Yöntem makalesi

Uyanık Davranan Macaque Maymun Korteks Bilgi İşlem Neuropharmacology araştırılması için Bir Basınç Enjeksiyon Sistemi

8.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53724

⸱

14 Mart 2016

 ,  , 
1Cognitive Neuroscience Laboratory, German Primate Center, 2Faculty of Biology and Psychology, Goettingen University

Bu makalede

Özet

Burada, uyanık, uslu duran bir makak maymununda tek hücreli kayıt sırasında nörofarmakolojik maddelerin basınç enjeksiyonunu gösteriyoruz. Bu prosedür, kortikal bir kayıt bölgesinin hemen yakınında farmakolojik manipülasyona izin verir.

Özet

İleri beslemeli kortikal bilgi işlemenin yukarıdan aşağıya modülasyonu, dikkat ile duyusal bilgi işlemenin modülasyonu da dahil olmak üzere birçok bilişsel süreç için işlevsel olarak önemlidir. Bununla birlikte, bu tür modülasyonlarda hangi nörotransmitter sistemlerinin yer aldığı hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu soruyu ele almanın pratik bir yolu, tek hücreli kaydı uygun bir hayvan modelinde lokal ve geçici nörofarmakolojik manipülasyonla birleştirmektir. Burada, akut tek hücreli kayıtları, kayıt elektrodunun doğrudan yakınında nörofarmakolojik ajanların enjeksiyonu ile birleştiren bir teknik gösteriyoruz. Video, enjekte edilecek maddenin hazırlanması da dahil olmak üzere basınçlı enjeksiyon/kayıt sisteminin hazırlanmasını gösterir. Görsel bir dikkat görevi gerçekleştiren bir rhesus maymunu ve blok bazında farmakolojik manipülasyonlarla tek birimli kayıt prosedürünü gösteriyoruz.

Giriş

Kortikal ve subkortikal alanlarda, nöronal aktivite çeşitli nöromodülatörlerden, örneğin asetilkolin1'den etkilenir. Nöronal tepkiler üzerindeki bu modülatör etkiler, in vitro çalışmalarda2, ayrıca anestezi uygulanmış hayvanlardan 3 ve insanlardasistemik farmakolojik manipülasyonlardan4 elde edilen elektrofizyolojik kayıtlarda bildirilmiştir. Bununla birlikte, farklı nöromodülatörlerin kesin rolü ve çeşitli reseptör alt tiplerinin katılımı büyük ölçüde bilinmemektedir. Spesifik nöromodülatörlerin tek nöronların aktivitesi üzerindeki etkilerini ölçmek için, kayıt elektroduna mümkün olduğunca yakın geçici bir nöromodülatör değişikliğinin indüklenmesi arzu edilir. Ayrıca, bu manipülasyonların uyanık hayvanlarda yapılması önemlidir, çünkü bilişsel işlevler yalnızca anestezi yokluğunda mevcuttur. Ek olarak, anestezi kolinerjik ve GABAerjik sistemlerle etkileşime girer5,6 ve nöral aktivitededeğişikliklere yol açabilir 3.

Son on yılda, iki ana lokal ilaç verme yöntemi geliştirilmiş ve rafine edilmiştir: iyontoforez ve basınçlı enjeksiyon. Her iki yöntemde de ilaçlar cam veya çelikten yapılmış mikropipetler aracılığıyla verilir. İyontoforez ile, bir elektrik akımı ilacın7 salınımını düzenler. Ek olarak, elektro-ozmozun, mikropipetin uç çapı8 ve kullanılan maddenin konsantrasyonu8 ile ilişkili olarak, çıkarılan moleküllerintoplam miktarına 8 önemli bir katkısı vardır. İyontoforez, küçük hacimli sinir dokusunu hızlı ve hassas bir şekilde manipüle etmek için güçlü bir araçtır. İyontoforetik enjeksiyonlar için, çok namlulu mikropipetler genelliklekullanılır 10, biri kayıt cihazı olarak işlev görürken, diğer konumlar dağıtım pipetleri olarak işlev görür. Bu yöntemin bir sınırlaması, yalnızca yüklü moleküllerin kullanılabilmesidir, bu da ilaç seçimini ciddi şekilde sınırlar.

