldırmak klasör-.
    5. CCB ve medial lob ve işareti / vurgulamak hem de yüksek / tepe değerini bulun.
    6. Hem tepki başlangıç ​​ve bitiş zamanını belirlemekGeçen süre noktasını kullanarak bir tahmin oluşturarak CCB ve medial lob slayt yanıtı grafikle ve bu noktalara yakınlık değerleri değişiklikten gerçek değer seçmek değinilecektir. CCB ve medial lob hem de bu noktalar arasındaki bölgeyi vurgulayın. Alternatif olarak, 9 makro kullanın.
    7. Yeni tablo üzerinde bir deney grubundan tüm örnekleri birleştirin.
    8. Sıra değerini belirleyerek tepe üzerinde hizalayın her CCB tepe değerine içindir. Bu örnek verileri recopied gereken yaklaşık satır değerini belirlemek için en yüksek satır değeri düşük değerler çıkarma. Tüm tepe değerleri hizalanmış olduğundan emin olun.
    9. Bilanço kez kopyalayın ve medial lob sütunları veya tek CCB veya medial lob değerleri sayfaları oluşturma CCB sütunları ya silin.
    10. Tüm CCB yanıtları bittikten sonra verileri kaldırın. Dört satır Toplam fotonlar, Tepki Süresi (süre), Tepe Genlik ve Tepki Gecikme etiketli oluşturun. Kopyala ve orijinal altında yine bu yapıştırın.
    11. Yanıt sırasında toplam fotonları belirlemek için TOPLA işlevini kullanın. Yanıtın uzunluğunu belirlemek için COUNT işlevini kullanın. Kopyala ve tepe genlik değerini belirlemek için en yüksek değer hücresini bağlamak. COUNT işlevini kullanın - cevap başlangıcına nikotin perfüzyon başından itibaren seçin - Tepki Gecikme belirlemek için.
    12. Saniye hızını kaydederek (bütün tepe genliği hariç) çarpın bağlantı işlevini kullanarak ve kopyalama değerleri.
    13. Yani (örn .: Şekil 5B, C, D) istenirse Bar / kutu grafikleri gibi toplam Fotonlar, Tepe Genlik ve Tepki Süresi olarak hesaplanan parametreler için oluşturulabilir.
    14. Ham veri foton cevaptan sonra sütununda, ortalama fonksiyonunu kullanarak her zaman noktası için ham veri noktaları ortalama. Ortalama (SEM) standart hatasını belirlemek kolon istenen takip bir zaman noktasında ortalama foton değerleri için ise.
    15. Ortalama bir tepki profile oluşturmak için ortalama sütunu kullanınCCB örneklem grubu için e [Grafik]. Bu x-ekseni değerleri olarak saatini belirterek sütun ve y-ekseni olarak ortalama foton değerleri sütunu seçin ve son olarak saçılım grafiği oluşturma aracını seçin yapmak için.
    16. Medial lob verilerle bu analiz işlemi tekrarlayın.
  3. Video için Görüntüleri oluşturma
    1. Açık foton görüntüleyici.
    2. Seç ekran kontrol sekmesi. Seçmek kaldırmak ve / veya en aza indirmek için kontrol tutarken ROI tıklayın.
    3. "Sn genişliği" her çerçevenin içeriğini belirlemek için arzu edildiği gibi (birikim süresi) değiştirin.
    4. Her çerçevenin üst üste tanımlamak için "sn adım" değiştirin.
    5. Basın "<< REW" ardından "oynarken ihracat görüşlerini" "OYUN>" seçeneğini seçin. Video için görüntüleri .png dosyaları bir dizi olarak "görünümü ihracatı" klasörüne ihraç edilecek.
  4. Video c için bir yöntem: Sanal Dub kullanarak video yapmakDetaylı reaksiyonundan
    1. Görüntüleri içeren görünüm ihracat klasöründeki "Resultats" adlı yeni bir klasör oluşturun.
    2. Görüntülerin klasörünün içine komut (renommer.VBS) getirin.
    3. Renommer.VBS çift tıklayın çalıştırmak için.
    4. Görüntüler otomatik olarak sayısal olarak yeniden adlandırıldı ve "Resultats" klasörüne kopyalanacaktır.
    5. Açık VirtualDub.exe.
    6. Açık bir video dosyasını seçin - (sonraki görüntüler otomatik olarak yükleyecektir) ilk resmi seçin.
    7. Seç videosu - istediğiniz gibi belirleyin kare hızı ayarlayın.
    8. Video seçin - Seçilen sıkıştırma yarıçapı Cinepak Codec seçin.
    9. Dosyasında video otomatik olarak oluşturulur AVI olarak kaydet seçeneğini seçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aequorin için GFP füzyon bize mikroskobu (Şekil 3A, 4A, 6A, 6E) üzerinde floresan modunda GFP uyarma yoluyla önce biyolüminesans görüntüleme ilgi bölgemize görüntülemenizi sağlar. Mantar organları uyarmak için en basit yollarından birisi, iyonotropik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla. Asetilkolin Bu, alıcının endogen liganddır, ancak biz, nikotin mantar organlarında daha çoğaltılabilir bir yanıt ürettiği bulunmuştur. Onlar özellikle nikotinik asetilkolin reseptörlerini ifade ve b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Cabrero ve ark belirtildiği gibi burada sunulan yeni geliştirilmiş biyolojik olarak ışık veren bazlı GFP aequorin bir yaklaşım, böbrek stellat hücreleri gibi diğer hücre tür, hem de istenirse gibi farklı nöronlarında Ca 2 + -Aktiflik in vivo fonksiyonel bir kayıt sağlar. 2013 5.

