Yöntem makalesi

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

DOI:

10.3791/53747

⸱

19 Şubat 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hücrelerin hızlı çoğalması, gen dokuya özgü sentezleme ve sinyal ağlar ortaya tüm omurgalıların, erken dönemde embriyo gelişimi karakterize eder. hatta tek hücrelerin içinde - - kinetik ve sinyallerin yeri gelişmekte olan embriyonun önemli gelişimsel genlerin belirlenmesi tamamlar. Immün teknikleri primer kirpikler kadar küçük yapılarda, hücre içi ve bütün hayvan sinyallerinin kinetiklerini belirlemek için gösterilmiştir ki açıklanmaktadır. bir lazer tarama konfokal bileşik mikroskop kullanılarak sabitleme, görüntüleme ve işleme görüntüler için teknikler kadar az 36 olarak saat içinde tamamlanabilir.

Zebra balığı (Danio rerio) ekonomik ve insan hastalığı ile ilgili bir omurgalı türlerinde çalışmalar yapmak istiyoruz araştırmacılar için bir arzu organizmadır. Genetik tırnakları veya knockdowns gerçek protein ürününün kaybı ile teyit edilmesi gerekir. protein kaybı Böyle onayBurada tarif edilen teknikler kullanılarak elde edilebilir. sinyal yolları içine ipuçları da çeviri sonrası fosforilasyon ile modifiye edilmiş protein ile reaktif olan antikorlar kullanılarak deşifre edilebilir. Korunması ve bir epitopun fosforile durumunu optimize bu belirleme için kritik öneme sahiptir ve bu protokol ile gerçekleştirilir.

Bu çalışma geliştirme ve ilk 72 saat boyunca embriyolar düzeltmek için teknikler anlatılmaktadır Kupffer en veziküllü (KV) 'de cilia ile ilgili epitopların çeşitli böbrek ve iç kulak co-lokalize. Bu teknikler diseksiyon gerekmez, basit ve zaman görece kısa bir süre içinde tamamlanabilir. tek bir görüntü içine konfokal görüntü yığınlarının Projelendirme bu verileri sunma yararlı bir araçtır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan teknikler, döllenme, gastrulasyon, somitogenez ve gövde, göz, beyin ve organ oluşumu dahil olmak üzere erken gelişim sırasında meydana gelen olaylar sırasında Ca2+ sinyallerinin aşağı akış hedeflerini tanımlamaya çalışan çalışmaların sonucudur. 1-3 Embriyonik Ca2 + sinyallemesinin orijinal keşifleri, aequorin4 ve fura-2 gibi doğal ve mühendislik Ca2 + göstergelerinin kullanımına bağlıydı. 5 Mevcut teknolojiyle bile, Ca2+ 'nın geçici yükselmelerinin tespiti, hantal analitik araçlar gerektirir ve bu tür Ca2 + sinyallerinin hedeflerini ortaya çıkarmaz.

Bu laboratuvar, merkezi sinir sisteminde zenginleştirilmiş ve başlangıçta uzun vadeli potansiyel düzenleyici olarak tanımlanan bir enzim olan CaMK-II olarak bilinen Ca2+/kalmoduline bağımlı (çok işlevli) protein kinaz aracılığıyla hareket eden Ca2+ sinyallerini araştırır. 6 CaMK-II beyne özgü değildir, omurgasızlar da dahil olmak üzere hayvanlar alemindeki türlerin tüm yaşam süresi ve bedenleri boyunca yaygın olarak ifade edilir ve yüksek oranda korunur. 7,8 CaMK-II, Thr287'de otofosforile olma kabiliyeti nedeniyle Ca2+ seviyeleri azaldıktan sonra bile kendi aktivitesini sürdürme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Bu otofosforile edilmiş durumda, CaMK-II, fosforillenene kadar Ca2+/CaM'den bağımsız bir şekilde aktif kalır. 6 Bu nedenle, fosforile CaMK-II'nin (Thr287) lokalizasyonu, doğal, ilgili Ca2+ yükselmelerinin meydana geldiği hücreleri tanımlayabilir.