Basınçlı enjeksiyon, bir maddeyi mikropipetten çıkarmak için hava sıkıştırması veya mekanik basınç kullanır. Bu yöntemi kullanarak, büyük moleküller de dahil olmak üzere, yüklü veya yüksüz herhangi bir çözünür madde kullanılabilir. Basınçlı enjeksiyon yöntemi ilk olarak 1933'te Reyniers tarafından tanımlanmış ve 1950'lerde daha da rafine edilmiştir (bir inceleme için Lalley11'e bakınız). 1980'lerde, yöntem, nanolitre aralığındaki miktarların (esas olarak lidokain12) tanımlanmış bir beyin alanına13 verilmesine izin verirken, aynı anda tek hücreli kayıt gerçekleştirirken daha da rafine edildi. Çıkarılan hacim genellikle pipetin13 üst kısmındaki menisküs gibi bir işaretleyicinin hareketi gözlemlenerek izlendi. Basınçlı enjeksiyon ilk olarak 1990'larda uyanık hayvanlarda, hem hücre dışı14 hem de hücre içi15,16 kullanılmıştır. Bu çalışmalarda kazanılan kümülatif uzmanlığa dayanarak, farmakolojik manipülasyon ile birlikte farklı beyin yapılarından güvenilir bir şekilde kayıt yapmak artık mümkündür (son basınçlı enjeksiyon sistemlerinin karşılaştırması için bkz.17).

Her iki ilaç dağıtım yöntemi için de kalıcı bir açık sorun, enjekte edilen kesin hacmin belirlenmesindeki zorluktur. Bu, hayvanın deney görevini ayrı bir odada gerçekleştirdiği uyanık, davranan rhesus maymunları ile yapılan deneyler için daha da büyük bir zorluktur. Bu, bir enjeksiyonu sürekli olarak izlemek için görsel bir işaretleyiciye güvenmek yerine yazılım kontrollü bir sistemin kullanılmasıyla hafifletilebilir.

Burada açıklanan sistem, iyi kurulmuş bir elektrofizyolojik kayıt sisteminin (Mini Matris Sistemi) bir uzantısıdır ve bir enjeksiyon pipetini özelleştirilebilir bir düzenlemede tanımlanmış mesafelerde birden fazla paralel yönelimli kayıt elektrotuyla birleştirir. Kayıt elektrodunun yakınındaki dokunun farmakolojik manipülasyonu, sadece az miktarda madde kullanılarak mümkündür, bu da hızlı bir iyileşme sağlar ve hayvanın davranışsal görevinin sunduğu sınırlı zaman penceresi içinde birden fazla enjeksiyon bloğuna ve kontrol/kurtarmaya izin verir.

Protokol

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürleri Alman yasaları düzenleyen hayvan bakımı çerçevesinde yapılan ve Braunschweig, Aşağı Saksonya, Almanya ilçe hükümet tarafından kabul edildi.

Not: Deney, in vivo olarak gerçekleştirilir olarak, mümkün olan en yüksek hijyen standartlarına korumak için son derece önemlidir. Mümkün olduğunda, steril koşullar altında çalışma.

1. Enjeksiyon / Kayıt Sistemi Hazırlama

  1. şırınga ile mikropipet bağlayan tüp sterilize edin. enjeksiyon pompası ve elektrofizyolojik kayıt sistemi arasındaki deneysel set-up tüp mümkün olan en kısa uzunluğu kullanın.
  2. temizlik telleri kullanarak kayıt sisteminin kılavuz tüpleri temizleyin. birkaç kez steril silikon yağı bunları batırın ve bireysel rehber tüpler aracılığıyla onları beslemek.
  3. kayıt sisteminin bir kılavuz tüp içine kuvars cam mikropipet yerleştirin. Şekil 1A bakınız.
  4. Mikropipet düzeltmeden sonrakayıt sistemi, mikropipet metal pimin steril tüp takmak. Kendine iyi bak; Mikropipet sisteminde sabit olmasına rağmen tüp takarken kolayca kırılabilir. pim ve tüp eşit basınç uygulamak için iki steril bir cımbız kullanın.
  5. tüp ve mikropipet arasındaki kavşak mühür sıvı süper yapıştırıcı kullanın. tutkal sıvıyla mikropipet doldurmadan önce sertleşmesine için en az 3 saat bekleyin.
  6. Önce veya mikropipet yerleştirildikten sonra kayıt sisteminin diğer pozisyonlara Mikroelektronlar (örneğin, kuvars cam yalıtımlı platin tungsten) yerleştirin.

2. Madde hazırlanması

  1. bir otoklav veya başka güvenilir bir prosedür kullanılarak enjeksiyon solüsyonları, daha sonra depolama için 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri sterilize edin.
  2. 0.1 mol çözeltisi 5 ml hazırlamak için, ilgili maddenin skopolamin hidroklorür tartılır. steril tuzlu su (% 0.9 NaCI) içinde çözün.
  3. Steril koşullar altında ina yeterince büyük gözenek çapına sahip bir şırınga filtresi kullanılarak çözelti, örneğin, 0.2 um'lik bir filtreden, çeker ocak.
  4. Davlumbaz altında, skopolamin için, örneğin tek bir deney için yeterli hacimleri, içine çözüm bölmeyin steril 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 500 ul. ışıktan maddeyi korumak için karanlık tüpleri kullanın; Seçenek olarak ise, alüminyum folyo ile tüpler sarın. skopolamin için, 4 ° C'de 14 güne kadar çözüm saklayın.

