Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Özet

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Özet

Biyolojik ve klinik bilimlerde, biyolojiyi çözmek, yolları tanımlamak, tedaviyi iyileştirmek, hastalıkları anlamak ve biyobelirteç keşfine yardımcı olmak için birden fazla biyomolekül sınıfını entegre etmek ve ilişkilendirmek için artan bir istek var. N-bağlı glikozilasyon, proteinler üzerindeki en önemli ve sağlam translasyon sonrası modifikasyonlardan biridir ve sinyalleşme, yapışma ve enzimatik fonksiyon gibi kritik hücre fonksiyonlarını düzenler. N-glikanları saflaştırmak ve analiz etmek için analitik teknikler son on yılda nispeten statik kalmıştır. Doğru ve etkili olsalar da, genellikle önemli uzmanlık ve kaynaklar gerektirirler. Bazı yüksek verimli saflaştırma şemaları geliştirilmiş olsa da, bunlar henüz yaygın bir şekilde benimsenmemiştir ve genellikle glikopeptitlerin zenginleştirilmesine dayanır. Thomas-Oates ve arkadaşları tarafından geliştirilen umut verici bir yöntem olan filtre destekli N-glikan ayırma (FANGS), dokular üzerinde kalitatif olarak gösterilmiştir. Burada, sıvı kromatografi kütle spektrometresi ve gelişmiş elektrosprey iyonizasyonu ile doğru nispi miktar tayini elde etmek için FANGS'yi plazmaya uyarladık ve glikan hidrazid etiketleri stratejisiyle etiketleme yaparken bireysellik normalizasyonu ile birleştirdik. Ayrıca, tavuk plazması üzerinde tandem, av tüfeği proteomiği ve glikozilasyon bölgesi analizi yaparak protokole yeni işlevler tasarladık. Filtrede saflaştırılan ve hidrofobik hidrazid etiketleri ile türetilen N-glikanların, bolluk ve sınıf açısından katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile olanlarla karşılaştırılabilir olduğunu gösterdik; İkincisi, bu alanda altın standart olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, iki protokoldeki değişkenlik istatistiksel olarak farklı değildi. Glikomik verilerle uyumlu olarak toplanan proteomik veriler, standart bir tripsin sindirimine kıyasla aynı derinliğe sahipti. Protokolde peptit deamidasyonu en aza indirilerek glikozilasyon motiflerinde tespit edilen spesifik olmayan deamidasyonu sınırlar. Bu, doğrudan glikozilasyon bölgesi analizine izin verdi, ancak protokol ¹⁸O site etiketlemesini de barındırabilir. Genel olarak, kantitatif glikomikler ve proteomik analizler için yeni bir hat içi yüksek verimli, tarafsız, filtre tabanlı protokol gösterdik.

Giriş

Proteomik alanında, filtre destekli numune hazırlama (FASP), yaygın olarak, başlangıç ​​malzemesinin miktarını en aza indirmek örnek hazırlama eserler azaltmak ve numune sayısını en üst düzeye çıkarmak ¹ kabiliyeti için kabul edilmiştir. Bununla birlikte, bu tür bir yöntem henüz ortaya çıkmakta ve Glikomik alanında için çekiş gücü elde etmek için yer alır. Yüksek verimlilik gelişimi, nicel iş akışları nedeniyle ayrılmaz biyolojik savunma glycoslasyonun rolü ve kanser veya hastalıkların ^2,3 ederek modülasyon ihtiyaç vardır. Memelilerde, N -glycans bir çekirdek yapısı dekore sakarit birimi (heksozlar (Hex), hekzoaminler (HexNac), sialik asitleri (NeuAc) ve fucoses (Fuc)), (Hex ₃ HexNac ₂₎ ⁴ kovalent olarak bağlı tekrar oluşur asparajin. Izomerleri sayılır zaman glycospace oldukça geniş olmasına rağmen (> 10 ila ^12), bu gibi bir bileşim olarak oldukça küçük ve moleküler ağırlıkları tipik olarak 1,000-8,000 da ^{5 değişir/ Sup>. Sınıfının kompozisyon homojenliği ve glıkanların hidrofiliklik saflaştırma, ayırma özel bir sorun teşkil ve kütle spektrometrisi (MS) 6 akışları.}

Geleneksel olarak, N -glycans F (PNGase F) ile Peptid N protein veya peptidlerden glikosidaz sindirilir ve daha sonra hidrazid boncuklar ⁸ ile lektin afinite kromatografisi ⁷ ile zenginleştirilmiş yakalanan veya katı faz ekstraksiyonu (SPE), ^9,10 ile saflaştırılmıştır. Bu yöntemlerin hepsi son derece etkili olsa da, tuzsuzlaştırma için ekstra adımlar tanıtmak ve örnek sayısı aynı anda işleme sınırlamak. Son on yılda, Glikomik için yüksek verimli platformlar bir dizi önerilmiştir. Kim ve ark., Bir vakum çalışan, SPE 96 oyuklu plaka ¹¹ ile, bir yarı-otomatik bir yöntem yayınlanmıştır. Alternatif olarak, bir afinite filtre yöntemi (N -glyco-FASP) fi ilk türetme gerekli Mann grubu tarafından geliştirilenLektinlerin ¹² bir kompozit ile ltresi. Son olarak, Thomas-Oates grup glycospace ¹³ dar kompozisyon boyutunu sömürülen bir yarı-kantitatif bir yöntem, N -Glycan Ayırma (dişleri) Destekli Filtre, önerdi. Molekül ağırlığı kesme filtreleri dayanarak küçük kirletici maddeler ilk atık için yıkandı ve daha sonra N -glycans sindirilir ve yıkandı. Deglikolize proteinler Bu protokol filtre üzerinde kalır ve hat FASP tabi tutulabilir.

