Method Article

Evrim Yöntemi yönettiği Saccharomyces cerevisiae: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

DOI:

10.3791/53761

⸱

April 1st, 2016

 ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo yüksek frekans homolog DNA rekombinasyon bağlanmış inşaat, klonlama ve mutant kütüphanelerin ifadesini içeren bir süreç biyoteknolojik uygulamalar için enzimler tasarlarken Saccharomyces cerevisiae yönlendirilmiş evrim çok çekici avantajlar sunuyor. Burada, toplam etkinliğini arttırmak için bir mantar aril-alkol oksidaz (AAO) örneğine dayalı olarak maya ve ekran mutant kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol mevcut. İki protein kesimleri rastgele mutagenezi ile ve in vivo DNA yeniden birleştirmesinden odaklı yönelik evrim tabi tutuldu. Her bir segment kuşatan 50 bp çıkıntıları tam kendiliğinden kopyalanan plazmidin sebebiyet veren bir doğrusallaştırılmış vektörde AAO-füzyon geninin, doğru yeniden birleştirme sağladı. Fonksiyonel AAO türevleri ile zenginleştirilmiş mutant kütüphaneler S. tarandı Fenton tepkimesi göre hassas bir yüksek verimli bir deney ile cerevisiae süpernatanlar. genel prosesS. kütüphane inşaat cerevisiae ilave PCR reaksiyonları, in vitro DNA rekombinasyon ve ligasyon adımlarından kaçınmak, burada açıklanan kolaylıkla diğer ökaryotik genlerin gelişmeye uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yönetmen moleküler evrim enzimleri 1, 2 tasarlamak için bir, sağlam, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Doğal olmayan olarak, yeni reaksiyonlarda, yeni yüzeylerde hareket rastgele mutasyon, rekombinasyon ve tarama, enzimlerin geliştirilmiş versiyonları oluşturulabilir yinelenen mermi ile ortamlarda, hatta yeni metabolik hedeflere 3-5 ulaşmak için hücreyi yardımcı olmak. Yönlendirilmiş evrim kullanılan bilgisayarlar arasında, bira mayası Saccharomyces cerevisiae prokaryotik meslektaşları 6,7 aksi bulunmayan karmaşık ökaryotik proteinlerin fonksiyonel ifade çözümler bir repertuar sunuyor.

Hücre biyol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mutant Kütüphanesi İnşaatı

  1. Seçim bölgeler, mevcut kristal yapı ya da homoloji model 18 göre bilgisayar algoritmaları yardımıyla geçişin maruz bırakılması.
    1. Burada, rastgele mutagenez ve rekombinasyon (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), yüksek sadakat PCR ile gen (844 bp) geri kalan yükseltme sırasında (Şekil 1) için Pleurotus eryngii gelen AAO iki bölgesini hedef.
      Not: Birkaç segmentler bağımsız veya kombine şekilde 16 geçişin ele alınabilir.
  2. mutajenik PCR ile hedeflenen bölgelere yükseltin. tanımlı bölgelerin PCR reaksiyonları atma kesimleri arasında alan....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. AAO eryngii lignin saldıran başlamak için H 2 O 2 ile mantar peroksidazlar sağlayan bir hücre dışı flavooxidase olduğunu. AAO iki segment etkinliğini ve S ifadesini arttırmak için geçişin tarafından odaklanmakta-yönlendirilmiş evrim tabi tutuldu cerevisiae 19. S. tarafından barındırdığı yabancı enzimlerin bağımsız olarak cerevisiae, maya mutant kütüphaneler inşa fragmanları ve doğrusallaştırılmış ve.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, ipuçlarını çoğu S. yönlendirilmiş evrim tarafından enzimleri mühendisi laboratuarımızda istihdam özetledik cerevisiae (örnek olarak AAO kullanarak) onlar sadece burada açıklanan ortak bir yaklaşım izlenerek diğer ökaryotik enzim sistemleri ile kullanım için adapte edilebilir, böylece.

