Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

12.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53741

⸱

3 Şubat 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Özet

Metastaz kanserle ilgili morbidite ve mortalite açısından önemli bir nedenidir. Metastaz çok aşamalı bir süreçtir ve karmaşıklığı nedeniyle, metastatik yayılması ve büyümesi yöneten tam hücresel ve moleküler süreçler hala sürüncemede bulunmaktadır. Canlı görüntüleme hücreleri ve bunların mikro dinamik ve mekansal etkileşimlerin görselleştirme sağlar. Solid tümörler genellikle akciğerlere metastaz. Ancak, akciğerlerde anatomik konumu intravital görüntüleme bir sorun teşkil etmektedir. Bu protokol, tümör hücreleri ve akciğer metastazı içindeki çevreleyen stroma arasındaki dinamik etkileşimin ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit ve hızlı bir yöntemdir. Bu yöntemi kullanarak, kendi mikro-kanser hücrelerinin stromal hücreleri arasında kanser hücrelerinin hareketliliği ve etkileşimler birkaç saat gerçek zamanlı olarak görülebilir. Transgenik flüoresan raportör fareler kullanılarak, bir flüoresan hücre çizgisi, enjekte edilebilir floresan etiketlimoleküller ve / veya antikorlar, akciğer mikro birden fazla bileşenler, kan damarları ve bağışıklık hücreleri gibi, görselleştirilebilir. farklı hücre tipleri görüntü için, hızlı, dört renkli görüntü elde uzun vadeli, sürekli görüntüleme sağlar dönen bir disk konfokal mikroskop kullanılmıştır. Birden fazla pozisyonları ve odak düzlemleri boyunca toplanan görüntülerden derlenen Time-lapse film en az 4 saat süreyle canlı metastatik ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri göstermektedir. Bu teknik, ayrıca, kemoterapi veya hedeflenen tedavi test etmek için de kullanılabilir. Dahası, bu yöntem, akciğer mikro-etkileyebilecek diğer akciğer ile ilgili patolojilerin çalışma için uyarlanabilir.

Giriş

Kanserin en ölümcül yönü, kansere bağlı morbidite ve mortalitenin %90'ından fazlasını oluşturan metastazdır1. Metastaz çok aşamalı bir süreçtir ve karmaşıklığı nedeniyle, metastatik yayılma ve büyümeyi yöneten kesin hücresel ve moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. Metastaz yapmak için, primer tümördeki tümör hücrelerinin komşu hücrelerinden ve bazal membrandan ayrılması, hücre dışı matriksten geçmesi, intravazat, kan veya lenfatik damarlar yoluyla seyahat etmesi, ikincil bölgede ekstravaze olması ve son olarak hayatta kalması ve ikincil tümörler oluşturması gerekir. Tümör hücrelerinin özelliklerine ek olarak, kanser hücrelerinin normal muadilleri ile birlikte bitişik stroma'yı içeren mikroçevrenin katkısı, metastatik lezyonların tohumlanması ve kurulması için çok önemlidir2.

Metastatik tohumlama ve büyümeyi incelemek için geleneksel yöntemler, dokular eksize edilir ve histoloji için kesilirken statik durumları inceler. Bu veriler, bu son derece dinamik sürecin yalnızca bir anlık görüntüsünü oluşturur. Bu çalışmalardan bazı yararlı bilgiler elde edilebilse de, tümör ve stromal hücrelerin metastatik oluşum sırasında etkileşime girdiği karmaşık süreç bu yöntemlerle yeterince değerlendirilemez. Ayrıca, uzak bölgede bir koloni kurmada önemli olan tümör veya stromal hücre göç paternleri hakkında bilgi edinmek mümkün değildir. Metastatik süreci etkili bir şekilde incelemek için, kanser hücreleri ve mikro çevreleri arasındaki çeşitli etkileşimleri sürekli ve gerçek zamanlı olarak görselleştirmek önemlidir.