Enjeksiyon / Kayıt Sistemi 3. Günlük hazırlanması

Not: kayıt sistemine monte edildiği zaman, elektrotlar ve mikropipet kayıtlar arasında bir enzim çözeltisi (Tergazyme deiyonize su ile% 1 çözelti) depolanır. Aşağıdaki adımlar, her kayıttan önce yapılmalıdır.

  1. maddenin bir tüp toplamak enjekte edilecek. buzdolabında eğer RT ulaşmanızı sağlar.
  2. enzim çözeltisine enjeksiyon / kayıt sistemini kaldırmak ve elektrotları durulamave deiyonize su ile mikropipet enzim solüsyonu tamamen temizlenir.
  3. görsel mikropipet ve tüp arasındaki mühür kontrol etmek için kayıt sisteminin ön kapağını çıkarın.
  4. Pürüzsüz hareket için sistemin yağlamak için kılavuz tüp boşluğu (Şekil 1A) ve elektrotlar ve mikropipet uçları steril silikon yağı sürün.
  5. Onlar sağlam olduğundan emin olmak için bir mikroskop kullanılarak elektrotların ve mikropipet ipuçları kontrol edin. aynı uzunlukta kılavuz tüpleri dışarı uzatmak, böylece mikroskop altında elektrotları ve mikropipet hizalayın. en kısa sürede artık görünür olarak durdurma, rehber tüpleri içine sürün. Bu elektrot pozisyon sıfır olarak tanımlanır. yazılımda 0 elektrotların derinlik ve mikropipet ayarlayın.
  6. Steril tuzlu su ile steril bir şırınga doldurun ve tüpün duvarı delmek için özen tüpe iğneyi. visu için kılavuz tüpün dışarı mikropipet SürücüMadde akışı al kontrolü.
  7. Resim hava sağlamak için boru ve mikropipet ile yıkayın, en azından 2 ml steril tuzlu su şırınga içinde veya borunun içinde kalır. şırınga pistonu çok fazla baskı uygulamayın. tüp ve mikropipet arasındaki kavşak emin olun kapatılır. kaçak görünür ise, kavşak (adım 1.5 bakınız) yeniden tutkal ve kayıt erteleme.
  8. Çözeltisi ile yeni bir steril bir şırınga enjekte edilecek doldurun ve tuzlu su şırınga haznesi ile takas örneğin, bir tüp içinde salin doldurulmuş şırınganın iğne tutun. hava sistemine aktarılır emin olun. Bu en iyi tuz doldurulmuş varili çıkarıldıktan sonra tuzlu su ile iğne göbek dolgu ile elde edilir.
  9. çözeltisi 250 ul tam tüpten tuzlu su çıkarmak için, enjekte edilecek olan sistem yıkayın.
  10. motor kontrol yazılımı kullanarak, guidetubesto içine en az -500 mikron derinliğe elektrotlar ve mikropipet geri.
  11. kendi sabit göreli konumunu korumak için kılavuz tüpleri altına kılavuz tüp halkasını (Şekil 1A) indirin.
  12. o maymunun kayıt odasına dokunacak özellikle etanol ile sistemin temelini, temizleyin.
  13. Ön kapağı yerine ve vidaları sıkarak kayıt sistemini kapatın.

Enjeksiyon Sistemi 4. Doğrulama

Not: şirket sistemini kalibre rağmen, (tüpler, şırıngalar, vb) deneysel set-up kullanılan malzemeler ile atılır hacimleri doğrulamak için tavsiye edilir.

  1. kılavuz borular üzerinden uzatılmış elektrotları ve mikropipet tutarak, Aşama 3'te tarif edildiği gibi bir sistem hazırlayın. 7000, en az um'lik bir derinliği nedeni mikropipet ve elektrotların dış yüzeyi boyunca yapışması ölçüm hacmi kaybını önlemek için önerilir.
  2. Bu deney sırasında kullanılacak pozisyonda kayıt sistemini yerleştirin ve enjektörler koyunmikroenjeksiyon pompası içine ge. Lastik bant ve ayarlanabilir tutuş kullanılarak yerine şırınga Fix (Şekil 1A bakınız). o şırınga pistonu arkasında sıkıca kadar pompa hareketli bölümünü kaydırın.
  3. Yazılım kontrollü motor ünitesini kullanarak, tam olarak ölçülmesi için yeterince büyük bir hacme çıkarmak gibi., 1000 nl. Mikropipet yüzeyi boyunca kapiller aksiyon etkisini önlemek amacıyla toplam hacmi çıkarmak için tek bir adım kullanılması tercih edilir. Çok düşük hızlar (1 NL / s) de doğrulama işlemi sırasında bu etkiye neden olabilir.
  4. Mikropipet altına yerleştirilen bir kapta toplam hacmi toplayın, ya da dikkatlice mikropipet ucu doğrudan püskürtülen damla toplar. Bir pipet kullanarak püskürtülen hacmini tahmin ya da hassas ölçek ile tartarak.
  5. prosedürünü ölçümleri onaylamak için birkaç kez tekrarlayın.