Kütüphane oluşturulması açısından, biçim vermek ve 16 değiştirilmemiş proteinin geri kalan bölgeleri, bırakarak küçük protein uzanır rasgele mutasyonlar rekombine hızlı t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu projesi Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; Maliyet-Eylem CM1303-Sistem Biyokatalizi; ve Ulusal Projeler Dewry [BIO201343407-R] ve Cambios [RTC-2014-1777-3] tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1. Kültür ortamı
ampisilin sodyum tuzuSigma-AldrichA0166CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto AgarDifco214010
CloramphenicolSigma-AldrichC0378CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-GalaktozSigma-AldrichG0750CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG5767CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Rafinoz pentahidratSigma-Aldrich83400CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
PeptonDifco211677
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichP0662CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
UrasilSigma AldrichU1128
Maya ÖzüDifco212750
Amino Asitsiz Maya Azot BazıDifco291940
Urasil içermeyen Maya Sentetik Bırakma Ortamı TakviyeleriSigma-AldrichY1501
NameCompanyKatalog Numarası<güçlü>Yorumlar
güçlü2. PCR Reaksiyonları
dNTP KarışımıAgilent genomik200415-51her biri 25
mM iProof Yüksek Kaliteli DNA polimerazBio-rad172-5301
Manganez (II) klorür tetrahidratSigma-AldrichM8054CAS N & ordm; 13446-34-9 MW 197.91
Taq DNA PolimerazSigma-AldrichD4545Hata için eğilimli PCR
Name<strong>Company<strong>Katalog NumarasıComments
3. Plazmid doğrusallaştırma
BamHI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0136S
Sığır Serumu AlbüminiNew England BiolabsB9001S
XhoI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0146S
I değil kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0189S
Jel KırmızıBiotium41003DNA boyama için
güçlü > İsim< / strong> <strong > Company < / strong > <strong > Katalog Numarası< / strong > Yorumlar< / strong
> < strong >4. FOX tahlilleri< / güçlü>
Amonyum demir (II) sülfat hekzahidratSigma-AldrichF3754CAS N & ordm; 7783-85-9 MW 392.14
Anysil AlkolSigma AldrichW209902CAS N & ordm; 105-13-5 MW 138.16
D-SorbitolSigma-AldrichS1876CAS N & ordm; 50-70-4 MW 182.17
Hidrojen peroksit% 30Merck Millipore1072090250FOX standart eğrisi
Ksilenol Turuncu disodyum tuzuSigma-Aldrich52097CAS N & ordm; 1611-35-4 MW 716.62
< güçlü > Ad< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü>5. Agaroz jel maddeleri< / güçlü >
AgaroseNorgen28035CAS N & ordm; 9012-36-6
Jel KırmızıBiotium41003DNA analiz boyası
GeneRuler 1kb MerdivenThermo ScientificSM0311DNA MW standart
Yükleme Boyası 6xThermo ScientificR0611
Düşük erime sıcaklığı agarozBio-rad161-3112CAS N & ordm; 39346-81-1
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü >6. Kitler ve hücreler
S. cerevisiae suşu BJ5465LGC PromochemATTC 208289Genotip ile proteaz eksikliği olan suşu: MAT & alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Mavi yetkin hücrelerAgilent genomics200150Plazmid saflaştırma ve amplifikasyon için
NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme KitiMacherey-Nagel740,609,250DNA jel ekstraksiyonu
NucleoSpin Plazmid KitiMacherey-Nagel740,588,250Sütun miniprep Kiti
Maya Dönüşüm KitiSigma-AldrichYEAST1-1KTDahil DNA taşıyıcı (Somon testisleri)
Zymoprep maya plazmid miniprep IZymo araştırmasıD2001Mayadan plazmid ekstraksiyonu
AdCompany<strong>Katalog NumarasıComments
7. Plakalar
96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One655101Berrak, steril olmayan, polistiren (aktivite ölçümleri için)
96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One655161Berrak, steril, polistiren (mikrofermantasyonlar için)
96 oyuklu plaka kapağıGreiner Bio-One656171Berrak, steril, polistiren (mikrofermantasyonlar için)
<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Directed EvolutionSaccharomyces cerevisiaeMutant Library CreationRandom MutagenesisIn Vivo DNA RecombinationFungal Aryl alcohol OxidaseHigh throughput ScreeningFenton Reaction AssayGel ElectrophoresisYeast Transformation

Related Articles