Akciğer, meme, kolorektal, pankreas kanseri, melanom ve sarkom gibi solid tümörlerden kaynaklanan metastazların yaygın bir bölgesidir3. İntravital görüntüleme daha önce çeşitli primer tümör ve metastatik modellerde hücre-hücre etkileşimini incelemek için kullanılıyordu4,5. İntravital görüntüleme, akciğer kesiti görüntüleme ve ex vivo pulmoner metastaz testi dahil olmak üzere farelerde akciğer görüntüleme yöntemleriyayınlanmıştır 6-9. Fare akciğerlerinin intravital görüntülemesi, akciğerleri stabilize etmek için torasik bir emme penceresi kullanır6. Bu yöntem, akciğer mikrosirkülasyonu ve alveolar boşlukların hızlandırılmış görüntülenmesi için kullanılır. Akciğerlerin anatomik yerleşimi, intravital görüntüleme için bir zorluk teşkil eder. Akciğerlere erişmek için göğüs boşluğunun açılması gerekir, bu da negatif basınç kaybına ve akciğerlerin çökmesine neden olur. Bu yöntem sadece akciğerlerin küçük bir kısmının görüntülenmesine izin verir ve teknik olarak zorludur; Kan akışından bağımsız süreçleri inceleyen çalışmalarda gereksiz bir komplikasyon. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda solunumdan kaynaklanan kapılama hareketini de gerektirir. Bu, ya nefesler arasında görüntü toplanarak ya da görüntü elde etme sonrası analizlersırasında yapılır 10. Alternatif ex vivo akciğer kesiti görüntülemesi stabilite ve derinlik sağlar ve ayrıca akciğer parankimini immün boyama için hazırlar7. Bununla birlikte, uzun kesit alma süreci, hayvan kurban etme zamanı ile görüntüleme seansının başlangıcı arasında büyük bir gecikmeye yol açar. Ayrıca, bir fare akciğerinin kesitlere ayrılması işlemi önemli miktarda hücre ölümüne8 neden olur, böylece görüntüleme örneklerinin kalitesine ve miktarına müdahale eder ve belki de tümör-stroma etkileşimlerini gereksiz yere değiştirir. İntravital görüntüleme ve akciğer kesiti görüntüleme yöntemleri arasında teknik olarak köprü kurmak ve iki tekniğin avantajlarından yararlanmak için, ex vivo akciğer görüntüleme için nispeten hızlı ve kolay bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, kesitsiz tüm akciğer loblarının görüntülenmesi ile elde edildi. Bu yöntemi kullanarak, kanser hücrelerinin hareketliliği ve kanser hücreleri ile mikro çevrelerindeki stromal hücreler arasındaki etkileşimler birkaç saat boyunca gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

açıklanan tüm işlemler yerel Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından önceden onayı dahil olmak üzere, omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır.

Ex Akciğer Metastazlarının 1. Nesil Canlı Görüntüleme vivo (transgenik veya Kuyruk Ven Enjeksiyon)

Not: Akciğer metastazı genetik olarak fare modelleri kullanılarak veya kanser hücrelerinin intravenöz (IV) enjeksiyonu vasıtasıyla üretilebilir.

  1. Örneğin, bir transgenik raportör fare içine genetik olarak tümörlü fare modeli geçerek görüntüleme için akciğer metastazı oluşturmak, ACTB-ECFP olarak meme kanseri fare modeli, fare meme tümör virüsü uzun terminal tekrarı-polioma orta T antijenini (MMTV PyMT) 11 arası fare modeli 12.
    NOT: ACTB-ECFP modeli β-Yasası altında mavi floresan protein (ECFP) geliştirilmiş ifade ederpromoteri tüm hücreler mavi CFP kanal floresan şekilde. Bununla birlikte, kanser hücreleri tarafından bugüne kadar en önemli ve mikroskop altında ECFP-pozitif hücrelerin bir yığın olarak görünür. MMTV PyMT fare modeli meme tümör büyümesi, özellikle akciğerlere, çevresine kanser hücrelerinin yayılması ile ilişkili olduğu ilerleyici hastalık, geliştirir. FVB / n arka plan üzerinde MMTV PyMT farelerde, mikrometastazlar yaşı 10-11 hafta civarında görülebilir. Genellikle 13 yaş civarında 14 hafta makrometastazı bu ilerleme.
    VEYA
  2. birincil hücreler veya singeneik hücre hatları kullanılarak deneysel metastaz oluşturur. Iv enjeksiyonu 14 ve ardından nitro manipüle primer tümör hücreleri veya hücre çizgileri (örn., Transdüksiyon) kullanım.
    1. Kısaca, bu protokolde, flüoresan raportör farelerde (ACTB-ECFP) ya da vahşi tipli farelere yeşil floresan protein (GFP) -expressing (+) MMTV PyMT hücre hattı enjekte edilir. Daha sonra,yeşil, GFP kanalı kullanılarak VO-PyMT hücreleri 15 olarak anılacaktır bu hücreleri görselleştirmek.
      NOT: Orijinal VO-PyMT hücre hattı Nashville, TN Vanderbilt Ortopedi de elde edilmiştir. VO Vanderbilt Ortopedi duruyor.
    2. , Enjeksiyondan sonra birkaç saat hemen ve yukarı kanser hücresi ekstravazasyonu gözlemlemek (200 ul) 10 6 hücre enjeksiyonu takiben; enjeksiyondan sonra 1-3 hafta arasında mikrometastazlar gözlemlemek ve enjeksiyon 15 sonra makrometastazı 3 hafta algılar.
      Not: daha az hücre metastatik büyümeye enjeksiyondan süresini uzatmak için enjekte edilebilir.