Tanımlama ve elektrosprey iyonizasyon ile glıkanların miktar (ESI) MS düşük miktardaki türlerinin tespiti için izomerleri ve türetme (kısmen) çözümlemesi için off-line ayrımları gerektirir. Bireysellik etiketleme glikan hidrazit etiketleri stratejisi ile normalize ters-faz sıvı kromatografisi (RPLC) ^14,15 ile uyumluluğu bahşeder. 4-fenetil-benzohidrazid (P2PGN) hidrofobik etiketi enh, glıkanların hidrofilikliğini aracılıkortalama ile iyonizasyon ancing, ¹⁶ dört kat. Basit şartlarda stoikiometrik 1: örneğin permethylation ¹⁷ ya da amin-reaktif etiketleme kimyaları ¹⁸ gibi diğer teknikler, benzer avantajlar sunmaktadır rağmen, hidrazid reaksiyonda, glikanlar 1 tepkimeye sokulur. Rölatif ölçümü yerli (NAT) veya ¹³ C ₆ stabil izotop etiket (SIL) ile derive edilmiş numunelerin ikili analizi ile elde edilmektedir.

Aşağıdaki yöntem doğru göreceli ölçümü için P2GPN hidrofobik etikete plazma uygulamaları ve çiftler bunu için dişlerini geliştikçe. Ayrıca, bu analizler bütünlüğünden ödün vermeden, numunenin tek alikot üzerinde atış-silah proteomik, deamidasyon profilleme ve kantitatif Glikomik gerçekleştirmek için tasarlanmıştır.

Protokol

1. Protein ve glikoprotein denatürasyonu ve alkilasyon

1. Standart preparatları, yük 30 kDa'lık üzerine glikoproteinin (örneğin fetuin veya RNaz B) 0.1 ug / ml çözeltisinin 2.5 ul ya da 10 kDa molekül ağırlığı (Mw) kesme filtresi için.
   1. Biyolojik plazma örnekleri için, bir Bradford ¹⁹ standart veya bisinkoninik asit ²⁰ (BCA) protein analizi ile protein konsantrasyonu kontrol edin. Gerekirse 10-100 mg / ml toplam protein arasında içeren ~ 7 arasında bir pH değerinde, H 100 mM amonyum bikarbonat _{(NH4 HCO3) 2,} O (PNGase Digest tamponu), plazma seyreltilir. bir filtre üzerine yük 2.5 ul plazma (25-250 mg protein).
      Not: Bu protokol, tek etilendiamintetraasetik asit (EDTA) mevcudiyetinde toplanan kan örneklerinden plazma test edilmiştir.
2. Filtrede her numuneye 1 M ditiotreitol solüsyonu (DTT) ve 2 ul ekle.
3. 20 ile örnek seyreltilir0 ul tampon sindirimi PNGase.
4. yuvasından filtreyi rahatsız etmemek için dikkatli olmak, filtre örnek tüp ve hafifçe vorteks Cap. 30 dakika proteinler ve glikoproteinleri denatüre etmek için 56 ° C'de örnek inkübe edin.
5. örnekleri alkillemek için, 50 ul 1 M iyodoasetamid ekleyin ~ 200 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   Not: proteomik analizi istenmiyorsa, aşama 1,5 atlanabilir.
6. 40 dakika 14.000 xg'de örnekleri santrifüj edilerek filtre üzerine denatüre glikoprotein Konsantre. akmasına atın.

2. N Glycan Enzimatik Sindirim -bağlı

1. tampon sindirmek PNGase 100 ul örnek yıkayın. 20 dakika boyunca 14.000 xg'de filtre üzerinde glikoprotein Konsantre ve akış atmak.
   1. Filtre ölü hacim (~ 5 ul) içindeki bir konsantre elde üç kez olmak üzere toplam iki kez yıkanır ve konsantre edilir yineleyin. tüm atınakış-through.
   2. yıkar kez atın toplama şişesi tamamlandı. yeni bir koleksiyon şişenin gelecekteki tüm yürütücüler ve yıkar toplayın.
      NOT: PNGase kimyasal amitsizleştirilmiş hale de-glikosile asparagin siteleri, kararlı izotop etiketleme için PNGase F sindirim adımı sırasında kullanılabilecek H ₂ ¹⁸ O arabelleği sindiremez.
2. yeni bir koleksiyonu şişesine transferinden sonra filtre gliserol içermeyen PNGase F (75,000 x birim / ml) 2 ul ekle. PNGase 98 ul 100 ul toplam hacmi getirerek, tampon sindirmek ve hafifçe karıştırın aşağı filtre üzerinde yukarı pipet ve ekleyin. Enzimatik adımlarda 2.2.1, 2.2.2, 2.2.3 OR koşullarda glikan sindiremez.
   NOT: Proteinlerin Deglikosilasyondan için üç yöntem kullanılabilir. sadece Glikomik analizi (hayır proteomik), adım 2.2.1 uzun inkübasyon önerilir. Glikomik ve proteomik araştırma için, 2.2.2 ve 2.2.3 minimal olmayan sp ile yüksek kaliteli peptitler üretecek adımlarıecific deamidasyon.
   1. Glikomik sadece sindirim protokolü (18hr) enzimatik tüm N -glycans ayırmak için 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Başak sindirim protokolü (SPI): 2 saat, 50 ° C'de inkübe edin. hızlı çalışarak, gliserol-ücretsiz PNGase F (75.000 x birim / ml) ilave 2 ul örnekleri ve başak çıkarın. Hafifçe 1-2 sn karıştırmak için örnekleri girdap. ek olarak 2 saat daha 50 ° C'de inkübe edin.
   3. Mikrodalga sindirim protokolü (MD): Bir mikrosantrifüj tüp yüzer rafa yerleştirin örnekleri. 1 L'lik bir beher içinde şamandıra örnekleri deiyonize (Di) su, 1 L ile doldurulur. bir döner levha ile bir mikrodalga fırın (950 W) merkezinde beher yerleştirin. 5 dakika boyunca% 60 güç (570 W) mikrodalga. soğutmak için, numunelerin alınması ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında tutun. Daha sonra% 60 güçte ilave bir 5 dakika boyunca mikrodalga.
      NOT: Mikrodalga Gücü mikrodalga maksimum güç çıkışı göre ayarlanır gerekecektir.Ortalama güç modelleri arasında sabit tutulmalıdır.

