Burada, IRF3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyona bağlı aktivasyonunun ayrıntılı bir analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
IRF3 transkripsiyon faktörü, esas olarak interferon β ve antiviral gen ekspresyonu yoluyla patojenlere karşı ilk savunma hattı için kritiktir. IRF3 aktivasyonunun ayrıntılı bir analizi, patojenlerin doğuştan gelen antiviral yanıtı nasıl indüklediğini veya kaçtığını anlamak için gereklidir. IRF3'ün farklı aktive edilmiş formları, fosforilasyonlarına ve monomer ve dimer durumlarına göre ayırt edilebilir. İn vivo olarak farklı aktive edilmiş IRF3 türleri arasındaki ayrım, IRF3 fosforile formlarının SDS-PAGE üzerindeki hareketlilik kaymalarına dayalı olarak ayrılması yoluyla elde edilebilir. Ek olarak, IRF3 monomer ve dimer seviyeleri, denatüre olmayan elektroforez kullanılarak izlenebilir. Burada, IRF3 aktivasyon durumu hakkında en fazla bilgiyi elde etmek için en yüksek çözünürlüğe ulaşmak için bir prosedürü detaylandırıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu total ve fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir. Bu deneysel strateji, IRF3'ün fosforilasyon aracılı aktivasyonunun tam bir analizi için gerekli tüm bilgileri elde etmek için uygun maliyetli ve hassas bir yaklaşım oluşturur.
Giriş
Yayg ve yapısal olarak ifade transkripsiyon faktörü İnterferon (IFN) Düzenleyici Faktör 3 (IRF3) çoğunlukla IFNβ indüksiyonu yoluyla patojenlere karşı ilk savunma hattı için kritik değil, aynı zamanda kemokin (CC motif) indüksiyonu ligandı 5 (CCL5 yoluyla ) ve tetratricopeptide ile IFN ile uyarılan proteini dahil olmak üzere birçok antiviral proteinlerdir IFIT1 / 2/3 3/1 tekrarlar. Ya da lipopolisakkarid (LPS) 4: IRF3 aktivasyonu poli-inozinik-polisitidilik asit (poli I Cı) için aşağıdaki sayıda virüs enfeksiyonu veya maruz kalma bildirilmiştir. Önemlisi, en çok çalışılan virüsler IRF3 aracılı yanıtı kaçmasına ve böylece ev sahibi doğuştan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: protokol Sendai virüsü (SeV) ile enfekte A549 hücreleri kullanılarak burada açıklanmıştır. Bununla birlikte, SDS-PAGE ve yerel PAGE için protokol aynı zamanda bugüne kadar test edilen tüm insan ve kemirgen hücre tipleri, çeşitli IRF3 aktive uyarıcı 9,15,19,24,25 ile uyarılmış, özellikle miyeloid hücrelerin ile çalışır.
A549 Hücrelerinin 1. Enfeksiyon
- 37 ° C /% 5 CO2 20 bir 15 sm'lik plaka içinde kültür içinde A549 hücreleri korumak mi 10% ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (HI-FBS) ve% 1 L-glutamin içeren F12K / Ham ortamı (komple F12K / Ham ortamı).
NOT: hücre kültürü ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2, yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ile BOA'da giderilmesinden sonra, Ser396 ve Ser398 karşı IRF3 toplam antikorlar ve IRF3-fosfospesifık antikorlar ile IRF3 tipik bir immunoblot görüntüsünü göstermektedir. Uyarılmamış A549 hücrelerinde, IRF3 50 ° C'de iki grup ve olmayan fosforile (form I) 'e uygun SDS-PAGE üzerinde 53 kDa ve hipofosforile (Biçim II) IRF3 türleri olarak tespit edilir. Zamana bağımlı vardiyada 9 saat sonuçlar yavaş yavaş I biçimlerinden de .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tarif protokolü IRF3 dimerik / monomerik ve phosphoforms I-IV ayırt birçok fosfospesifık antikorların kullanımı bağlanmış yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ve nativ-PAGE bir kombinasyonundan oluşur. Bu IRF3 türlerin uygun algılama tam belirli bir ortamda IRF3 aktivasyonunu tanımlamak için gereklidir. Örneğin, aktive makrofajlar LPS uyarımı, hipofosforile edilmiş (Biçim II) sahip dimerik, Ser396 / 398 fosforile IRF3 oluşmasına yol açar, ancak SDS-PAGE 15 (Form III ve IV), desen hiperfosforile değildir. Tarif.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, protokollerin geliştirilmesi için laboratuvarın önceki ve mevcut üyelerine teşekkür eder. Çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) [hibe # MOP-130527] ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden [NSERC-355306-2012] sağlanan fonlarla desteklenmiştir. NG, Tier II Kanada Araştırma Kürsüsü sahibidir. AR, Fonds de la recherche du Québec-Santé'den (FRQS) Solunum Sağlığı Araştırma Ağı'nın eğitim programından bir öğrenciye sahiptir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| F12/Ham Life | Technologies | 11765-054 | 37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C banyosu yapın. |
