Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

11.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53723

⸱

24 Ocak 2016

 ,  ,  , 
1CRCHUM - Research center, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, IRF3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyona bağlı aktivasyonunun ayrıntılı bir analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir.

Özet

IRF3 transkripsiyon faktörü, esas olarak interferon β ve antiviral gen ekspresyonu yoluyla patojenlere karşı ilk savunma hattı için kritiktir. IRF3 aktivasyonunun ayrıntılı bir analizi, patojenlerin doğuştan gelen antiviral yanıtı nasıl indüklediğini veya kaçtığını anlamak için gereklidir. IRF3'ün farklı aktive edilmiş formları, fosforilasyonlarına ve monomer ve dimer durumlarına göre ayırt edilebilir. İn vivo olarak farklı aktive edilmiş IRF3 türleri arasındaki ayrım, IRF3 fosforile formlarının SDS-PAGE üzerindeki hareketlilik kaymalarına dayalı olarak ayrılması yoluyla elde edilebilir. Ek olarak, IRF3 monomer ve dimer seviyeleri, denatüre olmayan elektroforez kullanılarak izlenebilir. Burada, IRF3 aktivasyon durumu hakkında en fazla bilgiyi elde etmek için en yüksek çözünürlüğe ulaşmak için bir prosedürü detaylandırıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu total ve fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir. Bu deneysel strateji, IRF3'ün fosforilasyon aracılı aktivasyonunun tam bir analizi için gerekli tüm bilgileri elde etmek için uygun maliyetli ve hassas bir yaklaşım oluşturur.

Giriş

Yayg ve yapısal olarak ifade transkripsiyon faktörü İnterferon (IFN) Düzenleyici Faktör 3 (IRF3) çoğunlukla IFNβ indüksiyonu yoluyla patojenlere karşı ilk savunma hattı için kritik değil, aynı zamanda kemokin (CC motif) indüksiyonu ligandı 5 (CCL5 yoluyla ) ve tetratricopeptide ile IFN ile uyarılan proteini dahil olmak üzere birçok antiviral proteinlerdir IFIT1 / 2/3 3/1 tekrarlar. Ya da lipopolisakkarid (LPS) 4: IRF3 aktivasyonu poli-inozinik-polisitidilik asit (poli I Cı) için aşağıdaki sayıda virüs enfeksiyonu veya maruz kalma bildirilmiştir. Önemlisi, en çok çalışılan virüsler IRF3 aracılı yanıtı kaçmasına ve böylece ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık savunma mekanizmaları 5 kaçmak için gelişmiştir. Böylece, IRF3 aktivasyon izleme doğuştan antiviral konak savunma moleküler mekanizmalarını anlamak için değil, aynı zamanda bu tepkiyi ortadan kaldırmak için virüsler tarafından kullanılan stratejiyi belirlemek için büyük önem taşımaktadır.

ent "> yayınlanmış bir çok rapor Ancak düşük çözünürlüklü, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezine bağlanmış IRF3-hedef gen indüksiyonu izlenmesi (IFNB1 ve IFIT1) tarafından gerçekleştirilen IRF3 aktivasyonu ve / veya lusiferaz raportör geni deneyinde sadece sınırlı analizi sağlar (SDS- PAGE) IRF3 analizi. Ancak, çok sayıda biyokimyasal çalışmalar çeşitli IRF3 mutantlar ve IRF3 kristal yapısı 6-11 aydınlatılması davranış analizi de fosforilasyonu ile sıralı post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi karmaşık tabi tutulması IRF3 kurmak katkıda Birden çok siteleri. IRF3 aktivasyonunda rol fosforilasyon grubu hücre tipine uyarıcı bağlıdır ve en muhtemel görünmektedir. enfekte edilmemiş hücrelerde, IRF3 fosforilatlanmamış ve hipofosforile türleri 1, Thr135 ve Ser173 içeren phosphoresidues, ihtiva eden birlikte görülmektedir -198 aa N-terminal bölgesi 6,12-14. Bu hipofosforile f birikimiIRF3 biçiminde olabilecektir stres indükleyicileri, büyüme faktörleri ve DNA'ya hasar veren ajanlar 6 tarafından indüklenir. Transaktivasyon domenini ihtiva eden IRF3 C-terminal bölgesinde Ser / Thr tortularının fosforilasyonu virüs ile aktivasyonunun takiben tetiklenmektedir, poli I: bir hücre tipine bağlı bir şekilde 15-17 C ve LPS. IRF3 C-terminal fosforilasyonu her dimerizasyonu yoluyla IRF3 aktivasyonu, nükleer birikimi, CREB ile birlikte katkı yapan iki ana grupta, Ser385 / Ser386 ve Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 düzenlenen en az 7 farklı phosphoacceptor sitesi içermektedir bağlayıcı protein (CBP) / p300 koaktivatör, hassas tepki elemanı (ISRE) konsensüs dizileri ve hedef genlerin 9,10,17-19 transaktivasyonunu IFN bağlama DNA. Thr390 fosforilasyonu, aynı zamanda, virüs kaynaklı IRF3 aktivasyonu 20 katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Kütle spektrometrisi IRF3 analizleri Ser386, Thr390, Ser396 ve Ser402 tortuları doğrudan doğruya phosphorylat olduğunu göstermiştirkB kinaz inhibitörü ε (IKKε) tarafından ed / TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1) 9,10 kinaz. C-terminal tortularının fosforilasyonu de, aynı zamanda polıubikutın eklemeyi ve proteazom aracılı degradasyon 10 boyunca IRF3 aktivasyon sonlandırılması için gereklidir. Bu süreç aynı zamanda propil izomeraz Pin1 10,11 alımı için gerekli olan Ser339 de fosforilasyonu, bağlıdır. En az fosfo-Ser339 / 386/396 kalıntıları içeren IRF3 türleri hiperfosforile formlar olarak kabul edilir. Her sitenin tam sırası ve fonksiyon tartışma 10,21 meselesi olmaya devam etmektedir. Bu aktive IRF3 homojen bir devleti temsil etmez, ancak farklı fosforilasyon veya dimerizasyon karakteristiklerini gösteren farklı aktif türlerin 10,22 mevcut olduğu açıktır.

