Yöntem makalesi

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

DOI:

10.3791/53736

⸱

16 Şubat 2016

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokulardaki immün hücre ağları, lokal bağışıklığa aracılık etmede ve doku homeostazını korumada hayati bir rol oynar, ancak oral mukoza ve dişetindeki yerleşik immün hücre popülasyonları hakkında çok az şey bilinmektedir. Sürekli mikrobiyal maruziyet alanı ve yaygın bir enflamatuar hastalık olan periodontitise karşı savunmasız bir bölge olan murin dişeti dokularından bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve incelenmesi için bir teknik oluşturduk. Protokolümüz, kararlı durumda bile dişetinde yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonlarının ayrıntılı bir fenotipik karakterizasyonuna izin verir. Prosedürümüz ayrıca, sitokin sekresyonunun ex vivo olarak değerlendirilmesi gibi fonksiyonel çalışmalarda kullanım için yüksek canlılığa sahip yeterli hücre verir.Dişeti immün hücre ağının fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunun bu kombinasyonu, oral bağışıklık ve periodontal homeostaz ile ilgili mekanizmaların araştırılmasına yardımcı olacaktır, ancak aynı zamanda lokal immünopatolojide yer alan mekanizmaları anlamamızı da ilerletecektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gingival dokusu, insan ve murin diş yapısına çevreleyen sürekli diş 1 kompleks biyofilm maruz kalmaktadır. Dişeti bariyeri polislik bağışıklık hücre ağı patojenik meydan 2 karşı etkili bağışıklık sağlayan, aynı zamanda, doku bütünlüğünü korumak, yerel ortakçı mikroplarla homeostazisini sağlanması ve hayati önem taşımaktadır. Homeostazı elde etmek için, bağışıklık sistemi dikkatlice henüz küçük ayrıntı dişeti bağışıklık hücre popülasyonlarının ve doku bağışıklığı 2 korunmasında rolleri bilinen bir yüksek ihtisas bağışıklık hücre ağı oluşturma dişeti çevre için hazırlanmıştır.

Immün homeostasisin gingiva de bozulduğu zaman, ya da daha büyük bir konakçı karşı duyarlılık ve / veya disbiyotik mikrobiyal topluluklar, enflamatuar bir durumun varlığı sayesinde, periodontit 3 4 ortaya çıkar. Periodontitis diş s kaybına yol açan yaygın bir inflamatuar bir hastalıktıraltlık yapılar. Onun ağır formlarında genel nüfusun 5 yaklaşık% 10'unda görülür. Periodontitis duyarlılık ve ilerlemesinde rol önemli faktörler Kesme 6 zor olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hayvan modelleri periodontitis başlangıcında ve ilerlemesinde 7 mekanizmalarını anlamak son derece yararlı olmuştur. Modeller bağışıklık homeostazı ve periodontitis sürücü gelişimini sürdürmek için hayati önem taşımaktadır anahtar hücre popülasyonlarının ve moleküler mediatörler tanımlamak için kullanılabilir. Böyle bir anlayış bağışıklık homeostazı dişeti özgü kontrol anlayışımızı dönüşümü ve hastalık patogenezinde güncel anlamanız açısından çok önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol açıklanan tüm deneysel prosedürleri gerekli kurallar takip ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, NIDCR / NIH tarafından kabul edildi.

1. Peşin hazırlayın

  1. Tam ortam hazırlayın: RPMI 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 10 FBS ile takviye edilmiştir.
  2. 7.5 ug DNaz ile desteklenmiş RPMI medya 50 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): DNase ortamını hazırlayın.
  3. DNaz medya artı 3.2 mg / kollajenaz Tipi IV ml 5 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): kollajenaz-DNAse ortamı hazırlayın.
  4. Ön-serin FACS tamponu: PBS içinde seyreltilmiş% 0.5 FBS.
  5. 4 ° C'ye ön-serin santrifüj.
  6. 37 ° C'ye ısınmaya çalkalayıcı inkübatör.