Otofosforile (P-Thr287) memeli CaMK-II'ye karşı bir antikor iyi karakterize edilmiştir ve başlangıçta beyin dokusunda aktive edilmiş CaMK-II'yi lokalize etmek için kullanılmıştır. 9 Zebra balığı (Danio rerio) yedi CaMK-II geninesahiptir 10,11 ve protein ürünleri bu bölgede bir dizi MHRQE[pT287]VECLK içerir. 10,11 Bu dizi, bu tavşan poliklonal antikorunu oluşturmak için kullanılan fosfopeptit antijenine çok benzer (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) ve bu nedenle bu antikorun zebra balığı CaMK-II ile çapraz reaksiyona girmesi tam bir sürpriz değildi. Bu laboratuvar, bu antikorun otofosforilasyon ve Ca2+ / CaM'den bağımsız aktivite ile orantılı olarak zebra balığı CaMK-II ile reaksiyona girdiğini gösterdi. 12 Ek pan-spesifik CaMK-II antikorlarının da zebra balığı CaMK-II ile çapraz reaksiyona girdiği gösterilmiştir. 13

Bu antikor, zebra balığı CaMK-II'nin, sol / sağ asimetrinin kurulması için gerekli olan kirpikli organ olan zebra balığı Kupffer'in Vezikülünün (KV) bir tarafındaki hücrelerde tercihen aktive olduğunu göstermek için kullanılmıştır. 12 Bu antikor, CaMK-II'nin, organ pozisyonunun belirlendiği aynı gelişim aşaması sırasında KV'nin sol tarafındaki dört bitişik hücrede geçici olarak aktive olduğunu göstermek için kullanıldı. 12 Kupffer Vezikülüne (KV) ek olarak, otofosforile (PT287) ayrıca böbrek, nöromastlar ve iç kulak dahil olmak üzere diğer siliyer dokulardaki belirli hücre içi bölgelerde de bulunuyordu. 12,13 Zebra balığı böbreğinde, P-T287-CaMK-II, kirpikli duktal hücrelerin apikal sınırı boyunca ve montajlarını etkilediği kloakal kirpikler içinde zenginleştirilir. 13 Son olarak, gelişmekte olan iç kulakta, PT287-CaMK-II, kirpiklerin tabanında yoğun bir şekilde yoğunlaşır ve Delta-Çentik sinyal yolu yoluyla hücre farklılaşmasını etkiler. 14 Özetle, aktive edilmiş CaMK-II'nin tespiti, hücre içi Ca2+ salınımının yerlerini tam olarak belirlemiş ve potansiyel yeni sinyal yollarını aydınlatmıştır.

Bu keşifler tamamen aktive edilmiş (P-T 287-otofosforillenmiş) CaMK-II'yi lokalize etmek için hassas ve doğru bir yöntem geliştirmeye bağlıydı. Zebra balığı KV, böbrek ve iç kulağı düzeltme ve immün boyama yöntemleri açıklanmaktadır. Bu tekniğin sınırlamaları da açıklanmıştır. Bu teknikler, erken omurgalı gelişimi sırasında sadece fosfo-epitopların değil, herhangi bir epitopun iki floresan kanalında yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek isteyen herhangi bir araştırmacı için yararlı olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol zebrabalıkları prosedürler Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Reaktiflerin 1. Hazırlık

  1. % 4 PFA / PBS ile yıkandı. davlumbaz paraformaldehit 8 g (PFA) tartılır. Hala davlumbaz, ~ 80 ml ​​50 ° C, karıştırma ve ısıtma ile damıtılmış H2O kuru PFA çözülür ise. PFA tamamen çözülene ve çözelti açıklık kadar taze 1 N NaOH 10 damla - karıştırılırken, 3 ekleyin. Ateşten ve 100 ml 2x fosfat tamponlu tuz (PBS) ilave edin. Damıtılmış H2O 200 ml hacim getirmek Oda sıcaklığına soğutun ve kullanımdan önce 7.4 pH teyit etmektedir. 4 ° C de karanlıkta deposu ancak bir hafta içinde kullanın.
  2. herhangi bir ek olmadan% 100 metanol kullanın. herhangi bir ek olmadan% 95 etanol kullanın.
  3. Fosfat tamponlu Tween (PBT) hazırlayın. % 0.1 Tween-20 ile fosfat tamponlu tuz (PBS) Supplement. 0 ekleyin.PBS 1X 100 ml% 20 Tween-20 stok çözeltisi 5 mi. Oda sıcaklığında saklayın.
  4. Fosfat tamponlu Triton-X (PBTx) hazırlayın. % 0.1 Triton X-100 ile PBS Supplement. PBS, 100 ml bir% 20 Triton X-100 stokunun 0.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında saklayın.
  5. % 10 NGS / PBTx hazırlayın. Normal keçi serumu (NGS) blok spesifik olmayan bağlanma siteleri. -20 ° C'de parçalar halinde saklayın NGS. Kullanmak 9 ml PBTx 1 ml ekleyin.
  6. % 50 gliserol / PBS hazırlayın. 2x PBS ve% 100 gliserol iyice eşit parçaya karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın.

