Evrim Yöntemi yönettiği Saccharomyces cerevisiae: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Yönetmen moleküler evrim enzimleri ^{1, 2} tasarlamak için bir, sağlam, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Doğal olmayan olarak, yeni reaksiyonlarda, yeni yüzeylerde hareket rastgele mutasyon, rekombinasyon ve tarama, enzimlerin geliştirilmiş versiyonları oluşturulabilir yinelenen mermi ile ortamlarda, hatta yeni metabolik hedeflere ^3-5 ulaşmak için hücreyi yardımcı olmak. Yönlendirilmiş evrim kullanılan bilgisayarlar arasında, bira mayası Saccharomyces cerevisiae prokaryotik meslektaşları ^6,7 aksi bulunmayan karmaşık ökaryotik proteinlerin fonksiyonel ifade çözümler bir repertuar sunuyor.

Hücre biyolojisi çalışmalarında etraflıca kullanılan bu küçük ökaryot modeli yönlendirilmiş evrim ⁸ tarafından enzimleri mühendisi önemli özellikleri bütün bunlar post-translasyonel modifikasyonlar, manipülasyon ve dönüşüm verimliliği kolaylığı açısından birçok avantajı vardır. Ayrıca, yüksek frekanslıS. homolog DNA rekombinasyon onun etkin proof-okuma aygıtı bağlanmış cerevisiae karmaşık yapay yolların ^9-12 tek enzimlerin farklı sistemlerin evrimi teşvik, in vivo kütüphane oluşturma ve gen montaj olanakları geniş bir yelpazeye açar. Laboratuvarımız maya farklı linyinaz moleküler evrim (doğal ahşap çürüme sırasında lignin parçalanması ile ilgili oksiredüktazlan) ^13-14 için araçlar ve stratejiler tasarlanması son on harcadı. Bu iletişimde, biz hazırlamak ve S. ekran mutant kütüphaneleri için ayrıntılı bir protokol mevcut Model flavooxidase, -aril alkol oksidazı cerevisiae (AAO ¹⁵⁾ -, kolayca diğer enzimlere tercüme edilebilir. Maya hücre aparatı ^16, bir yardım: (Homolog in vivo Gruplama tarafından mutajenik Organize Rekombinasyon Süreci Morphing) protokolü odaklanmış yönlendirilmiş evrim yöntemini içerirKültür suyu ¹⁷ salgılanan AAO aktivitesi tespit etmek için Fenton tepkimesi göre da çok hassas bir tarama deneyi.