3. N elüsyon -glycans

1. 20 ° C'de 20 dakika 14,000 xg'de Örneğin santrifüj ile glikanlar Zehir.
2. PNGase 100 ul, 20 ° C'de 20 dakika 14,000 x g'de filtre ve santrifüj tampon sindirimi ekleyin. Kalan N içeren toplayın yıkama, yıkama sıvısı olarak aynı koleksiyon flakon, glıkan -bağlı. İki kez tekrarlayın. Yeni koleksiyon flakon filtre ve yer çıkarın.
3. Dondurulmuş (30-60 dakika) kadar -80 ° C'de derin dondurucuda glıkan örnekleri inkübe edin. Vakum yoğunlaştırıcısı (4-6 saat) oda sıcaklığında tamamlanması, Kuru.
   Not: N -glycans türetme işleminden önce, altı aya kadar, -20 ° C'de saklanabilir.

4. Protein FASP Sindirim

NOT: proteomik veya deamidasyon sitesi analizi istenmiyorsa, protokol bölümü 4 atlanabilir.

1. t durulayıno 8 M üre tampon 400 ul, amitsizleştirilmiş peptidler içeren, filtre. toplama flakon ve karıştırmak için hafifçe vorteks Cap. 15 dakika 14.000 xg filtre üzerinde yoğunlaşın. Tüm flow-through atın.
   1. Üç üre tampon yıkar toplam adımı yineleyin 4.1 iki ek kez.
2. 2 M üre, 10 mM _CaCl2 Tampon 400 ul (tripsin tampon sindirmek) ile deamide peptidleri ihtiva eden, durulayın. toplama flakon ve karıştırmak için hafifçe vorteks Cap. 15 dakika 14.000 xg filtre üzerinde yoğunlaşın. Tüm flow-through atın.
   1. Adımı yineleyin 4.1 iki ek kez, üç tripsin toplam tampon yıkar sindiremez.
   2. yıkar kez atın toplama şişesi tamamlandı. yeni bir koleksiyon şişenin gelecekteki tüm yürütücüler ve yıkar toplayın.
3. 5 tripsin: 1:50 ya da 1 50 ul domuz modifiye tripsin ekleme protein (a / a), buluş veya kantitatif proteomik deneyler için oranı sırasıyla.toplama flakon ve karıştırmak için hafifçe vorteks Cap.
4. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 5 tripsin: protein oranı hızla çalışarak, 1:50 veya 1 de tripsin ek 50 ul örnekleri ve başak çıkarın. Hafifçe 1-2 sn karıştırmak için örnekleri girdap. ek olarak 2 saat daha 50 ° C'de inkübe edin.
5. 15 dakika için 14,000 x g'de iplik peptitlerin yıkanması.
6. 400 ul% 1 formik asit ve% 0.001 Zwittergent 3-16 (söndürme tamponu) ile filtre kalan peptidler durulayın. 15 dakika boyunca 14.000 xg'de iplik filtreyi devre dışı Zehir.
7. Bradford ¹⁹ veya BCA ²⁰ tarafından örneklerinde peptit konsantrasyonu ölçmek.
8. (30-60 dakika) dondurulmuş kadar ° C derin dondurucuda -80 peptid örnekleri inkübe. Vakum yoğunlaştırıcısı (4-6 saat) oda sıcaklığında tamamlanması, Kuru.
   Not: Kuru peptidler üç aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
9. Liqui için Triptik proteinler hemen önce yeniden süspanseD kromatografisi-kütle spektrometrisi% 2 asetonitril (LC-MS) analizi,% 98 _H2O ve istenen konsantrasyona% 0.1 formik asit (mobil faz A). 2.5 ul plazma aralığından triptik peptid konsantrasyonları 100 den - 300 ng / ul.