Metastatik mikroçevrede İlgi Bileşenlerinin 2. Etiketleme (Transgenik ve / veya Enjeksiyon)

Not: Etiketleme Transgenik farelerin ve / veya çeşitli enjekte ile elde edilebilir. Çeşitli hücre tiplerinin etiketlenmesi için farklı floresan renkler kullanmak emin olun.

  1. transgenik fareler kullanılarak metastatik mikroçevresinin etiket bileşenleri. Daha önce de belirtildiği fare tümör modeli çapraz ilgi stromal hücreler ECFP olmayan bir floresan protein, örneğin., C-fms EGFP etiketli olduğu bir transjenik fare modeli (örneğin., MMTV PyMT ACTB-ECFP x) 4,16.
    Not: CFP kanal kanser hücrelerinin görselleştirme ek olarak, bu GFP kanalı 4 miyeloid hücrelerin görselleştirme sağlar.
    VE / VEYA
  2. Transgenik floresan muhabiri fareler ya da (floresan olmayan) wild tip farelere enjekte edilebilir kullanarak metastatik mikroçevresinin çeşitli bileşenleri etiketleyin.
    Not: Çeşitli bileşikler, metastatik mikro, örneğin, bir AF647-konjuge Gr-1 antikoru nötrofil etiketlemek için kullanılan ve bazı monositler 13 ve farklı moleküler ağırlık dekstranlar kullanılır çeşitli bileşenleri etiketlemek için enjekte edilebilirAkciğer kılcal etiketlemek için. Bu enjektabl hazırlanması için adım 4'e bakın.

Diseksiyon önce Malzemelerin 3. Hazırlanması

  1. % 2 agaroz
    1. Agaroz 0.2 g tartılır ve 10 mi 1 x PBS ilave edin. agaroz çözmek için çözüm ısıtın. Agaroz oda sıcaklığında katılaşmaya, yani enflasyonu için kullanılana kadar bir 37 ° C su banyosu içinde muhafaza edecektir.
  2. CO2 ve sıcaklık kontrol
    1. Nemlendirme odasında GKD 2 O edin. gerektiğinde doldurun. Sıcaklık sahne plaka tutucu (iklim odası) içine yapılandırma plakasını yerleştirin. CO 2 kontrolör açın ve% 5 CO 2 olarak ayarlayın. hava akış oranı 0.4 Nl / dak ayarlanmış olduğundan emin olun.
    2. Hava ve CO 2 vanalarını açın. Sıcaklık kontrolörü açın. klima kabini sıcaklığı ve kapak 37 ° C'ye ayarlanmış olduğundan emin olun.
    3. CO 2 metrelik hava basıncını serbest bırakın. CO 2 artan edin, equilibration 30 dakika kadar sürebilir.
  3. İplik Disk konfokal mikroskop
    Not: Mikroskop kurulumu ayrıntıları daha önce 4,17 tarif edilmiştir.
    1. lazerler (488 nm uyarma ve solid-state 405 nm, 561 nm ve 640 nm lazerler için argon laser) açın. mikroskop, kamera, dönen disk kontrol ünitesi, AOTF, lazer kontrol ünitesi ve kamera kontrolörü açın.
    2. , Mikroskop deklanşör açın mikroskop çalıştıran bilgisayarı açın ve yazılımı açın.
  4. araçları ve diseksiyon platformunun hazırlanması.
    1. Sıcak boncuk sterilizatör açın ve 250 ° C ulaşmasını sağlar. su ve sabun ile cerrahi makas ve forseps temiz 2 çift. en az 30 saniye boyunca araçları sterilize edin. araçlar soğumasını bekleyin. diseksiyon platformu olarak bir polistiren kapağı kullanın. laboratuar nemlendiriciye bir parça ile örtün.