5. Akut Kayıtlar

  1. xy konumunu ayarlamakkayıt sisteminin. Bu kılavuz tüpleri kronik implante kayıt odasına içinde duramateri ulaşmak noktayı tanımlar. kılavuz tüpleri tamamen (kılavuz tüp z konumunu 0) geri emin olun.
  2. konumuna kayıt sistemini getirmek ve mikroenjeksiyon pompa şırınga. Lastik bant ve ayarlanabilir tutuş kullanılarak yerine şırınga Fix (Şekil 1A bakınız). o şırınga pistonu arkasında sıkıca kadar pompa hareketli bölümünü kaydırın. maddenin bir damla kılavuz tüpleri ucunda görünür ise, dikkatlice steril pamuk kullanarak çıkartın.
  3. Laboratuvarın prosedürüne göre (örneğin kılavuzlar için 18 bakınız) kayıt için hayvan hazırlayın.
  4. Güvenli maymun kayıt odasının kayıt sistemi monte edin.
  5. Yavaş yavaş elle dura ulaşılana kadar kayıt odasına kılavuz tüpleri düşürmek, daha sonra motorun co kullanarak elektrotları sürücüntrol yazılımı.
  6. o, mikropipet empedansını ölçmek mümkün değildir ilk elektrotlar ile sürücü ve farklı derinliklerde düzenli olarak empedanslarından kontrol edin. dura bir penetrasyon başarıyla elektrotlar zarar vermeden gerçekleştirildikten sonra, mikropipet ilerlemek.
  7. elektrotları ve ilgi beyin alanı bulunan beklenen hangi hedef elektrot derinliği mikropipet sürün. Kaydedilen sinyalde iyi bir sinyal-gürültü oranı ile kanıtlandığı gibi, tek bir birim aktivitesini kaydetmek için yeterince yakın olana kadar yavaş yavaş elektrodu ilerlemek. Önemlisi, elektrot ve mikropipet arasındaki minimum mesafeyi sağlamak için aynı derinlikte kayıt elektrodu ve mikropipet yerleştirin.
    1. Mümkünse, tüm kayıt için bu derinlikte elektrotlar ve mikropipet tutun. Kaydedilen hücrenin sinyal kalitesini korumak için tek yol elektrotlar hareket Ancak, eğer, o zaman elektrotları ve mikropipet sürücüAynı anda aralarındaki mesafeyi korumak için.

6. Mekansal Dikkat Görev

  1. Ekranda bir deneme dizi, mevcut iki hareketli nokta desenleri, bir araya hayvan her deneme 19 boyunca foveate zorundadır merkezi sunulan tespit noktası ile, kaydedilen nöronun ve bunun diğer dışına açık alanda konumlandırılmış, 20.
    Not: maymun cued nokta desen bir yön değişikliğine yanıt vermek için eğitilmiştir (hedef olay) başka nokta desen herhangi bir yön değişikliği yok sayarak, ve bir deneme 19 her başarılı tamamlanması için sıvı bir damla ile ödüllendirilir ise, 20. Duyusal kontrol koşulu olarak, maymun hem hareketli nokta desenleri (görevin daha ayrıntılı bilgi için bakınız Şekil 2) göz ardı ederken tespit noktasının bir parlaklık değişimini bildirmek zorundadır.

7. Farmakolojik Manipülasyon Kayıt yaparken

Not: maymun görevi gerçekleştirirken, bir blok odaklı bir şekilde maddeyi enjekte. Üç ardışık bloklar tanımlanır: bir temel olarak hareket kontrolü; Bir madde atılır sırasında enjeksiyon; ve kurtarma, sırasında hücreler bazal enjeksiyon dönüşü tarafından hedeflenen.

  1. Bir enjeksiyon bloğu boyunca, düzenli aralıklarla kimyasal maddenin önceden belirlenmiş bir miktarda enjekte örn., 2 NL 2 nl / s 'lik bir oranda her dakika. Bu örnek için, skopolamin hidroklorür kullanımı. Enjeksiyon işlemi çeşitli seçenekler sunar yazılımı kullanılarak kontrol edilir. Örneğin, enjeksiyon hacmi tanımlamak ve kayıt yazılımı saatine göre enjeksiyon düğmesine her dakika basın adım işlevini kullanın.
    Enjeksiyon bloğunun tam süresi bir maddedir ve bağımlı deney örneğin skopolamin kullanımı için 2 nl enjeksiyonları her dakika 10 dakika (toplam 20 nl) için Not:.. Elektrotlar ve mikropipet Duri ilerletmek için tercih edilirEnjeksiyon blok ng.
  2. zaman ve madde enjekte edildiği boyunca deneme, elektrotlar ve mikropipet derinliği gibi püskürtülen madde miktarının dikkat edin.
  3. Resim maddenin enjekte edildiği bir geri kazanım bloğu, enjeksiyon blok izleyin. Kurtarma bloğu süresi maddeye özeldir ve ön testler tarif edilmesi gerekmektedir. Monitör ve kurtarma bloğunun sonuna kadar seçilmiş tek birimlerin kayıt kalitesini korumak.
  4. sürece maymun kayıt kalitesi ve motivasyon sağlayacak şekilde üç blok tekrarlayın.