2. Embriyo Sabitleme

  1. . (., Örneğin β-aktin: CAAX-GFP) Damızlık elde vahşi tip (AB ve WIK) veya transgenik doğal çiftleşmelerin aracılığıyla embriyolar. İstenirse açıklandığı gibi, yapıları veya morpholinos ile embriyolar enjekte edilir. 15,16
  2. . Embriyolar kaldırın embriyolar toplayın ve tarif edildiği gibi pigmentasyon engellemek için% 0.003 1-fenil-2-tioüre (PTU) mevcudiyetinde 28.5 ° C'de inkübe edin. 17 p>
  3. Embriyolar istenilen gelişim aşamasına, 18 ulaştığında. Fix,   , MESAB kullanılarak embriyolar anestezi mümkün olduğu kadar sistem, suyu buharlaştırmak ve 3 taze% 4 PFA / PBS ekleyin - oda sıcaklığında 4 saat. NOT: 20 saat sonra döllenme (hpf) daha az zamanlarda, dechorionation önce düzeltin. 20 hpf sonra zaman zaman, bir mikroskop altında ince nokta forseps iki çift kullanarak fiksasyon önce dechorionate.
  4. Çözümler değiştirme. Geniş bir delik pipet kullanarak embriyoların transferi, tarif edildiği gibi. Mikrosantrifüj tüpleri şapkalı 1.5 ml 17 Değişim çözümleri, sadece embriyolar santrifüj olmadan yerçekimi ile yerleşmek için izin vererek.
  5. Sonrası sabitleyici sonra 3 -. 4 saat, en az 48 saat boyunca -20 ° C'de% 100 metanol ve mağaza ile yerine, PFA / PBS kaldırmak. NOT: maksimal P-CAMK-II immünoreaktivitesinde için, bir hafta toplam metanol saklama süresini sınırlamak.
"> 3. Immün Tüm Embriyolar

  1. başlıklı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her deneysel koşul için 10 embriyo az yerleştirin ve etiketlemek.
  2. embriyolar yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve metanol atmak ve bir sonraki aşamada gösterildiği gibi, etanol ve azalan konsantrasyonlarda 0.5 ml ihtiva eden aşamalı yıkama ile rehidrate. Her adım sallanan bir 5 dk yıkama olduğunu.
  3. Kademeli bu 5 çözümleri ile rehydrate:% 66 etanol /% 33 PBTx,% 33 etanol / PBTx,% 100 PBTx,% 100 PBTx (bu PBTx ilk tekrarıdır),% 100 PBTx (bu ikinci tekrarı ise% 66 PBTx).
  4. Geçen PBTx yıkama çıkarın. 0.5 ml% 10 NGS / PBTx ekleyin. hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca inkübe edilir ve akabinde çıkarın ve solüsyonu atın.
  5. % 10 NGS / PBTx içinde seyreltilmesi birincil antikor çözüm hazırlayın. CO-immün, önce yüksek afinite antikor kullanımı. 500: Bu çalışma için, 1 seyreltilmiş fare anti-asetile tübülin monoklonal antikor ile inkübe edin. exampl içinE, 10 numune,% 10 NGS / PBTx 3 ml stok antikor çözeltisi 6 ul birleştirilir ve daha sonra, her tüpe, bu, 0.3 ml dağıtmak varsa.
  6. Tüm embriyo sokmak için her bir tüpe seyreltilmiş birincil antikor 0.5 ml - 0.2 ekleyin. Oda sıcaklığında nazik sallanan O / N ile kuluçkaya yatmaktadır.
  7. Sabah, kaldırmak ve antikor çözüm atın. Fazla birincil antikor yıkayacak 0.5 ml% 2 NGS / PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın.
  8. tepe ışıkları Dim ve her bir durum, en azından 0.5 ml içerir, böylece% 10 NGS / PBTx uygun floresan-konjuge sekonder antikor seyreltin. : 500 oranında seyreltilmiş fare anti-asetillenmiş tübülin birincil antikor ile, 1 yeşil fluoresan boya keçi anti-fare IgG kullanın.
  9. yumuşak karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanarak 4 saat sekonder antikoru inkübe edin. silik ışıkları altında ve karanlık bir kapta inkübe veya alüminyum folyo ile sararak numuneler süreç, şu andan itibaren.
  10. İnkübasyonun sonunda, kaldırma ve ikincil antikor solüsyonu atın. 0.5 ml% 2 NGS / PBTx yıkamak ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın.
  11. CO-immün, önce birincil antikor daha farklı bir türden gelen ikinci birincil antikor elde edilir. Bu çalışmalarda, kırmızı fluoresan boya-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor tavşan anti-fosfo CAMK-II antikoru izleyin.
  12. tavşan anti-fosfo CAMK-II antikoru 01:20 sulandırmak. Embriyoların her bir tüp için, daha sonra, 0.3 ml% 10 NGS / PBTx askıya hazır antikor çözeltisi 15 ul ekle.
  13. Embriyolar dalmış ve ışıkları sönük olduğundan emin olun. karanlıkta oda sıcaklığında hafif sallanan O / N ile kuluçkaya yatmaktadır.
  14. loş ışıklar altında Sabah, kaldırmak ve antikor çözüm atın. 0.5 ml% 2 NGS / PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın.
  15. loş havai ışıkları tutmak ve uygun floresan konjugat yeterince sulandırmakkapı ikincil antikor, böylece her koşul en az 0.5 ml içerir. 500,% 10 NGS / PBTx: Bu çalışmada, kırmızı fluoresan boya-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor (kırmızı kanal) 1 seyreltin.
  16. yumuşak karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanarak 4 saat, ikinci ikincil antikor inkübe edin.
  17. Bu inkübasyon ve loş ışıkları altında sonunda, kaldırmak ve ikincil antikor çözüm atın. 0.5 mi PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın. Mağaza PBTx ya da% 50 gliserol / PBS ya görüntüleme işlemi bağlı olarak değişir.