Enjeksiyonlar 4. hazırlanması

Not: yarı ömrü ve tercih edilen cevaba bağlı olarak, enjekte floresan etiketli antikorlar ve / veya floresan moleküller, ya hayvan kurban veya daha önce gün sonrası arasında, bir çift hemen önce.

  1. Görüntü Gr1 pozitif nötrofiller ve monositler için, başlık altında steril PBS 100 ul içinde hazır AF647-konjuge Gr-1 antikoru 7 ul (1 mg / ml) olan bir şırınga hazırlar. şırınga 27 G ½ iğne yerleştirin.
  2. Görüntü akciğer kılcallarına için, 100 ya da 70 kD rodamin kaplı dekstran (4 mg / mL) ul ya da 10 kD AF647-konjüge dekstran (4 mg / ml) ile, bir ikinci ve üçüncü şırınga hazırlar. şırınga üzerinde 27 G ½ iğne yerleştirin.
  3. Önceki akciğerlerin eksizyona AF647-konjuge antikor çözüm iv 5 saat enjekte edilir.
  4. iv hemen önce akciğerlerin eksizyona biri veya her ikisi dekstran çözümler enjekte edilir.

Ex Akciğerler 5. hazırlanması Canlı Görüntüleme vivo

NOT: akciğerler içinde bağışıklık hücrelerinin gereksiz sorunları önlemek için mümkün olduğunca steril ve dikkatli çalışmak için deneyin.

  1. IACUC onaylı protokol, hayvan, örn. Izin bir anestetik öldürücü bir dozu ile, fare karın içinden (ip) enjekte,% 2.5 Avertin 1 mi. nefes durdurmak ve ağrılı uyarılara (arka pençe tutam) tamamen sigara duyarlı olmaya fare için bekleyin.
    Not: servikal dislokasyon ve karbondioksit ötanazi zarar verici akciğer hücre canlılığı etkileyebilir kaçınılmalıdır.
  2. Bir diseksiyon gemide fare hareketsiz ve% 70 etanol ile fare sterilize edin.
  3. İlk periton aracılığıyla benzer bir kesi ardından deri yoluyla enine epigastrik kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. , Dikey konumda diseksiyon kurulu tutun ve inen aorta kesip değil göğüs boşluğunda karın kan havuzları aşağı böylece.
  4. Svakumu boşaltmak için diyafram küçük bir açıklık nip. diyaframı tüketim ve akciğerlere görsel erişmek için 10 ve 12. kaburga boyunca kesilir.
  5. göğüs kafesi üzerinden trakea cilt kesilmiş ama sağlam göğüs kafesi terk cerrahi makas kullanın. göğüs kafesi cilt ayırmak. Trakea kendisi (Şekil 1A) zarar vermemek için dikkatli olmak, çevredeki bağ dokusu kaldırarak trakea Açığa.
  6. Küçük bir açıklık mümkündür (Şekil 1B) halinde gırtlak yakın olarak kıkırdak halkalarının maruz trakea paralel çapı yaklaşık 1 mm, Kırpılmış. trakea yoluyla tamamen kesmek için dikkatli olun.
  7. 20 G iğne alın ve yavaşça herhangi bir karşı kuvvet (Şekil 1D) olmadan trakea içine iğne 4-5 mm yerleştirin. Iğne ucu trakea (Şekil 1C) ile görünür olmalıdır. trakea iğne stabilize etmek forseps kullanabilir. Alternatif olarak, bir dikiş aro bağlı olabiliriğneyi yerinde tutmak için trakea und.
    NOT: Çok derin ekleyerek, karina travma olabilir ya da akciğerlerin sadece bir tarafı şişirilmiş olabilir.
  8. (Sabit sıcaklık banyosuna doğrudan alınan) 37 ° C'de% 2 düşük erime sıcaklıklı agaroz 400 ul olan bir şırınga doldurun. diseksiyon tahtası ayakta emin olun ve yavaş yavaş akciğerlere iğneden sıcak agaroz aşılamak, akciğerleri şişirmek için ~ 400 ul kullanın.
    NOT: göğüs kafesi içinde şişirme akciğerleri izleyin. Yarılmasına gibi akciğer aşırı şişirmek etmeyin.
  9. Akciğerler şişirilmiş sonra, şırınga ayırmak ve sızıntı herhangi bir agaroz önlemek için trakea içine iğne tutmak, göğüs kafesinin ~ ⅔ dolum.
  10. ayarlamak ve katılaşmaya akciğer içindeki agaroz izin vermek için şişirilmiş akciğer boyunca 20 ° C PBS yaklaşık 50 ml dökün. Yavaş yavaş önlemek için forseps ile trakea iğneyi çıkarın ve kapatın olmayan katılaşmış agaroz sızmasını.
  11. Bir sternotomi gerçekleştirerek akciğerleri ortaya çıkarmak ve daha sonra akciğerleri tüketim. Tamamen trakea yoluyla kesim sırasında akciğerlerin eksizyonu için trakea üzerinde tutmak. Yavaşça akciğerler fare (Şekil 1E) ayrılana kadar göğüs boşluğunun dışında akciğerleri çekerken bağ dokusu ve yemek borusu kesip, trakea yukarı çekin.
  12. Aşırı kan yıkayın sıcak RPMI-1640 akciğerleri daldırın ve yavaşça hilus (Şekil 1F) de loblar ana kök bronşları kesmek için makas ve forseps kullanarak lobları ayırın.
  13. 24 oyuklu görüntüleme plaka (Şekil 1G) içindeki bir oyuk olarak, görüntüleme yüzeyinin en üst düzeye çıkarmak için aşağı düz yüzey ile, loblar yerleştirin. lob üstünde 37 ° C RPMI-1640 içinde 100 ul ekle. Kayan engellemek için lob üstüne birkaç 15 mm dairesel mikroskop kapak slaytlar yerleştirin.
  14. EVAP gelen RPMI-1640 medya önlemek için çevredeki kuyulara ılık PBS dökünparfüm içeren. Dengelenmiş klima kabini içine 24 oyuklu plaka ekleme ve hava ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de, akciğer lobları korumak. konfokal mikroskop sahnede iklim odasına yerleştirin.
    Not: diğer gaz karışımları (örneğin, N2 içinde% 5 O2,% 5 CO2 hipoksi / düşük oksijen koşullarında hücre davranışını incelemek üzere) da düşünülebilir.