N 5. türetilmesi Hidrofobik hydrazide Etiketler glıkanlar -bağlı

1. 0.25 mg / ml bir son konsantrasyon için, asetik asit (derivatizasyon çözeltisi): 75:25 MeOH 1 ml kurutuldu ağır (SIL) veya ışık (NAT) P2GPN reaktifleri sulandırın. Reaktifler tamamen çözünür hale getirmek için 10 dakika kadar sürer. Yaygın vorteks tam çözülmesini sağlamak.
   Durumunda bu türetme protokol standardı N -glycans, karşı saflaştırılmış glukanlardır, P2GPN molar oranı ile kullanılır: Not: glikan yaklaşık (ve az) 17 den olmalıdır: 1.
2. Etiket kurutuldu N SIL veya NAT P2GPN reaktifi 200 ul (50 ug) ile -glycans. kurutulmuş glıkanları tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipet ve. Vortex saörnek olarak şunlar verilebilir ve daha sonra bir tezgah üstü santrifüj ~ 5 saniye örnekleri aşağı doğru döndürün.
3. 56 ° C'de 3 saat reaktif ile glikanlar React.
4. Hemen vakum konsantratör için inkübatör glikan taşıyın. 55 ° C (3-5 saat) tamamlanması için kurutulur.
   NOT: Bu adım türetme reaksiyonu söndürür; Numune sonraki adımlarda çapraz reaksiyon önlemek için tamamen kuru olmalıdır.
   NOT: Kurutulmuş, etiketli örnekler altı aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
5. Süspanse hemen önce LC-MS analizi için _H2O 25-50 ul N -glycans etiketli. N -glycans tamamen çözülmüş olduğundan emin olmak için aşağı yukarı pipet ve.
   Not: yeniden süspanse edilmesi için başlangıç ​​hacminin protein konsantrasyonu tahmin edilebilir glikoproteinin başlangıç ​​konsantrasyonu bağlıdır. Ancak aralık Örnek tipine göre farklılık gösterir ve ayrı ayrı optimize edilmesi gerekmektedir.
6. 5 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüje örnekleri. Süpernatant kaldıratant, dikkatli olmak pipet ucu santrifüj tüpünün alt dokunmasına izin değil.
   Not: Aşırı etiket gözle olmayabilir, ama santrifüj azalacaktır.
7. Tandem analiz için: 1 oranında bir 1, bağıl ölçümü için arzu edildiği takdirde, NAT ve SIL örnekleri bir çift birleştirin.

6. Ultra yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi ve Kütle Spektrometre Analiz

Not: kolay bir NLC-1000 ve Q Exactive Yüksek alan için tarif edilen LC MS koşulları, sırasıyla içi proteomik analizi ve glıkan analizi ²¹ için optimize edildi. Bu koşullar, diğer ultra yüksek basınç veya nano LC sistemleri ve diğer yüksek çözme gücü kitle spektrometre adapte olabilir, ancak küçük değişiklikler gerekebilir. Yüksek çözme gücü kütle spektrometresi kullanılması glikan tanımlanması ve deamidasyon analizi ^22,23 için gereklidir.

NOT: s 6,1-6,3 olabilir AdımlarUygun bir ters-faz kromatografi ya da hidrofilik interaksiyon ticari tuzağı ve sütun kullanıldığında kipped.

1. Meiring ve ark., Bir tuzak olarak kullanım için ²⁴ uyarınca 100 uM İD kılcal bir cam hamuru sentez.
2. 2,6 uM, 100 A, C _18, ambalaj malzemesi ve 5 cm'lik bir uzunlukta kesilir basınç altında tuzak paketleyin.
3. 2.6 uM, 100 A, C _18, ambalaj malzemesi ile basınç altında 75 uM İD yayıcı sütunu paketi ve 30 cm'lik bir uzunlukta kesilir.
4. proteomik (6.4.1) ve Glikomik (6.4.2) iş akışları için iki farklı LC-MS yöntemleri hazırlayın.
   Not: Protein ve glikan örnekleri herhangi bir sırayla aynı tuzak / sütun ayarına üzerinde çalıştırılabilir.
   1. Protein analizi için, mobil faz A (MPA) kolona protein ~ 400 ng enjekte edilir. 1 ul ön kolon dengeleme (500 bar) ve 5 ul analitik kolon dengeleme birlikte Tablo 1 'e göre, 300 NL / dakika Örnek çalıştırın(500 bar). Tablo 2'de verilen MS koşulları altında proteinleri iyonize.
   2. glikan analizi için, yeniden süspanse 5 ul enjekte P2GPN kolona NAT / SIL eşit molar örnekleri etiketli. 2 ul ön kolon dengeleme (500 bar) ve 5 ul analitik kolon dengeleme (500 bar), Tablo 3'e göre, 300 NL / dakika Örnek çalıştırın. Tablo 4'te verilen MS koşullarında glikan iyonize.

Zaman	% MPA	% MPB
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

Proteomik analizi için Tablo 1. LC koşulları. Mobil faz B (MPB,% 98 asetonitril,% 2 _H2O,% 0.1 formik asit) ile gradyan elüsyonu atış gun proteomik, veri-bağımlı kazanılmasının Peptidlerin elüsyonu için gerçekleştirilmiştir MS deneyler.