4. Konfokal Görüntüleme ve İşleme

  1. Dağı görüntüleme için embriyolar. Bir bardak slayt 5 embriyo - 1 yerleştirin. Ana lamel ve odanın her iki tarafında lamel fragmanları kullanılarak kızak arasında bir bölme oluşturur. Tipik olarak, dört 1. lamelleri sızdırmazlık olmadan bu boşluk yığınları yapmak için kullanılır.
    NOT: Hiçbir montaj orta gereklidir.
  2. Bir 100X yağ daldırma kullanınAmaç iletilen ışık kullanarak odak noktası haline tek embriyo getirmek. Işığı kapatın. konfokal mikroskop açın. Bu uygun lazerler (yeşil ve / veya kırmızı) açık ve uzaktan odak accessary oturduğundan emin olun.
  3. konfokal programı açın. In "Edinme bar," Doğru hedefi seçin. "XY Temel" çubuğunda, 1.024 butonuna tıklayarak 1.024 görüntü boyutunu ayarlayın.
  4. "Lazer ve Dedektörü" barda, her kanal için lazer ve dedektör açmak için kırmızı 488 kutu ve yeşil 568 kutusuna tıklayın. orta iğne deliği ayarlayın ve görselleştirmek için her kanalın "Kazanç" barda kazancını ayarlayın.
  5. "Elde Ayarlar" çubuğunda, görüntüleri elde başlamak için "Canlı" seçeneğine tıklayın. "Görünüm Ayarları" çubuğunda, "Canlı" penceresinde merkezine "İntegral Yakınlaştırma zorla" kutusunun işaretini kaldırın.
  6. "Ayarlar Edinme" barda "Z" sekmesi altında, görüntünün katmanları üzerinden adım. nu seçtikten sonraOptik bölümden mber, görüntü içine dahil z-düzlemi "Merkezi" bazı noktaya taşımak için.
  7. "Z" sekmesi altında, küçük kırmızı "Referans" kutusuna tıklayın. Bu "merkez" olarak seçilen noktada RFA sıfır olacaktır. "Adım Boyutu" etiketli kutuda (ideal mikron mikron 0.25 ila 2.0) katmanların kalınlığı seçin. "Dosya Boyutu" kutusuna dikkat edin ve 1GB sınırlamak için deneyin.
    Not: Genellikle, 0.5, 40, optik bölüme kadar - 1.0 um elde edilir, ancak bölme sayısı deneysel olarak tespit edilebilir.
  8. Resmin üst extreme bulmak için, "Top" yanındaki daireyi tıklayın ve z katmanları arasında hareket. Şimdi, bir sonraki "Bottom" için daireyi tıklayın bilgisayar merkezi olarak katmana geri görüntü alacaktır. Yine resmin alt aşırı bulmak için katmanları arasında hareket.
  9. lazer durdurmak için kutu "Edinme Ayarlar" tekrar "Canlı" linkine tıklayınedinimi. Bu panelde, kırmızı Ortalama etiketli kutuları ve Z-yığını tıklayın. Bu kutular yeşile döner.
  10. "Elde Ayarlar" kutusunda, görüntülerin tüm seriyi kazanmak için "Single" tıklayın. her iki kanalda ve tüm z-yığın içinde tarar gibi ilerlemesini izleyebilirsiniz.
  11. Kaydetmek birimi penceresinde tıklayın ve tıklayın "farklı kaydet" ve dosyayı adlandırın. Bir ".ids" dosyası olarak kaydedin. hacmine z yığın açıkken, dosyayı işlemek Veri menüyü aşağı çekin ve "render hacim" linkine tıklayarak seçin. Bir tiff dosyası olarak verilen dosyayı kaydedin. Bu, ilgili yayının gösterilmiştir yansıtılan görüntüdür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfo-epitopları görselleştirme için en uygun koşulları