8. Mesaj Kayıt İşlemleri

  1. veri Kayıttan sonra, kılavuz tüpleri içine elektrotlar ve mikropipet geri çekin ve daha sonra elle kılavuz tüpleri geri çekin. maymun kayıt odasından kayıt sistemini kaldırın. Enjeksiyon pompası şırınga bırakın ve temizlik için hazırlık alanına sistemi aktarın.
  2. hayvan Kolu(kayıt odasının 18 temizlenmesi dahil) Laboratuvarın standart prosedürlere göre ve konut tesisine iade edin.
  3. iyonu giderilmiş su ile, sonra hidrojen peroksit (% 3) ile kılavuz tüp dışında yıkayın. kılavuz tüpleri dışarı sürücü elektrotları ve mikropipet, hidrojen peroksit ve daha sonra deiyonize su ile durulayın.
  4. tüp içinde iğne tutma steril tuzlu su ile dolu bir şırınga, bir tüp haznesi ile şırınganın değiştirin. tüp ve tuzlu 1-2 ml mikropipet yıkayın. Yıkama işleminden sonra, namluyu kaldırmak ve hava ile doldurun. iğne içine namluyu yeniden takın ve tüp hafifçe hava yoluyla iterek içeriden mikropipet kurutun.
  5. kurumasını önlemek için hem de organik maddelerin parçalanmasını sağlamak için enzim solüsyonu daldırılmış kılavuz tüpleri, genişletilmiş elektrodları ve mikropipet saklayın.

Sonuçlar

Şekil 2 enjeksiyon işlemi yapılmıştır ise maymun gerçekleştirilen uzaysal dikkat görev göstermektedir. maymun, (katılmak-in) kayıtlı nöronun alıcı alanında bulunan ya uyarana açık alanın dışında bulunan uyarıcı katılmak üzere eğitildi veya sabitleme noktası (-out katılmak) (devam-fix). Bu koşullar, farklı dikkat devletlerde nöronal aktivitenin bir karşılaştırma sağlar.

Şekil 3 skopolamin, bir muskarinik kolinerjik antagonist kullanarak bir deneyde bir örnek nöron bir peri-uyaran zaman histogramı gösterir. arsa hücrenin tercih yönde hareket eden bir model nöronun alıcı alanı içinde sunulur ve hayvan katıldığı hiçbir enjeksiyon, karşı skopolamin enjeksiyon sırasında yanıt baskılanmasını gösterir. İlk iki zirveleri nöron temsil9; ın zamanda online tepki ve açık alan içinde görünen mekansal işaret, ofset. Bu 500 ms işaret başladıktan sonra ekranda görünür hareketli modeline yanıt izlemektedir. gri gölgeli alan her deneme için ortalama atış oranını hesaplamak için kullanılan analiz süresini göstermektedir. yeşil alan hücrenin ateşleme hızına skopolamin enjeksiyonu baskılayıcı etkisini vurgulamaktadır. Koyu yeşil bölge analiz dönemi içinde bastırma gösterir.

Şekil 4A, üç dikkat koşullarının her örnek nöron ortalama ateşleme hızına skopolamin etkisini göstermektedir. nöronun ateşleme iki uzaysal dikkat koşulları oranı (kayıt nöronun alıcı alanının içinde veya dışında dikkat) yanı sıra (sabitleme noktasında dikkat) duyusal durum enjeksiyon bloğunun ilk enjeksiyon (gri gölgeli kısa bir süre sonra düştü vardıra) ve enjeksiyon öncesi aynı seviyede bir gecikmeden sonra artan kurtarma blok sırasında.