MS 1 Parametreler
Kütle Aralığı (Th)	375-1500
çözüm	120.000
AGC	1 × 10 6
Max İyonizasyon Zaman	30
S-Lens FR Seviye	55
kılcal TemP (° C)	300
Gerilim sprey	1.75
MS 2 Parametreler
Toplama Tipi	TOP20
çözüm	15.000
AGC	1 x 10 5
Max İyonizasyon Zaman	30
Az dolu bir Oranı	% 2
İzolasyon Pencere (Th)	1.4
Şarj Devlet Dışlama	1
Normalize Çarpışma Enerjisi	27
Dışlama Süre (ler)	20

Tablo 2: Bir Orbitrap enstrüman MS proteomik analizi için koşullar elektrosprey iyonizasyon parametreleri, MS ¹ satın alma, ve MS ² edinimi yüksek enerjili dissociatio kullanarak.n (HCD) verilir.

Zaman	% MPA	% MPB
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	10	90
55	10	90
56	95	5
66	95	5

Tablo 3:. Glıkan analiz için LC koşulları bir gradyan elüsyonu hidrazid N MS analizi için -glycans etiketli elüte etmek için yapıldı.

MS 1 Parametreler
Kütle Aralığı (Th)	600-1900
çözüm	60.000
AGC	5 × 10 5
Max İyonizasyon Zaman	64
S-Lens FR Seviye	65
Kılcal Sıcaklık (° C)	325
Gerilim sprey	1.75
MS 2 Parametreler
Toplama Tipi	Top12
çözüm	15.000
AGC	5 × 10 4
Max İyonizasyon Zaman	100
Az dolu bir Oranı	% 1
İzolasyon Pencere (Th)	1.4
Sabit Birinci Kütle
Kademeli Normalize Çarpışma Enerjisi	10/20/30
Dışlama Süresi (sn)	15

125

Tablo 4: hidrazid MS şartları N -glycan analiz etiketli elektrosprey iyonizasyon parametreleri, yüksek enerjili ayrışmasını (HCD) kullanarak bir Orbitrap enstrüman MS ¹ satın alma, ve MS ² edinme verilir..

7. Proteomiks ve deamidasyon Analizi

1. Standart biyoinformatik arama araçlarını kullanarak protein / peptidler belirleyin.
   Not: Aşağıdaki analiz protokolü UniProtKB Swiss-Prot / TrEMBL veritabanlarını kullanarak ve Proteome Discoverer 1.4 yazılımı SEQUEST üzerinden arama dizayn edilmiştir, ancak, protokol doğrudan bir GUI yazılımı kullanarak herhangi bir protein arama ve puanlama motoruna tercüme edilebilir. Aşağıda verilen tüm komutlar açılan menüleri aracılığıyla yazılım arayüzleri erişilebilir.
   1. oluşturma veya Apweiler ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, genomik veri veya proteom veritabanlarından bir organizma uygun protein dizisi veritabanı indir. ²⁵
      Not: Ortak proteom veritabanları Swiss-Prot, TrEMBL ve NCBI içerir, ancak aynı zamanda in-house verilerinden inşa edilebilir.
2. Perkins ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi yazılım içinde, elde edilen verilerin kalitesi ve istenen arama hassaslığını göre bir veritabanı arama motoru seçin ve parametreleri seçin. MASCOT ²⁶ veya Eng ve arkadaşları. SEQUEST ²⁷ için.
   1. Yüksek kütle doğruluk verileri için, yazılımda arama için parametrelerini ayarlamak şöyle: max 2 cevapsız bölünmelere, 5 ppm habercisi kitle hoşgörü ve 0.02 Da fragmanı kütle toleransı (optimize doğru deamidasyon tespiti ²²⁾ ve aşağıdaki triptik peptit değişiklikleri içerir "carbamidomethyl (C)" statik modifikasyonu ve "deamidasyon (N / Q)" ve "oksoidation (M) "dinamik değişiklikler. ¹⁸ O sindirim etiketleme kullanıyorsanız, include" deamidasyon ¹⁸ O (1) "ek dinamik değişiklik olarak.
   2. Arama, seçilen motor, protein veritabanı (7.1.1) karşı ham peptid verileri kullanarak.
      Not: Kütle toleranslar kullanılan enstrüman için uygun ve keyfi olarak düşük olmamalıdır.
      Not: arama fonksiyonu çeşitli arama motoru özel algoritmalar kullanarak yazılım tarafından otomatik olarak tamamlanır. süzücü algoritması (MASCOT), SEQUEST veya algoritmaların diğer kombinasyonları peptidler proteinleri tespit ve isabet geçerliliğini puan için kullanılmaktadır; bulunan araçlarla ilgili daha fazla bilgi Gonzalez-Galarza ve ark., ^28,29 den bir yorumda kaplıdır. yazılıma bağlı olarak, ek bir ara parametre kullanıcının kararına göre seçilebilir gerekebilir.
3. kılavuzu küratörlüğü ve Furth için belirlenen peptidler dışaer analizi.

El N asparagin bir tespit deamidasyonu içeren peptidlerin bir listesini küratörlüğünü glikosilasyon motifine -bağlı (NX- (S / T) X ≠ P). literatürden bilinen glikosilasyon motifleri ile bu siteleri Çapraz doğrulamak ve sonuçların iki havuzu oluşturmak (valide ve teorik).

Amitsizleştirilmiş ve non-amitsizleştirilmiş formlarının bolluğu karşılaştırarak, belirli bir glikozilasyon sitenin yüzde doluluk karşılaştırmak için spektral sayım ³⁰ kullanın.