Belirli patojenlere karşı yanıt olarak IRF3 aktivasyon tam bir anlaşılmasını sağlamak için, ch böylece gerekli olanuyarılmaktadır aktifleştirilen türlerin bu aracterize. IRF3 hedef genlerin, IFNB1 ve IFIT1 indüksiyonu, IRF3 aktivasyonu için güvenilir bir okunmasını sağladığı kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, bu genlerin ekspresyonunu takip ve kontrol IRF3 farklı aktivasyon durumları arasında ayrım yapmaz. Belirli bir ortamda IRF3 aktivasyon devletler kapsamlı bir analizi onun fosforilasyon ve dimerizasyon durumunun 10 detaylı karakterizasyonu dayanır. Fosforlanmamış (Biçim I), (Biçim II) ve hiperfosforile hipofosforile (formlar III ve IV) IRF3 formları 6,18,23 başarılı bir şekilde yüksek çözünürlük, SDS-PAGE analizinde azalan hareketlilik çözülebilir. Monomerik ve dimerik IRF3 türleri etkili bir nativ-PAGE analizi ile tespit edilebilir. Farklı IRF3 phosphoacceptor sitelerinin karşı fosfospesifık antikorlar ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman bu yaklaşımlar büyük ölçüde daha iyidir.

Standart protokoller kötü bir çözünürlük izinfarklı IRF3 fosforilatlanmış biçimlerine etkili ayrılmasına izin vermez proteinler. Burada, toplam ve fosfospesifık antikorlar kullanılarak bağışıklık beneklenme ile kombinasyon halinde doğal-PAGE bağlanmış SDS-PAGE kullanılarak farklı virüs aktive IRF3 türlerinin meydana getirmenin gözlenmesi için en yüksek çözünürlük elde etmek için detaylı bir prosedür açıklanmaktadır. Etkin arasında farklı in vivo ayrımı IRF3 formları SDS-PAGE üzerinde görülen hareketlilik vardiya dayalı yapılır. Buna ek olarak, IRF3 monomer ve dimer denatüre edici olmayan elektroforez ile ayırt edilebilir. İmmunoblotta bu iki tamamlayıcı tekniklerin kombinasyonu IRF3 fosforilasyonu aracılı aktivasyonu tam bir analizi için gerekli tüm bilgileri elde etmek için bir ekonomik ve duyarlı bir yaklaşım olduğunu kanıtlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: protokol Sendai virüsü (SeV) ile enfekte A549 hücreleri kullanılarak burada açıklanmıştır. Bununla birlikte, SDS-PAGE ve yerel PAGE için protokol aynı zamanda bugüne kadar test edilen tüm insan ve kemirgen hücre tipleri, çeşitli IRF3 aktive uyarıcı 9,15,19,24,25 ile uyarılmış, özellikle miyeloid hücrelerin ile çalışır.