figure-protocol-1
Canlı görüntüleme için akciğerlerin hazırlanması için Şekil 1. Protokol. Fare hazırlandıktan sonra trakea (A) Poz. Kıkırdak halkalar maruz trakea paralel olarak yapılan (B) Küçük kelepir. (C) 20 G iğne trakea içine 4-5 mm takılı. (D) agaroz akciğerlere 400 ul% 2 düşük erime sıcaklığı instilasyon. (E) enflamasyonATED akciğerler fare ayrılır. (F) lobları enflasyon sonra ayrılmış. (G) 24-iyi görüntüleme plaka iyi yerleştirilmiş lobları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

6. Toplama ve Görüntüler Analizi

NOT: Görüntüler çeşitli yazılım programları tarafından desteklenen bir disk konfokal mikroskoplar iplik çeşitli elde edilebilir. Imaris film düzenleme ve analizi için kullanılır ise, bu protokolde, piyasada bulunan dönen disk konfokal mikroskop ile bir ısmarlama dönen bir disk konfokal mikroskop ya da Zen ile ya μManager, görüntü elde etmek için kullanılır.

  1. μManager kullanarak görüntüleri elde edin. ΜManager yazılımını kullanarak görüntüleri edinimi için adım protokolü tarafından ayrıntılı bir adım daha önce 18 tarif edilmiştir.
    VEYA
  2. görüntüler eldeBöyle Zen olarak kullanarak görüntü analiz yazılımı (Şekil S1 bakınız).
    1. 'Bulun' sekmesine tıklayın ve 'Işık Yolu' aracı (Şekil S1A, kırmızı kutu) (10x veya 20x) objektif seçin. Mercek (Şekil S1A, mavi kutu) üzerinden CFP kanalına bakmak için - 'DAPI Gözler' Daha sonra, üzerine tıklayın. El ile mikroskop kullanılarak örnek yerelleştirilmesine. dokuda Off'after tüm görüş alanının merkezi 'seçeneğini tıklayın.
    2. görüntü elde etmek için tüm parametrelerini ayarlamak için 'Acquisition' sekmesine tıklayın.
    3. 'Kanallar' aracında, '+' tuşuna (Şekil S1B, kırmızı kutu) tıklayın. Bir pop-up menüsü görünür ve 'Boya Veritabanı' (Şekil S1 B) 'de numunede mevcut boya (ler) arayın. boya seçin ve 'Ekle' düğmesine tıklayın.
      NOT: Program tüm filtreleri optimize edilmesi koyacaktır. Bir boya silinebilirseçerek o çöp tenekesi tuşuna (Şekil S1B, sarı kutu) tıklayarak izledi.
    4. 'Edinim Modu' menüsünde, 5x5 'diyotları' olarak ayarlayın. seçmek için kanal menüsünde ECFP üzerine çift tıklayın. Örnek görüntü elde etmek için parametreleri kurarken ağartılmış olmayacak şekilde% 20 lazer gücünü azaltın.
    5. 'Deney Yöneticisi' bölümünde 'Karo Seramik'in kutusunu işaretleyin ve fayans aracı' Çok Boyutlu Toplama 'aracını grubunda (Şekil S1C) görünür. kameradan canlı görüntüyü görüntülemek için 'Gelişmiş Kurulum' düğmesine tıklayın. deney 4 ila 6 pozisyon eklemek için 'Positions' bölümünde 'Ekle' butonuna tıklayın. Bir konumu silmek için, o konumu seçin ve çöp kutusu düğmesine tıklayın.
    6. 'Edinim Parametre' aracını grubunda 'Absolut' Odak Stratejisi 'aracını açın ve Seçeneke açılan listeden Z-pozisyon 'düzeltildi.