| Fetal sığır serumu | Yaşam Teknolojileri | 12483-020 | |
| L-glutamin | Yaşam Teknolojileri | 25030-081 | |
| D-PBS | Yaşam Teknolojileri | 14190-144 | Hücre kültürü için. |
| Tripsin / EDTA 0.25 | %Yaşam Teknolojileri | 25200-072 | |
| Sendai virüsü Cantell Suşu | Charles Nehri Laboratuvarları | 600503 | |
| Hepes Bioshop | HEP001 | ||
| Sodyum klorür (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Gliserol Bioshop | GLY001.1 | Ucun uç kısmını kesin ve çok kalın olduğu için yavaşça pipetleyin. | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol (Nonidet P-40) deterjan |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin Bioshop | APR600.25 ve nbsp; | ||
| Sodyum florür | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodyum ortovanadat | MP Biyomedikal | 159664 | Sodyum ortovanadat 0.2 M'nin aktivasyonu: 1) 1 N NaOH veya 1 N HCl kullanarak pH'ı 10.0'a ayarlayın. Sodyum ortatovandat çözeltisinin başlangıç pH'ı çok sayıda kimyasala göre değişebilir. 2) Çözelti pH 10.0'da sarıdır. 3) Renksiz olana kadar kaynatın. 4) RT'ye kadar soğutun. 5) pH'ı 10.0'a geri getirin ve çözelti renksiz kalana ve 10.0'da stabilize olana kadar 3-4 adımlarını tekrarlayın. Aktif sodyum ortovanadat alikotlarını -20 ° C'de saklayın. |
| p-nitrofenil fosfat disodyum tuzu hekzahidrat | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Gliserofosfat | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Test Reaktifi | Bio-Rad | 500-0006 | Sitotoksik |
| Akrilamid / Bis-Akrilamid (37.5: 1) %40 | Bioshop | ACR005 | Sitotoksik |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hidroklorik asit (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Çeker ocak altında çalışın. Toksik ve tahriş edici. |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | ırritan. |
| Amonyum persülfat | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toksik ve tahriş edici. |
| Bromofenol mavisi | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Çeker ocak altında çalışın. Sinir sistemi, mukoza zarları için toksiktir. Üst solunum yolları, gözler, merkezi sinir sistemi için toksik olabilir. |
| Glisin | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodyum deoksikolat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodyum hidroksit (NaOH) | Bioshop | SHY700 | ırritan. |
| Nitroselüloz membran (0,45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Asetik asit buzul | Bioshop | ACE222.4 | Çeker ocak altında çalışın. Toksik, tahriş edici ve yanıcı. |
| Kırmızı ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potasyum klorür (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 ve nbsp; | İmmünoblot için PBS bileşimi için. |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | Bioshop | SPD307.5 | İmmünoblot için PBS bileşimi için. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | İmmünoblot için PBS bileşimi için. |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | A7906 | İmmünoblot için PBS-T-BSA bileşimi için. |
| Yağsız kuru süt | Karanfil | ||
| Poli sorbat 20 (Tween) | MP Biyomedikal | 103168 | Çok kalın olduğu için ucun ve pipetin uç kısmını yavaşça kesin. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-Amerika | 18783 | -20 oC'de alıntılanan mağaza Donma/çözülmeyi önleyin. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Ev yapımı19 | -80 oC'de aliquoted Donma/çözülmeyi önleyin. | |
| Fosfo-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 4947s | -20 oC'de saklayın. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Ev yapımı15 | Store aliquoted -80 oC'de donma/çözülmeyi önleyin. | |
| Anti-IRF-3-tam uzunlukta | Actif motifi | 39033 | -80 oC'de aliquoted olarak saklayın. Donma/çözülmeyi önleyin. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Mağaza -20 oC'de alıntılanmıştır. |
| Western Lightning Kemilüminesans Reaktifi Plus | Perkin-Elmer Yaşam Bilimleri | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD kamera cihazı | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Moleküler Ağırlık Standartları, Geniş Ürün Yelpazesi | Bio-Rad | 161-0317 | -20 oC'de aliquoted Mağaza. |
Kaynaklar
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