Zebra balığı embriyolarının protein epitoplarının bağışık anlatan Yöntem in situ melezleme yoluyla mRNA'ların lokalize için kıyasla nispeten seyrek olmuştur. Zebra balığı embriyoların silli hücrelerde protein epitoplarının lokalize kullanılan Fiksatifler% 4 PFA / PBS ve metanol ve in situ hibridizasyon bütün montaj ile RNA DMSO ilave edi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PFA / metanol yöntemi zebrabalıkları gelişim sırasında fosfo-T 287 -CaMK-II epitopunun bağışık optimize temel amacı ile bu laboratuvarda geliştirilmiştir. Bu yöntem başarıyla zebrabalıkları KV, 14 ve özellikle KV aşamada böbrek. 13, bu tekniğin gerekli olduğu 12 iç kulak olmak üzere birçok siliyalı organların oluşumu sırasında P-CAMK-II lokalize. Bu yöntemin başarısı otofloresansı a) en aza indirilmesi, fosfo-CAMK II epitopunun b) korunması ve antikorlara epitop C) geliştirilm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibe IOS-0817658 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-fenil-2-tiyoüre (PTU)SigmaP-7629%0.12 Stok çözeltisi. Sistem suyunda 1:40 oranında seyreltin
Alexa488 anti-fare IgGYaşam TeknolojileriA11001Keçi poliklonal, 1:500'de kullanın
Alexa488 tavşan önleyici IgGYaşam TeknolojileriA11008Keçi poliklonal, 1:500'de kullanın
Alexa488 phalloidinYaşam TeknolojileriA12379Tercihen F-aktin
Alexa568'e bağlanır anti-fare IgGYaşam TeknolojileriA11004Keçi poliklonal, 1:500'de kullanın
Alexa568 anti-tavşan IgG YaşamTeknolojileriA11011Keçi poliklonal, 1:500
anti-asetillenmiş &# 945;-tübülindeSigmaT7451Fare monoklonal, 1:500
anti-fosfo-T287 CaMK-IIEMD Millipore06-881Tavşan poliklonal, 1:20'de kullanım
anti-total CaMK-IIBD Biosciences611292Fare monoklonal, 1:20'de kullanım
EtanolFisherS96857Lab sınıfı, %95 denatüre
ForepsGüzel Bilim Araçları11252-20Dumont #5
Cam lamellerVWR16004-330# 1 & nbsp; kalınlık
Cam mikroskop slaytlarıFisher12-550-15Standart cam slaytlar
MetanolFisherA411Dondurucuda saklayın
Mikrosantrifüj tüpleriVWR20170-038kapaklı tüpler, steril değil
Normal keçi serumuYaşam Teknolojileri16210-064Aliquot 1 ml tüpler, dondurucuda saklayın
ParaformaldehitSigmaP-6148Reaktif sınıfı, kristal
Fosfat tamponlu salin (PBS)Kalite Biyolojik119-069-13110x stok çözeltisi veya laboratuvarda üretilmiştir
Triton X-100SigmaBP-151Suda% 10 çözelti, RT
Tween-20'deLife Technologies85113Suda% 10 çözelti, RT
Bileşik mikroskoptaNikonE-600Titreşimsiz masaya monte edin
C1 Plus iki lazer taramalı konfokalNikonC1 PlusEZ-C1 programı tarafından çalıştırılır, ancak yükseltmeler " Elementler"
kullanın saklayın saklayın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113(2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115(2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644(2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Konfokal MikroskopiPFA Metanol FiksasyonuAsetillenmi T b linFosfo CaMKIIKupffer Vezik lB t n Da G r nt lemeLazer Tarama

İlgili makaleler