8. Glikan nispi niceliği

Not: Aşağıdaki tanımlama ve miktar XCalibur yazılımı kullanılarak tamamlanmıştır. Ancak, otomatik olarak ham verileri analiz eder ve herhangi bir yazılım kromatografik zirveleri ikame edilebilir bütünleştirir.

1. Bir heksozların, deoksi-heksozların, hekzoaminler, sialik asitlerin biyolojik olası kombinasyonların gelen glikan kompozisyonların teorik listesi ve diğer sa oluşturmakccharides. Bu amaçla, bir insan glıkan veritabanı Walker ve arkadaşları. ¹⁵ tarafından yayınlanmıştır ve olduğu gibi kullanılabilir. Teorik veritabanları için türe özgü biyolojik kısıtlamalar birleştirici alan empoze edilmelidir ve bu kurallar Kronewitter ve ark., ³¹ tarafından tarif edilmiştir.
2. Proton şarj devletler + 1-3 için her bileşim için atomik kitlelerden glikan Monoizotopik kütleleri (M) hesaplayın. NAT (254,14191 gr / mol) ve SIL (260,162042 g / Mol) P2GPN etiketinin eklenmesi dahil monoizotopik kütleler değiştirin.
3. Xcalibur Yol haritası görünümünde "İşleme Kur" programını açın. Tam olarak Walker et al ek malzemenin de tarif edildiği gibi bir işleme yöntemi ayarlayın. ¹⁵ teorik monoizotopik kütleler ihtiva eden aşama 8.2'de elde listesini kullanarak [M + H] ^1, [M + 2H] ²⁺ ve [ M + 3H] ³⁺ tür.
   Not: Doğru ötesinde glikan kimliğini onaylamak içinNAT / SIL çalışır dupleks için kitle, kontrol aynı tutma süresi ile NAT ve SIL N -glycan çiftleri eş elute söyledi. Niteliksel okzonyum iyon serisi ³² ait doruklarına içermelidir ki, MS ² spektrumları ile tanımlamaları çapraz doğrulamak.
4. Tam Walker ve ark Yan Malzeme açıklandığı gibi SIL ve NAT bolluklarını elde etmek için Excel alanları entegre, çıkarılan iyon kromatogram (XIC) ihracat. ¹⁵
5. Excel'de, program yeni bir sütunda hücreleri Walker ve arkadaşları tarafından yayınlanan denkleme göre SIL bolluğu ayarlayarak molekül ağırlığı örtüşme için düzeltme hesaplamak için ^{1 5.:}
   ,
   Bir Monoizotopik tepe ve teorik izotop örtüşme olduğu, , Bağımsız bir şekilde bileşimin her hesaplanabilir.
6. Walker ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, ikinci sütununda program hücreleri, spektrum başına toplam normalleştirilmiş glıkan faktörü (TGNF) için denklem kullanılarak NAT ve SIL kanalları normalize etmek için ^{1 ila 5.:}
   ,
   N'dir N sayısı miktar sınırının üzerinde -glycans.
7. iki örnek arasındaki konsantrasyon kat değişimi hesaplamak için NAT glıkanları (veya tersi): yeni bir sütun, programı hücreleri SIL oranını almak.

Sonuçlar

Şekil 1:. Kombine proteomik ve Glikomik analizi için dişleri-P2GPN hidrofobik etiketleme birleştiğinde yöntemin şeması (Yöntem A) verilen glikozilasyon sitesi tanımlama ile Glikomik sadece işleme ve tandem Glikomik ve proteomik analizi arasında farklılık adımlar, vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Içinde hat proteomik ve Glikomik, filtre tabanlı P2GPN hidrofobik etiketleme yöntemi (Yöntem A) toplanmış tavuk plazma örnekleri (Şekil 1) kullanılarak belirlenmesi, kantitatif ve molekül ağırlığı önyargı için doğrulandı. Yalnızca Glikomik deneyler için, N bolluk arası karşılaştırmalar Yöntemi ile ekstre -glycansBir SPE (altın standardı, Metot B) yapılmıştır (Şekil 2) carbograph için. İki yöntem arasındaki glukanlardır bolluk açısından anlamlı bir fark yoktu. aynı yöntemle ekstre glıkanların NAT oranı: içi değişkenliği de SIL nicelleştirilmesiyle tayin edilmiştir. Her iki yöntemin günlük ₂ dağıtımı: sıfır merkezli, Gauss vardı ve (Şekil 3A-B) anlamlı olarak farklı değildi. Molekül ağırlığı filtresi N molekül ağırlığı aralığı ve hidrofil (Şekil 4) dayalı -glycans ayrımcılık olmadığını düşündüren, tamamen üst üste iki protokol arasında değişmektedir.

Şekil 2:. NAT ve SIL N eşdeğer moldeki bir karışımı Yöntem A veya Yöntem B ile ekstre -glycans 2.5 tavuk plazma ul (n = 4) Örnekler edildi anal hazırlandıHer NAT / SIL kanalında bölüm 6. Her glikan için bolluğu önerilen önerilen parametrelere göre UPLC-MS ile yzed, moleküler düzeltmek, çıkarılan iyon kromatogram (MMA = 3 ppm) altındaki alanların integrasyonu ile hesaplanmıştır TGNF ağırlık örtüşme ve ayarlama. Bu oranlar standart hata ile gösterilir. Yöntem B bolluğu. Yöntem A N -glycans (p> 0.05) anlamlı bir fark yoktu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3, (A) yöntemi, bir içi değişkenliği (N = 133), ya da (b) Yöntem B (n = 123) stratejiler karşılaştırılmıştır. Aynı çıkarma düzeni N -glycans NAT ve SIL eşit molar karışımları,Üç teknik çoğaltır üzerinde analiz edildi. Günlük ₂ dağıtımı: sıfır merkezli ve iki iş akışları arasında. Anlamlı fark edildi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Her stratejiden glıkanların molekül ağırlığı aralıkları karşılaştırıldı. İki iş akışları aynı molekül ağırlığı aralığı kapsayan glıkanları vermiştir. N, diğer sadece algılama (1 × 10 ⁵ bolluk) sınırının üzerinde düştü karşı bir protokolde tespit -glycans ve sistematik önyargı yansıtmıyor. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.