    7. 'Deney Yöneticisi' bölümünde ve Z-Stack aracında Z-Yığın kutusunu işaretleyin 'Çok Boyutlu Acquisition' aracı grubunun (Şekil S1D) görünür. Pozisyonları 'bölümünde ve basın' Canlı 'pozisyonların birinde çift tıklayın. El ile ilk set ve görüntüleme alanının son konumunu ayarlamak. 4 mikron aralıklarla ayarlayın.
      NOT: Program seçilen aralık ve aralık için dilim sayısını belirleyecektir. İdeal olarak, 5-7 dilim yeterli görselleştirme ve hızlı görüntü alımı sağlamak için uygundur.
    8. 'Deney Yöneticisi' bölümünde 'Zaman Serisi' kutusunu işaretleyin. Set istenen 'Süre' ve 'Çok Boyutlu Toplama' aracını grubunda (Şekil S1E) ortaya 'Zaman Serisi' aracında 'Interval'ın' kez.
    9. 'Zinin içindeyon Modu 2x2 için 'diyotları' menüsünden, set '. kanallar menüsünde bir fluorofor çift tıklatın seçin ve% 100 lazer gücünü artırmak için. Basın 'Canlı' ve 'Pozlama Saati' ayarlayın. Her fluorofor için bu işlemi tekrarlayın.
    10. 'Enable Auto Kaydet' kutusunu işaretleyin. dosyanın adını bir klasör ve türünü seçin. Tüm edinilen görüntüler otomatik olarak bu klasöre kaydedilecektir.
    11. görüntü alımı başlatmak için 'Deney Yöneticisi' bölümünde 'Başlat Deney' üzerine tıklayın.
  3. Görüntü alındıktan sonra, Imaris yazılımında ham verileri derlemek. Dosyaları .ims görüntüleri dönüştürmek ve ayarlamalar yapılabilir. Dosyaların dönüştürülmesi, ayarlamalar yapmak ve Imaris kullanarak tasarruf filmler için adım protokolü tarafından ayrıntılı bir adım daha önce 18 tarif edilmiştir.
  4. Filmi kaydederken, ikinci (fps) başına 5 kare 'Frame Rate' set.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

eğirme disk konfokal mikroskopi, çeşitli fare modeli sistemleri ve enjektabl kullanarak, metastatik mikroçevresinin görüntülendi ve zamanla izlenebilir. Bir MMTV PyMT kullanımı; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP üçlü transgenik fare modeli, farklı hücresel bileşenleri floresan (Şekil 2A, Film 1) etiketlenir. Akciğer parankimi tipik yapısı, tüm hücrelerin β-aktin organizatörü altında ECFP ifade beri CFP kanal görülebilir. Bu organize akciğer yapısı içindeki hücrelerin bir toplu olarak görün...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda metastaz taşıyan fare modellerinde akciğer metastazı ex vivo canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntemi tarif etmektedir. Bu görüntüleme protokol akciğer mikroçevresinin içinde dinamik ve mekansal tümör hücre-stroma etkileşimleri doğrudan görselleştirme sağlar. En az 4 saat akciğer metastazı güvenilir bir görüntüleme sağlayan bir kolay ve hızlı bir yöntemdir. Bu deneylerden elde edilen filmler, hücre motilitesi ve hücresel etkileşimler gibi dinamik işlemleri izlemek için de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Tüm hayvan deneyleri, IACUC onaylı protokoller UCSF'ye uygun olarak gerçekleştirildi.