A549 Hücrelerinin 1. Enfeksiyon

  1. 37 ° C /% 5 CO2 20 bir 15 sm'lik plaka içinde kültür içinde A549 hücreleri korumak mi 10% ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (HI-FBS) ve% 1 L-glutamin içeren F12K / Ham ortamı (komple F12K / Ham ortamı).
    NOT: hücre kültürü ve tedavi için kullanılan bütün çözeltiler steril olması gerekmektedir.
  2. Enfeksiyondan önce 24 saat sonra, ortam aspire ve damıtılmış fosfat tamponlu tuzlu su, oda sıcaklığında (D-PBS) 10 ml yıkama hücreleri.
  3. Hücrelerin kapak ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyona her plaka,% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1 ml ilave edilir.
  4. En kısa sürede inci gibi inkübasyon durdurune hücreler yumuşak bir yandan plaka dokunarak plakadan kopmaya başlar. Plaka başına önceden ısıtılmış tam bir F12K / Ham vasatı içinde 10 ml ilave etmek suretiyle, tripsin inaktive ve 15 ml konik bir tüp hücreleri transferi.
  5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 350 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve özellikle de homojen tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tam bir F12K / Ham vasatı 8 ml hücre pelletini.
  6. Hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Önceden ısıtılmış tam bir F12K / Ham vasatı içinde 4 ml 60 mm plaka başına 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücreler Seed. 20 inkübe - 37 ° C /% 5 CO 2. 24 saat sonra, 20 - 24 saat, hücreler% 90 konfluent tek tabaka (bu, 1.5 x 10 6 hücre karşılık gelir) oluşturur.
  7. Ortamı çıkarın ve serumsuz F12K / Ham vasatı içinde 2 ml (SFM) ile hücrelerin yıkayın. 60 mm plaka başına taze SFM 2 ml ekleyin.
  8. Kısaca buz ve vorteks (saklanan -80 ° C'de aliquoted) Sendai virüsü (SeV) bir kısım çözülme.
  9. Th seyreltinÖnceden ısıtılmış SFM e virüsü 60 HAU / 100 ul elde etmek. Aşağı usulca yukarı pipetleme karıştırın ve 40 HAU / 10 6 hücre enfeksiyon gerçekleştirmek için plaka başına seyreltilmiş virüsün 100 ul ekleyin. Enfekte olmayan kontrol plakası virüs katmayın.
  10. 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörde inkübe hücreleri. Elle 3 veya 4 kere plakaları ajitasyon ya da enfeksiyon ilk bir saat boyunca, inkübatör doğrudan yerleştirilir otomatik yörüngesel veya sallanan karıştırıcı kullanılarak.
  11. 2 saat sonrası enfeksiyon,% 10 HI-FBS bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere% 20 HI-FBS içeren F12K / Ham orta 2 ilave edin.
  12. Sırasıyla, 3, 6 ve 9 saat toplam enfeksiyon süreleri için ek bir 1, 4 ve 7 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörde inkübe hücreleri. Bu zaman noktalarının her birinde, 2.1 adıma devam eder.

Tüm Cep Ekstraktlarının 2. Hazırlık (BOA)

  1. Enfeksiyon orta çıkarın. 1 ml kazıma yoluyla hücreler hasatve buz gibi soğuk D-PBS önceden soğutulmuş bir 1,5 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
  2. 20 sn için 4 ° C'de 16,000 x g'de santrifüj ile hücreler Pelet ve dikkatli bir şekilde, D-PBS tüm izlerini süzün.
    NOT: Bu adımda, hücre peleti, doğrudan protein ekstraksiyonu ve flaş dondurulmuş sıvı azot ya da kuru buz / etanol banyosu içinde liziz kadar -80 ° C'de saklanır tabi tutulabilir.
  3. 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA,% 10 gliserol ve% 1 Nonidet P-40 deiyonize su içinde ihtiva eden liziz tamponu (GKD 2 O). Irticalen proteazı (1 ug / ml löpeptin ve 2 ug / ml aprotinin) ve fosfataz inhibitörleri ekleyin (5 mM sodyum fluorür, 1 mM sodyum ortovanadat, 2 mM p-nitrofenil fosfat ve 10 mM β-gliserofosfat pH 7.5 aktive edilmiş).
    Not: inhibitörsüz lizis tamponu, 4 ° C'de saklanabilir. Sodyum ortovanadat aktivasyonu için özel bir protokol, spesifik reaktifler / sanayii Tablo anlatılannt.
  4. Liziz tamponu 70 ul hücre pelletini. Tipik lizat konsantrasyonu / ul yaklaşık 2 mg olacak.
  5. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 15 sn için bir sıvı azot banyosu içinde inkübe edilerek, lizat flaş dondurma. Tamamen 10 sn için eritilmiş ve vorteks kadar oda sıcaklığında lizat çözülme. Donma / çözülme / Vortex döngüsü 3 kez tekrarlayın.
    1. Seçenek olarak ise, 1 dakika süre ile, bir etanol / kuru buz banyosu içinde dondurma adımı gerçekleştirin.
  6. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'de santrifüjleyin. Yeni ön soğutulmuş 1,5 ml santrifüj tüpüne süpernatant (WCE tekabül eder) aktarın. Her zaman buz üzerinde KKE tutun.
  7. Örneğin Bradford bazlı protein tahlili 26 olarak liziz tamponu ile uyumlu herhangi bir protein ölçümü prosedürü kullanılarak proteinleri ölçmek.

