hayvan denekleri içeren Prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, Academia Sinica, Taipei, Tayvan tarafından onaylanmıştır.
1. multielectrode Dizi Kayıt için deneysel Çözüm ve Ekipman hazırlanması
- Yapay beyin omurilik sıvısı (CSF hazırlanması; 124 mM NaCI, 4.4 mM KCI, 1 mM NaH 2% 95 O fokurdatıldı PO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 25 mM NaHCO 3, ve 10 mM glükoz, 2 ve % 5 CO2).
- 6 x 10 düzlemsel MEA ve 8 x 8 MEA: MEA prob iki tür kullanın. Eski prob korteks, striatum ve talamus oluşur bölgeyi kapsar. İkinci prob sadece kortikal bölgeyi kapsar.
- 0.1 Hz ve 1.200 amplifikasyonu 3 kHz arasında yer alan bir bant geçiren filtre ile 60 kanallı amplifikatör kullanın. 10 kHz örnekleme hızında veri edinin.
- DCS MEA odasının içine iki AgCl kaplı gümüş telleri yerleştirin. AgCİ kullanın-kaplı gümüş teller izole bir stimülatör tarafından oluşturulan elektrik alanları üretmek.
- tungsten elektrot (; uzunluk, 7,62 cm; 8 ° AC konik uç, çap, 127 mikron direnç, 5 M?) koyun talamik stimülasyon için, ve MEA odasında referans elektrot yerleştirin. Darbe üreteci tarafından kontrol edilir izole bir stimülatörü kullanılarak tungsten elektrotun akımları sunun.
2. Beyin Dilim Hazırlık
- 4-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareler, kullanın. Ev klimalı odada hayvanlar yiyecek ve suya serbest erişimi (21-23 ° C;% 50 nem / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü, 8:00 ışıklar 12 saat).
- Aşama 1.1'de elde edilmiştir aCSF 250 ml'lik bir şişe alın ve buz içeren bir behere yerleştirin. Aynı zamanda,% 95 O2 ve% 5 CO2 oluşan sürekli gaz kaynağı.
- cerrahlık
- bir bardak% 4 izofluran ile hayvan anestezisiYaklaşık 3 dakika boyunca kutu. hayvan (ayak tutam yanıt eksikliği ile gösterilir) anestezi cerrahi derinliğe ulaştığında, ezilmiş buz dolu sığ bir tepsiye yerleştirin ve makas kullanılarak baş kaldırmak.
- kafatası maruz ve kalan kas keserek. Daha sonra, rongeurs kullanılarak, beyinden kafatası dorsal yüzeyini soyularak. rongeurs kullanılarak kafatası kenarlarını uzak kesin. % 75 etanol çözeltisi ile cerrahi aletler tüm sterilize edin.
- Bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku ampuller ve sinir bağlantılarını kesti ve beyin kaldırmak. Başlarının kesilmesi işleminden sonra, hızlı bir şekilde buz gibi soğuk oksijenli aCSF ile dolu bir beher beyin aktarın.
- Medial Talamus (MT) -ACC Beyin Slice hazırlanması
Not: ACC 13 MT yolu ihtiva dilimleri hazırlayın. - 2,0 mm Her yarımkürede orta hatta yanal iki sagital kesim ile beyin blok El-cutsubkortikal anatomiyi görüntülemek için. Sonra iki açılı kesimler yapmak. striatum görünür lif yollarının ilk çapraz kesim paralel olun.
- thalamocingulate yoluna ventral ve paralel olan ön komissür ve optik yolu arasındaki orta noktasına beyincik ve görsel korteks arasındaki bağlantıdan ikinci çapraz kesim olun.
- siyanoakrilat yapıştırıcı ile bir açısal plaka (~ 120 °) beyin bloğunu takın ve sadece yolun dönüm noktasının üzerinde bir kesim yapmak. , Plaka açın düzeltin ve bir vibratome odası sahneye tutkal.