Şekil 4B, tuzlu su (% 0.9 NaCI) skopolamin, enjeksiyon için aynı protokol kullanılarak, enjekte edilmiş bir ikinci örnek nöron kayıt bir denetim gösterir. Enjeksiyon sırasında nöronun ateşleme oranında bir değişiklik kontrol bloğuna göre gözlendi engeller.

figure-results-1
Kayıt sırasında farmakolojik manipülasyon için kullanılan Şekil 1. Set-up. (A) mikroenjeksiyon pompası ve elektrotlar ve mikropipet ile donatılmış elektrofizyolojik kayıt sistemi yansıtır. silikon yağı elektrodları ve mikropipet yağlamak için sokulduğu guidetube boşluğu, büyütülmüş gösterilmiştir. (B) (yukarıda) bir örnek mikropipet görüntülerve kayıt elektrot (aşağıda). Boyut karşılaştırma için, bir euro cent (çap: 16 mm). Altına yerleştirilen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Görev tasarımı mekansal dikkat rehberlik. Maymunlar cued nokta desen bir hareket yönü değişikliği algılamak için eğitilmiştir. işaret ya da nöronun alıcı alanında yerleştirildi şekilde gösterildiği gibi, (-katılmak), ya da bunun dışında (katılmak-out). Bir duyusal kontrol olarak maymun tespit noktasının bir parlaklık değişimini algılamak için eğitilmiş (katılmak-fix). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

< img alt = "Şekil 3" src = "/ files / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" />
Ateşleme hızı üzerinde antagonist skopolamin Şekil 3. Etkisi. Bir örnek nöron için peri-uyaran süresi histogram enjeksiyon bloğu sırasında ve denetim bloğu sırasında attend-in durumuna (kaydedilen nöronun alıcı alanı içinde dikkat) için gösterilir. x ekseni sivri ateşleme hızı / sn gösteren işaret başlangıcı ve y-ekseni sonra milisaniye zaman göstermektedir. gri alan deneme ortalama ateş oranını hesaplamak için kullanılan analiz dönemi (uyaranın başlangıcından sonra 300-800 ms) göstermektedir. yeşil gölgeli alan iki koşula karşısında ateşleme hızı olarak bastırılmasına gösterir. Koyu yeşil renk analiz dönemi içinde bastırma vurgulamaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/>
Ateşleme hızı üzerinde skopolamin ve tuz Şekil 4. Etkisi. (A) rakip skopolamin enjeksiyonu. Deney boyunca Şekil 3 örnek hücrenin deneme ortalama ateş oranı her üç dikkat koşullar için tercih edilen uyarıcı gösterilir. x ekseni dakika deneme başlangıç ​​zamanını göstermektedir ve y-ekseni saniyede sivri birimin ateşleme oranını gösterir. semboller ( figure-results-3 katılmak-in, figure-results-4 -Katılmak düzeltmek, figure-results-5 ) Dışarı katılmak her başarıyla gerçekleştirilen denemede analiz dönemi içinde nöronun ateşleme hızı temsil ve yatay çizgiler (katı çizgi: katılmak-in, noktalı çizgi: katılmak-fix, kesikli çizgi: katılmak çıkış) için ortalama ateşleme hızı göstermek üç farklı deneysel BLocks (kontrol, enjeksiyon, kazanım). gri gölgeli alan ilk enjeksiyondan ile başlayan ve son enjeksiyondan sonra 1 dakika biten enjeksiyon bloğu gösterir. Enjeksiyon sırasında blok 2 nL 0.1 molar skopolamin 2 nl / sn bir enjeksiyon hızı ile her dakika enjekte edildi. (B) Salin enjeksiyonu. Kontrol deney boyunca bir numune hücresinin ateşleme hızı her üç dikkat koşulları için tercih edilen bir uyarıcı için gösterilmiştir. Gri gölgeli alan tuzlu enjeksiyon bloğu görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Burada bir "off-the-raf" basınçlı enjeksiyon sistemi ile güvenilir ve hassas enjeksiyon ve yüksek kaliteli tek hücreli kayıtları nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak tarif var. Ilaç verme yöntemi, daha önce (17 gözden) maymunlar davranıyor kullanılmış olsa da, burada sunulan sistem aşağıda gözden avantajları vardır.

Şekil 4A'da gösterildiği gibi, burada tarif edilen sistem ile ve kayda hemen yanında farmakolojik enjeksiyonlar olmadan tek bir nöron aktivitesi sabit ölçüm sağlar. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, bir kontrol maddesi, tuzlu su enjeksiyonu, ateşleme hızı bir değişikliğe yol açmadı. Bu kontrol, enjeksiyon işleminin kendisi kayıt nöronların ateşleme özellikleri üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

nöron, kayıt elektrot ve mikropipet mekansal yapılandırma önemli biridir Bu deneylerde önemi. Kayıt sırasında dokuda göreceli konumlarının kesin bir ölçü mümkün olmasa da, biz düşünün ve varyans olası kaynakları kontrol edebilirsiniz. İlk olarak, hacim, enjeksiyon sırasında ilgi nöron kaydedilen sinyallerin dengesini etkilemeden, kayıt elektrot uzak değiştirilebilmeleri riski vardır. Bu nedenle daha önce ve sinyal kararlılığını doğrulamak için enjeksiyon bloğundan sonra atış hızına karşılaştırmak için isabetli olmuştur. İkinci olarak, kayıt sisteminin kılavuz borusu konfigürasyonu elektrotları ve mikropipet arasındaki mesafeyi tanımlar (örn., Bu deneyde kullanılan eş-3-kanallı sistemde 305 um). Sistem dokusunda elektrotlar ve mikropipet derinliği hassas pozisyon kontrolü sağlar gibi, aralarındaki mesafe dikkatlice (adım 3.5) Kayıttan önce nispi derinlik kalibre ve kayıtları sırasında ortak bir derinlikte tutarak minimize edilebilir.