Yüksek Çözünürlüklü SDS-PAGE ile KKE 3. Çözünürlük

  1. Üç denatüre elektroforez jelleri hazırlayın.
    1. Saptanması için(1: 37,5), 375 mM Tris-HCI pH 8.8 (RT),% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS IRF3 formları,% 7.5 akrilamid / bis-akrilamid oluşan bir ayırma jel ile 16 cm uzunluğunda en az iki jeller dökün ),% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 GKD 2 O TEMED ve% 4 akrilamit oluşan bir istifleme jeli, 62,5 mM Tris-HCI, pH 6.8 (RT),% 0.05 SDS,% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 GKD 2 TEMED O.
      Dikkat! Akrilamid, TEMED ve SDS zehirli ve / veya tahriş edici bulunmaktadır. Koruyucu eldiven giyin ve davlumbaz altında manipüle.
    2. SeV proteinlerinin tespiti için, ayırma jeli% 12 akrilamid içeren hariç 3.1.1'de tarif jele benzer özelliklere sahip 8.5 cm uzunluğunda en az bir jel dökün.
  2. 1 eklenerek adım 2.6 'de elde edilen denatüre WCE: 4 (h / h) 5x yükleme tamponu (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT),% 10 SDS,% 20 (p / v) gliserol,% 0.0005 bromofenol mavi ve 100 ° C'de, ardından bir ısıtma GKD 2 O içinde% 25 β-merkaptoetanol)10 dakika işleme sokuldu. Hızlı sıkma tüpleri kap formları yoğunlaşmayı çökertmek için.
    Dikkat! β-merkaptoetanol Teneffüs edilmesi toksiktir. Koruyucu eldiven giyin ve davlumbaz altında manipüle.
  3. Geçiş tertibatında jeller monte edin. 25 mM Tris-Base,% 0.1 SDS ve damıtılmış su içinde 192 mM glisin (dH 2 O) ihtiva eden tampon maddesi ile, üst ve alt bölmeleri doldurun.
  4. Yük, her 16 cm jel bir oyuk moleküler ağırlık standart 14 ul 8.5 cm jel bir oyuk moleküler ağırlık standart 7 ul. IRF3 formları tespiti için aşama 3.1.1 hazırlanan iki jellerin oyuk başına denatüre BOA'da yük 30 ug (adım 3.2 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). Yük 8 - SeV analizi için aşama 3.1.2 hazırlanan jel üzerinde oyuk başına denatüre BOA'da 10 ug (adım 3.2 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır).
  5. Göç ön jel alt ulaşıncaya kadar 30 mA sabit akımda jeller çalıştırın.
    NOT: Göç genellikle approxima sürertely 16 cm jel 3 saat ve 8.5 cm jeli 45 dk.
  6. Nitroselüloz membranlar (aşama 5) üzerine transfer edin.

Yerli-PAGE ile IRF3 dimerizasyonunu 4. Analizi

Not: Bu yöntem ilk olarak Dr. T. Fujita 27 grubu tarafından tanımlanmıştır.