- Medial talamus-ACC beyin kesitleri daha sonra (500 mikron kalınlığında) ve 1 oksijenli ACSF kayıt odasına buz soğukluğunda oksijenli aCSF.Transfer dilimleri sokmaktan ve sürekli perfüzyon (12 ml / dakika) altında 32 ° C 'de devam olun hr.
Multielectrode Dizi Kayıt için Perfüzyon Odası 3. hazırlanması
- HazırlıkPerfüzyon Odası
- Bir çok kanallı sistemde, bir MEA sonda yerleştirin ve bir peristaltik pompa prob bağlamak için iki ayrı polietilen boru kullanımı. MEA odası ve odanın dışına çıkması aCSF kılavuz diğer tüp içine aCSF yol bir tüp kullanarak. Son olarak, sürekli sıcak (29-30 ° C), oksijenli aCSF (8 mL / dakika) ile hazırlanmasını serpmek.
- MEA beyin dilim aktarın. ıslak pamuklu çubuk kullanarak MEA beyin dilim basılı tutun. Dikkatle ACC elektrotlar üzerinde odaklı sağlamak için beyin dilim taşıyın.
- beyin dilim basın dilim çapa kitleri tutun-çıkışlar kullanın. Bu adım, bir dilim ve elektrotların arasında iyi bir elektrik bağlantısı sağlar.
DCS Elektrik Alanlarının 4. Nesil
Not: elektrik alan yönlendirme tanımı ACC Aksodendritik ekseni yönünde dayanmaktadır. dendrit ve soma bölmelerinin yönelimleri vardıGolgi boyama 12 kullanılarak doğruladı.
- ACC proksimal (anot olarak tanımlanır) AgCl elektrot yerleştirin ve ACC uzak (katot olarak tanımlanır) diğer elektrot yerleştirin. MEA iki alan yönelimleri (ACC Aksodendritik liflere paralel ve dik) tarafından oluşturulan alan mukavemetini kaydedin ve bir uyarıcı kullanarak elektrik alanların akımlarını sunar.
- AgCl elektrotlar (yaklaşık 1.5-2 cm) mesafe düzeltmek ve mA 0.5 ila 2 DCS yapmak için stimülatörü mevcut gücünü ayarlamak.
5. Elektrik kaynaklı Kortikal Synaptic Yanıtları
Not: Bir programlanabilir elektriksel uyarı jeneratör dikdörtgen bifazik akım darbeleri üreten hangi MT elektrik stimülasyonu ile ACC sinaptik yanıtları neden.
- Yukarıda tekrarlayın Bölüm 3.
- MT tungsten elektrot yerleştirin ve Thal stimülatör gelen bakliyat teslimBipolar tungsten elektrotlar aracılığıyla dilim amic bölgesi.
- ACC tepkisi uyandıran eşik belirlemek için çeşitli akım şiddetleri kullanın. Burada, en dilimler halinde ACC% 80 maksimal yanıtı ortaya çıkardı 200 mikro saniye olduğu bir ± 150 uA yoğunluğunu ve süresini, kullanın.
- Optimal cevabı profillerini elde etmek için MT-ACC dilim (korpus kallosum için MT) thalamocingulate yolu boyunca tungsten elektrot hareket ettirin.
- ACC cevapların 10-20 silerler ve yazılım kullanmak, MT uyarılması ile ACC tüm ortalama otomatik. MT-ACC yolunun MT stimülasyon uyarılan ACC sinaptik yanıtları ISS sonucu.
6. Elektrik kaynaklı Nöbet benzeri Etkinlik
(250 uM 4-AP) ve bicuculline (5 uM) felç benzeri aktivitesi 4-aminopiridin uygulanması ile indüklendi: edin. Önceki Zaman-kontrol çalışmaları maksimal ve istikrarlı tepkiler ortaya çıktığını gösterdiIlaç uygulaması 14 sonra 2-3 saat.