(Tablo 5) olmadan geleneksel FASP hazırlanması ile karşılaştırılmıştır. FASP tripsin sindirmek (Std protokolü) tarafından takip Bizim tipik 18 saat filtre tabanlı PNGase F sindirim, glycosites tanımlanması engelleyebilir non-spesifik deaminasyondan önemli düzeylerde sonuçlandı. Bu nedenle, yüksek bir sıcaklıkta (50 ° C) ve bir PNGase F başak aşama (SPI protokolü) de kısa bir kuluçkalama süresinde kullanan bir yöntem olup, bir mikrodalga sindirim protokolü (MD protokolü) ile birlikte, bir alternatif olarak araştırılmıştır, sivil en aza indirmek için belirli bir deamidasyon. Yeni sindirim yöntemleri gözlenen glıkanlar, standart 18 saat gelen kompozisyonlar ya da bolluk içinde anlamlı bir farklılık yoktu 37 ° C filtre PNGase F özeti ( (Tablo 5) için bir yalancı pozitiflik oranı ile azalmıştır.

		proteinler					peptitler					amitsizleştirilmiş Peptitler					Glycosites					glikoproteinler
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP								3083					795					5					5
18hr		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

. Tablo 5: Standart bir tripsin ile proteomik verilerin karşılaştırılması in-line dişleri-P2GPN etiketleme yöntemi yapılmıştır karşı sindirmek hazırlıklar ile gerçekleştirildi (+) ve olmayan (-) PNGase F non-spesifik deaminasyondan ve tahmin arka plan oranlarını belirlemek için yalancı pozitif oranları glycosite. Proteinler% 1 yanlış keşif oranı (FDR) ile tespit edilmiştir; peptidler Proteome Discoverer 1.4 "yüksek" peptid güvene dayalı filtre edildi (q <0.01); glycosites saptanmasına edildied korunmuş glikosilasyon motifi (NXS / T) deamidasyonu içeren benzersiz dizilerinin dayalı; ve glikoproteinler, en az bir tespit glycosite ihtiva tanımlanan proteinler olarak tanımlandı.

Şekil 5: glikanlara kısaltılmış protokoller örneklerde deaminasyonu en aza indirmek için geliştirilmiş ve 18hr dişleri PNGase F Digest karşılaştırılmıştır. bollukları ortalama farklılıklar% 10 ve sırasıyla MD (2.2.3) ve SPI (2.2.2) protokolleri,% 5 idi. Tespit 48 glukanlardır,% 90 daha az 1,5 kat varyasyon daha. Görüntülenen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Rutin glikan analizini kolaylaştırmak için yüksek verimli kantitatif yöntemlere ihtiyaç vardır. Son otuz yıldır, glikozik analizi, hastalık, klinik uygulamalar ve farmasötiklerdeki önemine rağmen, araştırma gruplarının bir alt kümesiyle sınırlı kalmıştır. Glikozikler ve proteomikler için FANGS-P2GPN saflaştırma ve etiketleme yöntemi, aynı analizi tek bir numune alikotunda gerçekleştirerek malzeme maliyetini ve ihtiyaç duyulan malzeme miktarını azaltır (özellikle insan ve fare çalışmalarında önemlidir). Ayrıca, hazırlıklardaki değişkenliği en aza indirme çabaları kritik öneme sahiptir, çünkü her ek adım hataya katkıda bulunur ve vaka kontrol çalışmalarındaki önemli ancak düşük miktarda değişiklikleri potansiyel olarak maskeler. FANGS'nin hidrofobik hidrazid etiketlemesine bağlanması, protein ve glikan numunelerinin aynı RPLC kolonu üzerinde çalıştırılmasına izin verir, glikan iyonizasyonunu arttırır, nispi miktar tayini sağlar ve plazmaya kantitatif olarak uygulanabilir.

N-glikan analizi için, tam de-glikosilasyon elde etmek için önerilen PNGase F seviyesinin kullanılması kritik öneme sahiptir. Glikanlar çözücüye maruz kalsa da, proteinlerin ve fazla enzimin denatürasyonu, verimli ve tam bölünmenin sağlanmasına yardımcı olur. Glikanların doğru miktar tayini için, NAT ve SIL türlerini karıştırırken reaksiyonu söndürmek ve çapraz reaksiyonları önlemek için türevlendirmeden sonra tamamen kurutulmalarını sağlamak gerekir. Son olarak, iş akışını glikozit analizine genişletirken, spesifik olmayan deamidasyonu en aza indirmek için adımların zamanlaması kritik öneme sahiptir. Kombine glikozik ve proteomik analiz için sağlanan değiştirilmiş protokoller, uygun şekilde yapıldığında tutarlı bir şekilde çalışır.