  1. (-) Ve alt (+) odası elektroforez tamponlar, üst hazırlayın. Üst bölme tamponu GKD 2 O. 25 mM Tris-HCl, pH 8,4 (RT), 192 mM glisin ve% 1 sodyum deoksikolat (DOC) oluşmaktadır Alt bölme tamponu GKD 2 O. 25 mM Tris-HCl, pH 8,4 (RT) ve 192 mM glisin içeren
    Not: Üst ve alt bölme elektroforez tamponlar, kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Ancak, elektroforez gerçekleştirmeden önce oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış emin olun.
  2. , 375 mM Tris-HCI pH 8.8 (RT),% 1 cephane:% 7.5 akrilamid / bis-akrilamid (1 37,5) ihtiva eden 8.5 cm uzunlukta, en az bir denatüre edici olmayan çözme jel dökünGKD 2 O. TEMED nium persülfat ve% 0.1
  3. Buz üzerinde 30 dakika boyunca 40 mA sabit akımda jel ön çalıştırın. Yaklaşık alt kamara elektroforez tamponunun seviyesine buz içine koşu aparatı basın. Jel buz değildir önemlidir.
  4. 1 (h / h) ile kombine 2 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT),% 30 gliserol ve% 0.1 bromofenol mavisi ihtiva eden O.: ön çalışma sırasında, WCE 2x nativ-PAGE yükleme tamponu 1 ile buz üzerinde tutulmalıdır karıştırın
  5. Yük 8 - hemen önce çalışma sonunda (adım 4.4 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), 10 ug WCE.
  6. Ön çalıştırmak için yukarıda tarif edildiği gibi geçiş cephesinin, jel (yaklaşık 40 dakika) alt ulaşıncaya kadar, buz üzerinde 25 mA sabit akımda jel çalıştırın.