ent "> Potansiyel sınırlamalar
üretici tarafından in-house kalite kontrolüne ek olarak, sistem tüplerin farklı marka olarak, laboratuvar koşullarında valide gerekiyor, vb şırıngalar kullanılabilir ve atılır hacimlerde farklılıklara yol açabilir. Sistem burada gösterilen deneyde olduğu gibi, çok küçük hacimlerde enjekte etmek için kullanılabilir olsa da, bu, normal bir laboratuvar ortamında uygulama ölüm sınırlarına bağlı olarak doğrulanabilir, minimum hacimde altında bulunmaktadır. Bununla birlikte, daha büyük bir enjeksiyon hacimleri yazılımla tanımlanmış miktar ve donanım tarafından püskürtülen hacmi arasındaki ilişkiyi belirlemek için de kullanılabilir. Şeffaf borular kullanıldığında, enjeksiyon işleminin ek bir görsel kontrol görsel işaretin yer değiştirme ölçümü mümkündür.

Mikropipet çapı biraz daha büyüktür ve malzeme daha kırılgan olduğu gibi sisteme mikropipet yerleştirilmesi, elektrot yerleştirilmesi daha talep ediyor. Ek olarak,o mikropipet üst kısmını kırılma riski yüksek gerektirir olarak mikropipet pin tüp katılmadan zordur. Ancak, başarılı bir şekilde yüklendi mikropipet ömrü bile günlük kullanım ile, birkaç aydır.

Uygulamada, henüz sistemin post-kayıt temizliği sırasında enjeksiyon sisteminde bir tıkanıklık karşılaşmadım. Bununla birlikte, hiçbir "çevrimiçi" onay mümkündür ve (örneğin, mikropipet ucunda doku gibi) fiziksel tıkanma madde enjeksiyonu engelleyebilecek bir riski vardır. Nedenle bu tür bir deney kontrolü ve enjeksiyon blokları arasında fiyat ateş önemli değişiklikler gösteren daha fazla analiz yalnızca bu hücreler de dahil olmak üzere gibi konservatif verileri analiz etmek için tavsiye edilebilir.

kendi küçük çaplı olmasına rağmen, Mikroelektronlar ve pipetler beyin dokusu yerinden edecek ve bazı lokal doku hasarına neden olabilir. Bu el th ucu konumlandırmak minimize edilebilirsadece dura mater üzerinde e kılavuz tüpleri. elektrotlar daha sonra dura nüfuz ve intakt çevrimiçi olarak empedans ölçerek anlaşılmaktadır. Daha sonra, mikropipet eklenir. Bu yaklaşım kullanıldığında, dura üzerinde doku normal uzaklaştırılması, daha fazla elektrod veya pipet kırılma riskini azaltmak için tavsiye edilir.

Alternatif yöntemlere karşılaştırması
Burada kullanılan sistem, diğer basınçlı enjeksiyon sistemleri ile karşılaştırıldığında net avantajlar gösterir. Güçlü bir avantajı, diğer mevcut problar 17 yarısı kadardır mikropipet (yaklaşık 100 um), çapı ve dolayısıyla nevral doku hasarını en aza indirir. önceki tasarımlara aksine, mevcut sistem uzamsal kayıt elektrot ve mikropipet ayrılır çalışmaktadır. Diğer sistemler, elektrot ve pipet arasında küçük bir mesafe temin olsa da, burada açıklanan sistem elektrotlar ve pipet böylece PERMI bağımsız derinliği değişiklikleri sağlarBir kayıt oturumu içinde değişken izafi mesafeleri tting. Enjeksiyon sistemi, esaslı bir kayıt cihazının bir uzantısı olarak da önemlisi, kayıt kalitesi ile ilgili olarak herhangi bir uzlaşma yapılması gerekmektedir. Sadece bir Mikropipet ve böylece bir madde bu protokolde kullanılan iken, bir deneysel prosedür içinde birden fazla madde enjekte etmek mümkündür. Bunu başarmak için, birden fazla mikropipetler ayrı kılavuz tüp içine dişli ve bireysel püskürtme pompalarında monte iğneleri bağlanabilir. Sadece bir bilgisayar programı elektrotlar ve mikropipet ilerlemek için, ve deney sırasında basınç enjeksiyon gerçekleştirmek için gerekli Son olarak, kontrol sistemi, kolay.