- Yukarıdaki tekrarlayın Bölüm 5.
- perfüzyon çözeltisine ilaçlar ekleyin. 4-AP (250 uM) ve bicuculline (5 mcM) kullanın. eşit uyuşturucu karıştırın ve 2-3 saat perfüzyon devam ediyor.
- nöbet gibi aktivitesi sağlamak için, ayrıca bir pH gradyanı birikmesini önlemeye yardımcı olabilir nispeten hızlı bir perfüzyon oranı (8 mL / dakika), perfüzyon pompası korumak.
- MT tungsten elektrot yerleştirin ve ACC yanıt profillerini elde etmek için elektrik stimülasyonu (150 uA, 200 mikro-sn süre) teslim.
- 10-20 silerler ve yanıtları ortalama.
- uyuşturucu yıkamak için taze aCSF ile perfüzyon çözümü değiştirin. Tekrarlayın Adım 6.5.
Uyarılmış Kortikal Yanıtları üzerinde DCS 7. Test Etkisi
- Tekrarlayın Bölüm 3 ve 4. o üniforma elektrik alanları M içine yerleştirilir iki paralel AgCl kaplı gümüş telleri arasındaki akımlar geçirerek tarafından oluşturulan emin olunEA odası. herhangi bir sorun varsa, DCS 0.5 ve 2 mA arasında kalır.
- DCS kapatın ve (150 uA, 200 mikro-sn süresi ±) talamus uyarmak için bir tungsten elektrot yerleştirin. ACC, maksimum sinaptik yanıtları elde 10-20 silerler ve yanıtları ortalamasını.
- Eşzamanlı olarak DCS (2 mV / aa DCS gücü) ve talamik stimülasyon (350 uA, 200 mikro-sn süre) açın. DCS sırasında talamik stimülasyon uyarılmış ACC yanıtı genlik değişiklikleri değerlendirmek.
- DCS kapatın ve perfüzyon çözüm 4-AP (250 uM) ve bicuculline (5 mcM) ekleyin. Sonra 2-3 saat bekleyin. Uyuşturucu beyin dilim etkiler zaman dilim kortikal nöbet yanıtları üretir.
- ACC yanıtların 10-20 Piyango yapın ve ardından elektrik uyarılmış kortikal nöbet yanıtları genlik ve süresini ölçün.
- Adım 7.5 sonra aynı anda (DCS (2 mV / aa DCS gücü) ve talamik stimülasyon 150 uA, 200 durati çevirmekmikro-saniye üzerinde). DCS uygulama esnasında genlik ve uyarılmış kortikal nöbet yanıtları süresi değişiklikleri değerlendirmek.
- uyuşturucu yıkamak için taze aCSF ile perfüzyon çözümü değiştirin ve tekrar 7.2 ve 7.3 adımları tekrarlayın.
- farklı deneysel koşullar veri kayıt tüm verileri toplamak ve grup. farklı deneysel koşullar altında kortikal nöbet yanıtları genlik ve süresini değerlendirin.
8. Veri Analizi
- (Örneğin, MC Raf yazılım) otomatik olarak kaydedilir yanıtları ortalamasını yazılımı kullanın ve bir elektronik tabloya ham veri ihracat. Ham veri genliği ve süresi Analiz ve renkli resimler üretir.
- salınım nöbet olaylarını tespit etmek, temel değer ve standart sapma (SD) ölçmek için yazılımı kullanın. eşik olarak gürültü seviyesi 3 SD ayarlayın. Bu eşiği aşan bir salınım olayı sırasında zirvelerin genlikleri otomatik olarak tespit edilirEd.
- Student t-testi kullanılarak istatistiksel analiz.
- Dilim sayısını belirten n Ekspres ölçümler ve SE ortalama ± olarak metinde varyans (ANOVA) sonuçları tek yönlü analizi, 12 okudu.