IRF3 Türlerin 5. İmmüno-lekeleme Analizi

  1. GKD 2 O. 25 mM Tris-Base ve 192 mM glisin içeren transfer tampon hazırlayın Buzdolabında kullanımdan önce 4 ° C'de transfer tamponu.
  2. Nitroselüloz zarın ıslak üç adet aktarma tampon içeren bir plastik / cam kutuda jeller biraz daha büyük bir boyutta kesilir. Bir köşesini keserek zarın yönünü belirtiniz. Transfer tamponu 3 kez tekrar edilebilir. Kullanımlar arasında 4 ° C'de tampon saklayın.
  3. Uncast jelleri (SDS-PAGE ve ana-PAGE) ve doğru şekilde her jel bir köşesinde kesmek.
    1. Nativ-PAGE için, transfer tampon maddesi aktarmadan önce DOC kaldırmak için SDS-PAGE tamponu içinde çalışan en az 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak, oda sıcaklığında jel inkübe edilir.
  4. 10 dakika - 5 transfer tampon maddesi içinde jelleri (SDS-PAGE ve yerli-PAGE) ile inkübe edin.
  5. Pozitif elektrot (köpük yastık / filtre kağıdı / zar / jel / filtre kağıdı / köpük yastık) doğru membranı ile bir transfer kasetinde jel başına bir transfer sandviç monte edin. Sandviç katmanları arasındaki tüm kabarcıklarını çıkarmak için dikkatli olun.
  6. Tavsiye b gibi transferini gerçekleştirmeky kullanılan transfer cihazları için üretici.
    NOT: sallanan veya orbital sallayarak platformda bir sonraki adımda tüm inkubasyon ve yıkama yapın.
  7. Transfer süresi sonunda, GKD 2 O. 7% asetik asit,% 40 etanol ve% 3 gliserol içeren sabitleme çözeltisi içinde 15 dakika boyunca zarların inkübe Membranları yıkamak PBS içinde 3 kez 5 dakika (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10.2 mM Na 2 HPO 4 ve 1,8 mM KH 2 PO 4 dH 2 O).
    Dikkat! Asetik asit toksik, tahriş edici ve yanıcı olduğunu. Koruyucu eldiven giyin ve davlumbaz altında manipüle.
    NOT: sabitleme çözümü birden çok kez tekrar edilebilir.
  8. Yerli-PAGE membran için 5.11 adıma geçin.
  9. GKD 2 O. 6,57 mM kırmızı ponceau ve 1% asetik asit içeren kırmızı bir ponceau çözeltisi içinde 1 dakika boyunca kuluçkalanmadan önce dH 2 O hızla üç SDS-PAGE membranlar durulayın
    NOT: Kırmızı ponceau çözüm r olabilir birkaç kez eused.
  10. Arka plan kırmızı lekeli protein bantları görmek için yeterli beyaz olana kadar dH 2 O membranlar durulayın. Bir kalem ile işaretçileri Not ve proteinlerin çevresinde aşırı membran kesti. Çalkalama altında PBS içinde 5 dakika boyunca kuluçkalama ile membranlar destain.
  11. Bloke çözeltisi içinde 4 ° C'de (PBS,% 0.05 Tween 20 ve% 5 yağsız kuru süt ihtiva eden en RT veya O / N oranında 1 saat süreyle inkübe edin membranlar (PBS-T-süt). Membranlar 3x 5 dakika yıkayın PBS-T.
    Not: PBS-T yıkama isteğe bağlıdır ve% 5 bovin serum albümini (PBS-T-BSA), bir sonraki aşamada (Şekil 1 ve Tablo 1) içeren PBS-T ile seyreltilmiş antikor uygulanırken, yalnızca sıkı olarak gereklidir.
  12. . Şekil 1 ve Tablo 1 'de ayrıntılı olarak, sırayla uygun primer antikorlar ile (SDS-PAGE ve yerli-PAGE'den) Dört membranlar inkübe PBS-T içinde 5x 5 dakika yıkama yapın.
"> figure-protocol-1
İmmünoblot Analizi Şekil 1. Sıra. Şematik çeşitli IRF3 fosforlu ve dimerik / monomerik formlar tespit etmek için gerekli olan tek tek SDS-PAGE ve nativ-PAGE jelleri açıklar. Immünoblot prosedürü her jelden elde edilen zarın tatbik antikorların spesifik sırası tarif edilmektedir. Anti-aktin antikor başka spesifik antikorların uygulanmasından önce numune eşit yüklemeyi sağlamak için, ilk kullanıldığı göz önünde bulundurulmalıdır. Anti-aktin antikor ile diğer dizisi de çalışır, anti-fosfo-IRF3 antikorlar sonra tatbik edildi. Sıyırma, anti-aktin ve anti-SeV antikorları veya anti-fosfo-IRF3 nedeniyle sinyallerin büyüklüğünü örtüşen anti-IRF3 antikorlar arasındaki kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Birincil antikorlar, Seyreltme Seyreltme tamponu Kuluçka İkincil antikorlar, Yorumlar
Anti-Aktin 1 / 10,000 PBS-T-BSA Oda sıcaklığında 15 dakika Anti-fare SDS-PAGE sonra kullanın
% 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antibodyies birkaç kez tekrar edilebilir.
Anti-IRF3-P-Ser386 1/200 PBS-T-BSA O / N 4 ° C'de Anti-tavşan Yerli-PAGE sonra kullanın.
Bu seyreltilmiş antikor tekrar tavsiye edilmez
Anti-IRF3-P-Ser396 1 / 10,000 PBS-T-BSA O / N 4 ° C'de Anti-tavşan SDS-PAGE sonra kullanın.
Bu seyreltilmiş antikoru Anti-IRF3-P-396 hücre haberleşmesi edinilebilir yeniden tavsiye edilmez. Optimal seyreltme Bu antikor için 1 / 1.000 olarak tanımlanmıştır, ancak çok değişebilir.
Anti-IRF3-P-Ser398 1 / 10,000 PBS-T-BSA O / N 4 ° C'de Anti-tavşan SDS-PAGE sonra kullanın. Bu seyreltilmiş antikor tekrar tavsiye edilmez
Anti-IRF3 tam uzunlukta 1/7500 PBS-T-süt Oda sıcaklığında 3 saat Anti-tavşan SDS-PAGE sonra kullanın. Anti-IRF3 tam uzunlukta antikor, bir nativ-PAGE sonra kullanılabilir, ancak monomer tespit etmek için daha az duyarlıdır. % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antikorlar birkaç kez tekrar edilebilir.
Anti-IRF3-NES 0,5 ug / ml PBS-T-süt Oda sıcaklığında 3 saat Anti-tavşan Yerli-PAGE sonra kullanın. % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antibodyies birkaç kez tekrar edilebilir.
Anti-SeV 1 / 14.000 PBS-T-BSA Oda sıcaklığında 3 saat Anti-tavşan SDS-PAGE sonra kullanın. % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antibodyies birkaç kez tekrar edilebilir.
Not: HRP-bağlı sekonder antikor için kullanılan seyreltme ve tampon bunun bir şirketten diğerine değişir optimize edilmesi gerekir.

Antikorların Tablo 1. Teknik İmmünoblotting Prosedürü kullandı.