Teşekkürler

Teknik yardımı için Nguyen H. Nguyen'e ve Zeiss Cell Observer spinning-disk konfokal mikroskobu ile ilgili desteği için Audrey O'Neill'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı doktora sonrası bursu (W81XWH-11-01-0139) ve Weizmann Bilim Enstitüsü-Bilimde Kadınları İlerletmek için Ulusal Doktora Sonrası Ödül Programı (VP'ye) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MMTV-PyMT/FVB fareleriJackson Laboratuvarı2374Dişi fareler
ACTB-ECFP/FVBfareleri UCSF Werb laboratuvarıDişi fareler
c-fms-EGFP/FVB fareleriUCSF Werb laboratuvarıDişi fareler
FVB fareleriJackson Laboratuvarı1800Dişi fareler
GFP+ VO-PyMT hücreleriUCSF Werb laboratuvarı
70.000 kDa Dekstran, rodamin konjugeİnvitrojenD18181 x PBS'de  4mg / ml'ye seyreltin ve -20 &°C'de saklayın. Hayvan başına 0.4 mg kullanın. 
10.000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 konjugeInvitrogenD229141 x PBS'de   4mg / ml'ye seyreltin ve -20 &°C'de saklayın. Hayvan başına 0.4 mg kullanın. 
Anti-fare Gr-1 antikoru Alexa Fluor 647UCSF Monoklonal antikor çekirdeğiStok 1mg / ml. Hayvan başına 7 ug kullanın.
AnestezikAnestezi, anestezi ve / veya ötenazi için kullanılır
1X PBSUCSF hücre kültürü tesisi
PBS, USP steril ve nbsp;Amresco INCK813-500MLIV enjeksiyon için ultra saf sınıf
Strafor platformuDiseksiyon tahtası olarak kullanılacak
İnce makas keskin Güzel Bilim Araçları14060-11
ForsepsRoboz Cerrahi MağazaRS-5135
Sıcak boncuk sterilizatörüGüzel Bilim Araçları18000-45Kullanmadan 30 dakika önce AÇIN
HavaUCSF
OksijenUCSF
KarbondioksitUCSF
İğnesiz 1 mL şırınga BD309659
27 G x 1/2 iğne   BD305109i.v. enjeksiyon için
20 G x 1 iğne, kısa eğim   BD305178
Düşük erime sıcaklığında agaroz Lonza5011110 ml çözelti yapmak için, 0.2 g agarozu tartın, 10 ml 1 x PBS'ye ekleyin ve çözünmesi için ısıtın. Agaroz oda sıcaklığında katılaşacaktır, bu nedenle 37 ° C'de tutun; Şişirme için kullanılana kadar C su banyosu.
RPMI-1640 fenol kırmızısı içermeyen ortamYaşam Teknolojileri11835-030
24 kuyulu Görüntüleme plakası E& K scientificEK-42892
Cam kapaklı kızaklar, 15 mm Fisher Scientific22-031-144
Dijital CO2 ve sıcaklık kontrolörüOkolabDGTCO2BXhttp://www.oko-lab.com
İklim odasıOkolabhttp://www.oko-lab.com
Cell Observer eğirme diski konfokal mikroskopZeiss
Zen yazılımıZeiss
Ters mikroskopCarl Zeiss IncZeiss Axiovert 200M
ICCD kameraStanford PhotonicsXR-Mega-10EX S-30
Dönen disk konfokal tarama kafasıYokogawa CorporationCSU-10b
ImarisBitplane
mManagerVale lab, UCSFAçık kaynaklı yazılım
IACUC tarafından onaylanan

Kaynaklar

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tümör Stroma EtkileşimleriDönen Disk Konfokal MikroskopiFloresan Raporlayıcı FarelerZaman Atlamalı GörüntülemeKanser Hücresi Motilitesiİmmün Hücre EtkileşimleriAgaroz Akciğer ŞişirmeMikroçevre Görselleştirme
Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.