iyontoforez basınç enjeksiyon karşılaştırıldığında, göreli avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, basınçlı enjeksiyon böylece nöronal deplasman riskini artıran, iyontoforez daha dokuya tanıtılan büyük hacimli gerektirir. geçerli protocol nL aralığında hacimleri kullanılan ve nadiren bir kayıtlı hücrenin sinyal kalitesinde gözle görülür değişiklikler yaşadı. Sistem aynı zamanda, davranışsal manipülasyonlar için potansiyel olarak yararlı olan, ancak nöronal kayıt stabilitesini etkileyebilecek olan daha büyük hacimler enjekte edilmesini sağlar. yüklü maddeleri kullanmak için hiçbir zorunluluk olmadığından dolayı iyontoforez üzerindeki basınç enjeksiyon net bir avantajı kullanılabilir maddelerin büyük çeşididir. Ancak, pH değerleri kontrol edilmeli ve deney ve kontrol maddeler arasında karşılaştırıldı (örn., Tuz).

soru nöral aktiviteyi işlemek için böyle optogenetics olarak yerine yeni tekniklerin basınçlı enjeksiyon köklü yöntemi kullanmak neden ortaya çıkabilir. iyi kemirgenlerde kurulmuş olmasına rağmen, optogenetics henüz güvenilir bir rhesus maymunları kurulmuş değildir. Özel olarak, henüz bir nörotransmitter türü için seçici olan hücrelerin lokal manipülasyon izin vermez. uzun vadede, görüyoruzbilişsel işlevlerin nöral temelini durulaştırmada optogentic manipülasyonlar avantajları ile farmakolojik manipülasyonlar avantajları kombinasyonu için büyük bir potansiyel.

Burada basınçlı enjeksiyon rhesus maymunlarının davranmak, farmakolojik uyanık beynindeki bir yerel sınırlı alanı işlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermiştir. Biz bu yöntem nöronal aktivitenin dinamiklerine nöromodülatör katkıları araştırmak için diğer bilim adamları ilham umuyoruz.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu eser ST "Duyu İşleme Hücresel Mekanizmaları" İşbirlikçi Research Center 889 (Proje C04) aracılığıyla Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe ile desteklenmiştir. Biz teknik yardım için, Alman primat Merkezi'nde, Dr. Katharina Debowski ve Anna Magerhans ve Kök Hücre Ünitesi Sina Plümer, Leonore Burchardt, Dirk Prusse Klaus Heisig teknik ve hayvansal ilgili destek için Ralf Brockhausen ve işbirlikçileri teşekkür filtrasyon işlemi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(-)-Skopolamin hidroklorürSigma-Aldrich55-16-3Mr 339.81 g/mol
NaCl %0.9 B. Braun Melsungen AG30798705ml 
Terg-a-zymeSigma-AldrichZ273287enzim deterjanı
Hidrojen peroksitRothDeiyonize su ile% 3'lük çözelti içinde kullanılır
EtanolChemie-Vertieb Hannover104642% 70
Deiyonize su
Injekt 40 DuoB. Braun Melsungen AG9166432VŞırınga ve iğne ve nbsp;
Eppendorf Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri, amberEppendorf0030 120.1911,5ml 
Quarzglass mikropipetThomas Kayıt
Kayıt elektroduThomas Kayıtkuvars/platin-tungsten fiber elektrot; empedans değeri 1-2 M & Omega;   ve 0.3-0.5 M & Omega;
PharmedBPT-SchlauchSaint-Gobain Performans Plastikleri 3702003  Boyut: 0,25 x 2,05 mm (Gd: 0,9 mm)
Loctite 401Henkel233641Süper
Yapıştırıcı Silikon yağıThomas KayıtM-1000
Minisart RC15Sartorius17761----------RŞırınga filtresi
Çok Kanallı Mikro Enjeksiyon SistemiThomas Kayıtçok kanallı mikroelektrot manipülatörü " Sistem Eckhorn" mikroelektrotlar ve mikropipetler ve hassas çok kanallı mikroenjeksiyon pompası ile donatılmış
Uyaran sunumunu kontrol etmek içinMcLabözel
dahili laboratuvar yazılımı

Kaynaklar

  1. Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
  2. Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
  3. Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
  4. Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
  5. Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
  6. Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
  7. Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
  8. Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
  9. Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
  10. Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
  11. Lalley, P. M. Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).
  12. Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
  13. Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
  14. Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
  15. Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
  16. Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
  17. Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
  18. Association of Primate Veterinarians. Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , Available from: http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf (2015).
  19. Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
  20. Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nörofarmakolojik ManipülasyonTek Hücre KaydıUyanık Davranış Sergileyen MaymunKortikal Bilgi İşlemeGörsel Dikkat GöreviMikropipet HazırlamaKılavuz Tüp Hizalamasıİlaç Enjeksiyon ProtokolüElektrot Empedans Kontrolü
Uyanık Davranan Macaque Maymun Korteks Bilgi İşlem Neuropharmacology araştırılması için Bir Basınç Enjeksiyon Sistemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.