Değişiklikler, sorun çekim, ek bileşenler ve kritik adımlar

Drosophila Yetiştiriciliği...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

ABD'deki Sciences Wares'tan E. Karplus'a değerli ve yararlı yardımları ve tavsiyeleri için minnettarız. Bu tekniğin geliştirilmesi ve iyileştirilmesine katkılarından dolayı E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier ve J. Stinnakre'ye teşekkür ederiz. Ayrıca pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP hattı için B. Pfeiffer ve G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, ABD'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Chateaubriand Bursu, Fransız Büyükelçiliği, Washington, ABD, A. Lark'a, Ulusal Bilim Vakfı (IOS 1352882) tarafından T. Kitamoto'ya ve Fransız ANR'ler (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005 ve FlyBrainImaging, 2011), Conseil Régional Ile-De France (NeRF ve DIM), IFR-144, CNRS'nin Physique-Chimie-Biologie Arayüz Programı (2009), ve CNRS, Fransa tarafından JR Martin'e.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NaClSigma-AldrichS3014
CaCl2Merck1023911000
HEPESSigma-Aldrich7365-45-9
KClprolabo26 764.298normapur
MgCl2prolabo25 108.295normapur
sükrozSigma-AldrichS0389
NikotinSigma-AldrichN3876
ATPSigma-AldrichA2383Adenozin 5 asal; -trifosfat disodyum tuzu hidrat
benzil-coelenterazineProlume, nanolight ve nbsp;Cat # 301 Coelenterazine h
http://www.prolume.com/ diş yapıştırıcısı3M ESPE ve ticaret;46954Protemp IV
silikon yapıştırıcı3M ESPE ve ticaret;36958Ekspres 2 Normal Gövde Hızlı
bant3M Scotch122s3M Scotch Magic Tape
pipet uçlarıCorning Incorporated4868100-1.000 &mikro; l Univesal Pipet Ucu
haznesi ve tutucusu (aşama)el yapımı
kuluçka kutusuel yapımı
forseps (No. 5)Güzel Bilim Araçları11252-00Mikro diseksiyon forseps
kavisli forsepsSigma-AldrichF4142Mikro diseksiyon forseps
tutkal aplikatörü ve nbsp;El yapımı 
bıçakGüzel Bilim Araçları10316-145 mm Derinlik 15 & derece; bıçak
EM-CCD kamera & nbsp;AndorDU-897E-CS0-#BViXon (-80 ° C'ye soğutulmuş; C)
MikroskopNikonEclipse-E800
daldırma objektif lensNikon20X Floresan ile .5w
diseksiyon mikroskobuLeica MZ Fl IIIleica diseksiyon kapsamı ve floresan lamba
sıkı karanlık kutuBilim Malları Bilim Gereçleritarafından özel olarak üretilmiştir
peristaltik pompa ve nbsp;GilsonMinipuls 2
boruFisher Scientifickalınlığa bağlıdırTygon R3603, St-Gobain
perfüzyon sistemiWarner64-0135  ( VC-66CS)Perfüzyon valfi kontrol sistemi, eksiksiz, pinç valfli, 6 kanallı
perfüzyon regülatörleriLeventon 201108Dosi-flow 3
ölçüm ve otomasyon kaşifiBilim Ürünleri & National InstrumentsN/Ayazılımı http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
foton görüntüleyici Bilim Ürünleri & National InstrumentsN/Ayazılımı http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
foton görüntüleyiciBilim Ürünleri & National InstumentsN/Ayazılımı http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
ExcelMicrosoftN/Ayazılımı https://www.microsoft.com
sanal dublajaçık erişim N/Ayazılımı http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2Martin et al., 2007, Ref. 1 N/A{şu anda} halka açık hisse senedi yok 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Çiftlikleri, Ashburn ABD.(STOK #1117340)pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2Lima ve Misenboeck, Ref. 11 N/A{şu anda} halka açık hisse senedi yok 
OK107Bloomington stok merkezi854http://flystocks.bio.indiana.edu/

Kaynaklar

  1. Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943(2013).
  6. Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
  7. Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275(2007).
  8. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
  9. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105(2011).
  10. Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
  11. Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
  12. Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  13. Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
  14. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
  15. Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6(2003).
  16. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  17. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyol minesans G r nt lemeKalsiyum Ge ici De i imiDrosophila BeyniMantar CisimleriFoton G r nt leyiciCoelenterazineNikotin Stim lasyonuPotasyum Klor rFloresan G r nt leme
Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.