Dişeti Blokları 2. İzolasyon, Diseksiyon ve Hücre İzolasyonu

  1. ARAC kurallarına göre uygun bir odasında CO 2 onları teşhir ederek fareler Euthanize.
  2. kalp ve iç organları ortaya çıkarmak için göğüs ve karın boşluğu açın. serpmek için, inferior vena kava bir kesi yapmak ve bir 27 G iğne ile 3 ml şırınga kullanarak sol karıncığın yoluyla PBS 3 ml serpmek.
  3. yukarı bakacak şekilde mide ile bir pad üzerinde vücut ve fare kafasını hareketsiz.
  4. altta yatan dokuları ve kasları açığa mandibula ve boyun bölgesini kapsayan cilt ayıran, makasla boyuna doğru dudak her komissura kesin. mandibulayı ortaya çıkarmak için alt dudak teşrih.
  5. alt ön dişlerin arasına Cut mandibula her iki tarafını ayrı ve ağız boşluğu erişmek için her tarafı hareketsiz hale getirmek.
  6. Görselleştirmek ve uzak burun boşluğundan damak teşrih.
  7. 10 bıçak kullanarak alanları incelemek ve dişeti (Şekil 1) çevreleyen maksiller ve mandibular molar alanları bulunmaktadır. Dikey kesiler sadece birinci molar ve posterior üçüncü molar ve yatay kesi de için ön yapmakDişeti sınır (doku çevreleyen diş beyaz yaka).
  8. 5 ml kollajenaz / DNaz (buz üzerinde tutmak) ile 50 ml konik tüp içinde çene ve alt çene blok yerleştirin.
  9. 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalamalı bir inkübatör içinde inkübe ve inkübasyon son 5 dakika boyunca 0.5 M EDTA, 50 ul ekle.
  10. dokular ile 50 ml tüp soğuk DNaz medya 5 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın girdap.
  11. petri üzerinde doku 4 blok aktarın ve DNaz medya 500 ul ile kaplayın. Bir neşter bıçak kullanarak ve dişeti ve diş arası alanlara bıçak işaret ederek, doku her bloğunun gingiva çıkarın.
  12. hücre süzgeç (70 mikron boyut) ile yeni bir 50 ml tüp, petri yanı sıra diseksiyonu sırasında kullanılan önceki DNaz medyadan dokuları ve medya aktarın. DNaz medya (3-5 ml) kullanılan araçların ve filtrenin tüm yıkayın.
  13. steril 3 ml şırınga pistonu kullanarak, süzgecin karşı doku püreSoğuk DNase medya (30 ila 35 ml) ile filtreleme.
  14. Soğuk DNaz medya ile hücre süzgeç yıkayın.
  15. 4 ° C'de santrifüj, 6 dakika boyunca 314 x g.
  16. supernatant atmak eksiksiz bir medya 1 ml yeniden askıya.
  17. Hücreleri saymak otomatik hücre sayacı kullanılarak (beklenen miktar>% 80 canlılığı ile 6 10 x 1,2-5 10 x 8 arasındaki hücreleri arasında olmalıdır).

Dişeti Hücrelerinin 3. stimülasyonu ve FACS Boyama

  1. Brefeldin A 1 ul / ml varlığında PMA (50 ng / ml) ve iyonomisin (2.5 ug / ml) ile tek bir hücre süspansiyonu teşvik
  2. 37 ° C de 3.5 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
  3. Spin ve 4 ° C'de PBS ve santrifüj ile yıkayın; 6 dakika 314 x g.
  4. Üreticinin talimatlarına göre bir canlılık leke kullanarak hücreleri leke.
  5. dışı belirteçleri (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ veya karınca için Lekeüreticinin talimatlarına aşağıdaki seçim ibodies).
  6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 xg'de soğuk FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler yıkanır.
  7. Yavaşça hücre pelletini bozmaya girdap.
  8. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehid hücreleri saptamak.
  9. 4 ° C'de, hücre içi sitokin 5 dakika ve leke 314 xg'de soğuk FACS tamponu, santrifüj ile hücreler yıkanır.
    1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 xg'de FACS tamponu ve santrifüj içinde seyreltilmiş, soğuk% 0.5 saponin çözeltisi ile FACS tüpler doldurun.
    2. FACS tüpler% 0.5 saponin çözeltisi 300 ul ekle, 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edilir ve daha sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 x g'de santrifüj.
    3. imalatçının talimatlarına uygun olarak hücre içi işaretleri (IL-17A ve IFNy ya da tercih edilen sitokinler) için hücrelerin lekelenmesi. 5 dakika boyunca, 4 ° C'de 314 xg% 0.5 saponin çözeltisi ve santrifüj ile hücreler yıkanır.
    4. FACS ile tekrar yıkayıntampon ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 314 x g'de santrifüjleyin.
    5. FACS tampon 300 ul hücrelerin yeniden askıya.
  10. Bir Akış sitometresindeki sonuçlarını analiz.