  1. (HR yaban turpu peroksidaz ile membranlar inkübeP) Şekil 1 ve Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi sekonder antikor ile konjüge edilmiş. Tam Tween izlerini ortadan kaldırmak için membranlar PBS içinde 2 x 5 dakika süre ile, PBS-T içinde 5x 5 dak, yıkayın.
  2. Tam membranlar karşılamak için yeterli geliştirilmiş kimyasal parıltı maddesi bir hacimde 1 dakika boyunca zarların inkübe edin. Filtre kağıdı kullanarak membranlar kurutun.
  3. Immunreaktif bantları görselleştirmek için bir ışık saçan görüntü analizörü membranlar yerleştirin.
    1. Alternatif olarak, duyarlı X-Ray filmler kullanılarak immunorekatif bantlar algılaması gerçekleştirmek.
  4. PBS içinde 5 dakika 3x membranlar yıkayın.
    NOT: Bu aşamada membranlar kuru tutulabilir. Daha sıyırma gereklidir, ancak, bu membran kurumadan sıyırma gerçekleştirmek için daha iyidir. Zarlar da PBS kısa dönem için saklanabilir.
  5. Antikorlar ile inkübasyondan arasındaki sıyırma gerektirmeyen zarlar için doğrudan adım devam (Şekil 1 e bakınız)5,20.
  6. Sıyırma antikorlar, 50 ° C 'de GKD 2 O% 2 SDS, 62,5 mM Tris-HCI, pH 6.8 (RT) ve% 0.7 β-merkaptoetanol ihtiva eden önceden ısıtılmış sıyırma çözelti içinde inkübe membranlar (Şekil 1 e bakınız) arasındaki gerekli olduğunda Normal ajitasyon altında 20 dakika karıştırıldı. PBS içinde 5 dakika 3x membranlar yıkayın.
    NOT: sıyırma işlemi sırasında ajitasyon anahtarıdır. Sıyırma, bir hibridizasyon etüvü içinde gerçekleştirilebilir. Seçenek olarak ise, bir su banyosu içinde, plastik torbalara ve batırma membranlar kullanılarak gerçekleştirilebilir sökülmesi. Inkübasyon sırasında 5 kez - Bu durumda, bu membranlar 4 çalkalanması için önemlidir.
  7. PBS-T-süt 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N C'da 1 saat için membranlar inkübe edin.
  8. Yineleyin Şekil 1'e göre 5.16 ile 5.12 arasındaki adımları yineleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2, yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ile BOA'da giderilmesinden sonra, Ser396 ve Ser398 karşı IRF3 toplam antikorlar ve IRF3-fosfospesifık antikorlar ile IRF3 tipik bir immunoblot görüntüsünü göstermektedir. Uyarılmamış A549 hücrelerinde, IRF3 50 ° C'de iki grup ve olmayan fosforile (form I) 'e uygun SDS-PAGE üzerinde 53 kDa ve hipofosforile (Biçim II) IRF3 türleri olarak tespit edilir. Zamana bağımlı vardiyada 9 saat sonuçlar yavaş yavaş I biçimlerinden de ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada tarif protokolü IRF3 dimerik / monomerik ve phosphoforms I-IV ayırt birçok fosfospesifık antikorların kullanımı bağlanmış yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ve nativ-PAGE bir kombinasyonundan oluşur. Bu IRF3 türlerin uygun algılama tam belirli bir ortamda IRF3 aktivasyonunu tanımlamak için gereklidir. Örneğin, aktive makrofajlar LPS uyarımı, hipofosforile edilmiş (Biçim II) sahip dimerik, Ser396 / 398 fosforile IRF3 oluşmasına yol açar, ancak SDS-PAGE 15 (Form III ve IV), desen hiperfosforile değildir. Tarif...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, protokollerin geliştirilmesi için laboratuvarın önceki ve mevcut üyelerine teşekkür eder. Çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) [hibe # MOP-130527] ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden [NSERC-355306-2012] sağlanan fonlarla desteklenmiştir. NG, Tier II Kanada Araştırma Kürsüsü sahibidir. AR, Fonds de la recherche du Québec-Santé'den (FRQS) Solunum Sağlığı Araştırma Ağı'nın eğitim programından bir öğrenciye sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
F12/Ham LifeTechnologies11765-05437 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C banyosu yapın.
Fetal sığır serumuYaşam Teknolojileri12483-020
L-glutaminYaşam Teknolojileri25030-081
D-PBSYaşam Teknolojileri14190-144Hücre kültürü için.
Tripsin / EDTA 0.25%Yaşam Teknolojileri25200-072
Sendai virüsü Cantell SuşuCharles Nehri Laboratuvarları600503
Hepes BioshopHEP001
Sodyum klorür (NaCl)BioshopSOD001.5
EDTABioshopEDT001
Gliserol BioshopGLY001.1Ucun uç kısmını kesin ve çok kalın olduğu için yavaşça pipetleyin.
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI7771Oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol (Nonidet P-40) deterjan
LeupeptinBioshopLEU001
Aprotinin BioshopAPR600.25 ve nbsp;
Sodyum florürSigma-Aldrich201154