İş akışı, altın standart SPE yöntemine kıyasla plazmadan N-glikanların doğru nispi miktar tayinini sağlar. Moleküler ağırlık, hidrofiliklik ve bileşim yapısı açısından ekstrakte edilen glikan türlerinde belirgin bir önyargı yoktur. O-bağlı glikanların kalitatif analizini araştırmamış olsak da, FANGS'nin N-bağlı glikanların PNGase F sindirimi sonrası bir β-eliminasyon adımının eklenmesini sağlayabileceğini umuyoruz. Bununla birlikte, prosedürler, kütle spektrometrisinden önce reaktif temizliği için önemli değişiklikler gerektirecek ve peptit analizi önemli ölçüde etkilenecektir. Proteomik için, geleneksel FASP yöntemlerine kıyasla aynı derinlikte proteom kapsamı elde edilir. Daha da önemlisi, yöntemler N-glikan deamidasyonu için minimum yanlış keşif oranı elde eder. Yöntem, PNGase sindirim adımı^22,23 sırasında Asn'nin ¹⁸O etiketlemesi ile uyumlu olsa da, düşük glikosilasyon bölgesi yanlış keşif oranı, bunun gerekli olmayabileceğini ve maliyetleri ve karmaşıklığı daha da azaltabileceğini düşündürmektedir.

Hem avantajları hem de dezavantajları olan bu yöntemde proteom glikoproteinler için zenginleştirilmemiştir. Bazı düşük bol glikoproteinler analizde tespit edilemeyebilir. Bununla birlikte, protein başına glikosile edilmiş bölgelerin doluluğu, biyolojik numuneler arasında karşılaştırılabilir. Ek olarak, lektin afinitesinin saflaştırılmasından veya kimyasal zenginleştirmeden kaynaklanan hata ve önyargı ortadan kaldırılır. Sonuç olarak, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken FANGS'nin bireysellik normalizasyonuna bağlanması, klinik vaka kontrol çalışmalarında uygulama için büyük potansiyele sahip glikoz ve proteomun tandem analizi için basitleştirilmiş, nicel, yüksek verimli bir yöntemle sonuçlanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetik Asit (%50)	Sigma Aldrich	45754
Asetonitril, HPLC sınıfı	Burdick & Jackson	AH015-4
Amonyum Bikarbonat	Sigma Aldrich	A6141
Bradford Reaktifi	Sigma Aldrich	B6916	Alternatif: Bikinkoninik asit kiti (Sigma Aldrich BCA1)
Kalsiyum klorür	Sigma Aldrich	C1016
Santrifüj	Eppendorf	5804 R	14.000 x g'a ulaşan alternatif santrifüjler uygundur
DL-Dithiothreitol, 1  Çözümdeki M	Sigma Aldrich
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternatif nano veya ultra yüksek basınçlı LC'ler, aşağıdakiler gibi benzer veriler üretecektir: 1. Dionex UltiMate & Ograve; 3000 LC (Termo Bilimsel); 2. Beraat UPLC (Sular).
Yüzer Tüp Rafı	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standart Laboratuvar Fırınları	Fisher Scientific	11-690-625F	56 'ye ulaşan alternatif inkübatörler; ° C uygun
Formik Asit	Sigma Aldrich	56302
GE Mikrodalga Fırın	General Electric	57B5 E82904	Ayarlanabilir güç ayarlarına sahip herhangi bir mikrodalga uygundur
INLIGHT Glikan Etiketleme Kiti	Cambridge İzotop Laboratuvarları	GTK-1000	INLIGHT kiti, P2GPN reaktifinin NAT ve SIL versiyonlarını sağlar.
İyodoasetamid	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 toplu sabit faz	Phenomenex	Toplu Medya	Alternatifi: Herhangi bir C < alt > 18 < / alt> sabit faz 5 & nbsp; mM
Maskot Daemon Yazılımı ve Sunucu	Matrisi Bilim		Alternatifi: Proteome Discoverer Yazılımı (Thermo Scientific)
Metanol, HPLC sınıfı	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Kendi Kendine Paket Sütunu: 360  μ m, OD 75  μ m Kimliği, 15  μ m uç, kaplamasız, kutu başına 5 adet, 50 cm	Yeni Hedef	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (gliserol içermez), 75.000  birim / ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hibrit Dört Kutuplu Orbitrap Kütle Spektrometresi	Termo Bilimsel		Alternatif yüksek kütle doğruluğu (5   ppm) kütle spektrometreleri benzer veriler sağlayacaktır
RNase B	New England Biolabs	P7817S
Tripsin		T6567-5X
Üre	Sigma Aldrich	51456
Vakum Konsantratörü Savant SPD131DDA SpeedVac Konsantratör	Thermo Scientific	SPD131DDA	Alternatif vakum konsantratörleri uygundur
Vivacon 500 30 kDa Filtreler	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	Alternatifi: Amicon Ultra 0.5 Ultracel-10  kDa Membran (Millipore UFC501096)
Su, HPLC sınıfı	Burdick & Jackson	AH365-4
Su, 18O	Cambridge İzotop Laboratuvarları	OLM-240-97-1	PNGase F özetleme adımına 18O ilavesi isteğe bağlıdır ve %95 güvenle tamamlanan deamidasyon çalışmaları için gerekli olmayabilir
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kiti	Merck Millipore	693030