4. Akım Sitometri Analizi

  1. hücrelerin görselleştirmek enkaz dışlamak için ileri (FSC) ve yan dağılım (SCC) ve kapısı üzerinde analiz edilecek.
  2. yüksekliği (FSC-H) parametreleri vs ileri dağılım alanı (FSC-A) Tek hücreleri seçin.
  3. Daha fazla analiz (Şekil 2A ve 2C) için hematopoietik işaretleyici CD45 + için canlı (geçerlilik boyaması ile gösterildiği gibi) ve pozitif olan kapı hücreleri.
  4. Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, özel markörlerin analizi devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(- / - Şekil 2A - C LFA vs WT) protokolünün uygulanmasını göstermek için, bağışıklık hücresi ile ve periodontitis olmayan farelerin dişetinde ağı inceleyen temsili sonuçlar göstermektedir. Temsilcisi FACS araziler dişeti (Şekil 2A, 2C) canlı CD45 + hematopoetik hücreler gösterir. Bu protokol ile bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve işleme ex vivo uyarılması ve sitokin salgı desen karakteri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut teknik, başarılı bir şekilde uygun bir (tek bir fare), bağışıklık hücrelerinin büyük sayısını verir, sadece fenotipik karakterizasyon için değil, aynı zamanda fonksiyonel çalışmalar için ex vivo. Başka bir grup daha önce izole ve fare dişeti bağışıklık hücreleri karakterize bir protokol yayınlamıştır ve hayvan modellerinde 9 periodontitis çalışmada flow sitometri çok renkli kullanarak değerini tanıştırmıştı. Önemli sorun giderme Bu protokolde anahtar değişiklik aşağıdaki dişeti yaka alanları v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar kısmen NIDCR'nin (NMM) intramural programı tarafından finanse edildi ve Wellcome Trust Stepping Stones Bursu (097820 / Z / 11 / B'den JEK'ye) ve Manchester İşbirlikçi İnflamasyon Araştırma Merkezi bursu (JEK'ye) tarafından desteklendi. Yazarlar, el yazmasını eleştirel bir şekilde gözden geçirdiği için Teresa Wild'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnce MakasGüzel bilim aletleri14058-11
Neşter Sapı #3Güzel bilim aletleri10003-12
Neşter Bıçakları #10İnce bilim aletleri10010-00Steril
Kıymık ForsepsIntegra Miltex6-304
Normal eğimli iğneler BD Medical30510927 G, 12,7 mm uzunluk
Monoject şırıngalarCovidien8881513934Luer-lock uç, 3 ml
PBS, pH 7.4Yaşam Teknolojileri10010-049Kalsiyum ve Magnezyum RPMI Olmadan
1640Lonza12-167FL-glutamin
DNaz ISigma-AldrichDN25-1G
Kollajenaz tip IVGibco (Yaşam teknolojileri tarafından)17104-019
Fetal Sığır Serumuİkizler Biyo-ürünler100-106
Gentamisin 50 mg / mlKaliteli biyolojik120-098-661EA
Kalem StrepGibco (Yaşam teknolojileri tarafından)15140-122
L-GlutaminGibco (Yaşam teknolojileri tarafından)25030-081
0.5 M EDTA pH 8.0Kalite biyolojik351-027-721EA
50 ml tüplerCorning352070Polipropilen, steril
70 & mu; M Hücreli SüzgeçlerCorning352350
Petri kaplarıCorning351029Steril
5 ml FACS tüpleriCorning352052 Steril
BD GolgiPlugBD Biosciences555029Brefeldin A çözeltisi içerir
Phorbol 12-Miristat 13-Asetat (PMA)Sigma-AldrichP8139
İyonomisin Kalsiyum TuzuSigma-Aldrich13909
Quillaja kabuğundan SaponinSigma-AldrichS4521
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke KitiYaşam TeknolojileriL34957
Anti-Fare CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
Anti-Fare CD4 eFluor 450 eBioscience48-0042-82
Anti-Fare TCR beta APC eFluor 780 eBioscience47-5961-82
Anti-Fare gama delta TCR FITCeBioscience11-5711-82
Anti-Fare IL-17A APCeBioscience12-7311-82
Anti-Fare IFN-&gama; PEeBioscience11-5931-82
Anti-Fare NK1.1 PE-CY7eBioscience25-5941-82
Anti-Fare CD90.2 APC eFluor 780eBioscience47-0902-82
Anti-Fare CD3e FITCeBioscience11-0031-82
Anti-Fare CD19 FITCeBioscience11-0193-82
Anti-Fare CD11b FITCeBioscience11-0112-82
Anti-Fare CD11c FITCeBioscience11-0114-82
Anti-Fare TCR beta FITCeBioscience11-5961-82
Anti-Fare Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
Anti-Fare Ly-6C FITCBD Pharmingen553104
Sığır pankreasından içermeyen

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Gingival Immune CellsImmune Cell IsolationTissue DigestionFlow CytometryCytokine SecretionCollagenase DNaseCell StrainerEx Vivo StimulationPhenotypic CharacterizationFunctional Examination

İlgili makaleler