Sodyum ortovanadatMP Biyomedikal159664Sodyum ortovanadat 0.2 M'nin aktivasyonu: 1) 1 N NaOH veya 1 N HCl kullanarak pH'ı 10.0'a ayarlayın. Sodyum ortatovandat çözeltisinin başlangıç pH'ı çok sayıda kimyasala göre değişebilir. 2) Çözelti pH 10.0'da sarıdır. 3) Renksiz olana kadar kaynatın. 4) RT'ye kadar soğutun. 5) pH'ı 10.0'a geri getirin ve çözelti renksiz kalana ve 10.0'da stabilize olana kadar 3-4 adımlarını tekrarlayın. Aktif sodyum ortovanadat alikotlarını -20 ° C'de saklayın.
p-nitrofenil fosfat disodyum tuzu hekzahidratSigma-AldrichP1585
Beta-GliserofosfatSigma-AldrichG6376 
Bio-Rad Protein Test Reaktifi Bio-Rad500-0006 Sitotoksik
Akrilamid / Bis-Akrilamid (37.5: 1) %40BioshopACR005 Sitotoksik
Tris-BaseBioshopDEO701
Hidroklorik asit (HCl)LabChemLC15320-4 Çeker ocak altında çalışın. Toksik ve tahriş edici.
Sodyum dodesil sülfat (SDS)BioshopSDS001.1 ırritan.
Amonyum persülfatSigma-AldrichA3678
TEMEDInvitrogen15524-010Toksik ve tahriş edici.
Bromofenol mavisiFisher ScientificB392-5
Beta-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250Çeker ocak altında çalışın. Sinir sistemi, mukoza zarları için toksiktir. Üst solunum yolları, gözler, merkezi sinir sistemi için toksik olabilir.
GlisinBioshopGLN001.5
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750
Sodyum hidroksit (NaOH)BioshopSHY700  ırritan.
Nitroselüloz membran (0,45 mm)Bio-Rad162-0115
Asetik asit buzulBioshopACE222.4Çeker ocak altında çalışın. Toksik, tahriş edici ve yanıcı.
Kırmızı ponceauSigma-AldrichP3504   
Potasyum klorür (KCl)Sigma-AldrichP3911 ve nbsp;İmmünoblot için PBS bileşimi için.
Na2< / sub>HPO4< / sub>BioshopSPD307.5İmmünoblot için PBS bileşimi için.
KH2PO4Sigma-AldrichP0662 İmmünoblot için PBS bileşimi için.
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA7906İmmünoblot için PBS-T-BSA bileşimi için.
Yağsız kuru sütKaranfil
Poli sorbat 20 (Tween)MP Biyomedikal103168Çok kalın olduğu için ucun ve pipetin uç kısmını yavaşça kesin.
Anti-IRF-3-P-Ser386IBL-Amerika18783-20 oC'de alıntılanan mağaza Donma/çözülmeyi önleyin.
Anti-IRF-3-P-Ser396Ev yapımı19-80 oC'de aliquoted Donma/çözülmeyi önleyin.
Fosfo-IRF-3 (Ser396) (4D4G)Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4947s-20 oC'de saklayın.
Anti-IRF-3-P-Ser398Ev yapımı15Store aliquoted -80 oC'de donma/çözülmeyi önleyin.
Anti-IRF-3-tam uzunluktaActif motifi39033-80 oC'de aliquoted olarak saklayın. Donma/çözülmeyi önleyin.
Anti-IRF3-NESIBL-America18781Mağaza -20 oC'de alıntılanmıştır.
Western Lightning Kemilüminesans Reaktifi PlusPerkin-Elmer Yaşam BilimleriNEL104001EA
LAS4000mini CCD kamera cihazıGE healthcare
SDS-PAGE Moleküler Ağırlık Standartları, Geniş Ürün YelpazesiBio-Rad161-0317-20 oC'de aliquoted Mağaza.

Kaynaklar

  1. Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
  2. Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
  3. Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
  4. Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
  5. Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
  6. Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
  7. Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
  8. Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
  9. Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
  10. Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
  11. Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
  12. Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
  13. Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
  14. Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
  15. Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
  16. Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).
  17. Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
  18. Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
  19. Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
  20. Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
  21. Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
  22. Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
  23. McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
  24. Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).
  25. Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
  28. tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
  29. Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
  30. Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

IRF3 AktivasyonuFosforilasyon AnaliziSDS PAGENative PAGEmmunoblotSendai Vir sT m H cre EkstresiFosfospesifik AntikorlarDenat re Edilmemi ElektroforezY ksek z n rl kl Jel
Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.