1. Mutant Kütüphanesi İnşaatı

1. Seçim bölgeler, mevcut kristal yapı ya da homoloji model ¹⁸ göre bilgisayar algoritmaları yardımıyla geçişin maruz bırakılması.
   1. Burada, rastgele mutagenez ve rekombinasyon (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), yüksek sadakat PCR ile gen (844 bp) geri kalan yükseltme sırasında (Şekil 1) için Pleurotus eryngii gelen AAO iki bölgesini hedef.
      Not: Birkaç segmentler bağımsız veya kombine şekilde ¹⁶ geçişin ele alınabilir.
2. mutajenik PCR ile hedeflenen bölgelere yükseltin. tanımlı bölgelerin PCR reaksiyonları atma kesimleri arasında alanları (~ 50 bp her) üst üste oluşturun.
   1. DNA şablonu ihtiva eden 50 ul (0.92 ng / | il), 90 nM oligo sens (kademeli bir MI ve kademeli bir M-II AAO-BP RMLN) içindeki bir nihai hacimde segmentler mutajenik PCR Hazırlama 90 nmntisense primeri (kademeli bir M-II için kademeli bir MI ve RMLC için AAO-92C), 0.3 mM dNTP (0.075 mM),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO), 1.5 mM _MgCl2, 0.05 mM _MnCl2 ve 0.05 U / ul Taq DNA polimerazı. Primerler dizileri Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir.
   2. Aşağıdaki PCR programı kullanarak: 2 dakika boyunca (1 döngü) 95 ° C; 45 saniye, 45 saniye, 50 ° C, 45 sn için 74 ° C (28 döngü) 95 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 74 ° C.
3. ultra-yüksek sadakat polimeraz olmayan mutajenik bölgeleri yükseltmek ve mutajenik segmentleri ve / veya doğrusallaştırılmış vektör çıkıntılar üst üste gelen alanları bulunmaktadır.
   1. ihtiva eden 50 ul'lik bir son hacim içinde, reaksiyon karışımları hazırlayın: DNA numunesi (0.2 ng / | il), 250 nM oligo sens HFF, 250 nM oligo antisens HFR, 0.8 mM dNTP (0.2 mM her biri),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO) ve DNA polimerazı iproof 0.02 U / ul. Astarlar dizileri ayrıntılı olarak <strong> Şekil 1.
   2. Aşağıdaki PCR programı kullanın: 30 sn (1 döngü) için 98 ° C; 10 saniye, 25 saniye boyunca 55 ° C, 45 saniye için 72 ° C (28 döngü) 98 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 72 ° C.
      Not: 1.2 açıklanan koşullara ve 43 bp (plazmid-M1 bölge) 1.3 örtüştüğü ile; 46 bp (M1 bölge HF bölge); 47 bp (HF bölge M2 bölge) ve 61 bp (M2 Bölge- plazmid) maya in vivo ekleme de lehine (Şekil 1) tasarlanmıştır.
   3. imalatçının protokolüne göre, ticari bir jel özütleme kiti (mutajenik ve mutajenik) bütün PCR fragmanları arındırın.
4. Yaklaşık 50 bp'lik komşu bölgeleri hedef genin 5'- ve 3'-ucuna homolog olan oluşturulur, öyle ki vektör linearize.
   1. 2 ug DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, Tampon Ba 20 ug BSA ve 2 ul içeren bir doğrusallaştırma reaksiyon karışımı hazırlayın20 ul nihai hacim içinde m HI 10x.
   2. 2 saat ve 40 dakika boyunca 37 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe edin. Daha sonra, 20 dakika boyunca 80 ° C 'de inaktivasyonu devam edin.
5. Kalan dairesel plazmid (Şekil 2) ile kirlenmesini önlemek için agaroz jel ekstraksiyon tarafından lineerleştirilebilir vektörü arındırın.
   1. de bir muhabir bitişik reaksiyon karışımı ayrıca bir alikosu (5 ul) (v, w% 0.75), bir yarı-preparatif düşük erime noktalı agaroz jel mega kuyuya sindirim Reaksiyon karışımı yükleyin.
   2. Run DNA elektroforezi (elektrotlar arasında 5 V / cm, 4 ᵒC) ve mega-kuyuya gelen agaroz jel ayırmak ve 1x TAE 4 ᵒC sıcaklıkta saklayın.
   3. molekül ağırlığı merdiven ve raportör ile sokağın Leke. UV ışık altında bantları gözünüzde canlandırın. Nick pozisyon Lineerleştirilmiş vektör yerleştirir.
      Not: saflaştırılmıştır lineer vektör kalitesi great.Thanks olduğucal faktör maya başarılı rekombinasyon ve montaj, yarı hazırlayıcı DNA elektroforezi için jel boyama kaçının. Boyalar ve jel ekstraksiyonu için, UV'ye maruz kalmadan kullanılması, in vivo rekombinasyon verimliliği ödün, DNA vektörünün stabilitesini etkileyebilir. Toksik EtBr boyalar alternatif olarak, jel Kırmızı ve SYBR boyalar genel olarak jel boyama için kullanılır.
   4. UV ışık yokluğunda, bu izole edilebilir ve böylece lekeli raportör şeritte sıyrık yol göstericiliği kullanılarak Mega oyuklu fragmanında lineer vektör tanımlar.
   5. agarozdan lineer vektör çıkarın ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir jel özütleme kiti ile saflaştırılması.
      Not: antibiyotik ve oksotrofi işaretleri kullanan yüksek kopya epizomal mekik vektörleri: Bu maya GAL1 promoterinin kontrolü altında, urasil bağımsız ve ampisilin dirençli pJRoC30 vektör kullanılabilir Bu örnekte.
6. eşmolar MI hazırlanmasıPCR parçalarının soğutun ve 2 de lineer vektör ile karıştırarak: doğrusallaştırılmış plazmidin en az 100 ng, 1 oranında (eşmolar kütüphanesi açık / vektör test farklı oranlarda iyi bir dönüşüm verimi elde etmek için).
   1. konsantrasyon ve saflığı belirlemek için PCR parçaları ve 260 nm ve 280 nm 'de lineer vektör absorbansı ölçülür.
7. Bir ticari maya dönüştürme kiti kullanılarak DNA karışımı maya yetkin hücrelerini dönüştürmek, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzeme Tablo).
   1. Bağımlı S. ^- Burada bir yoksun proteaz ve URA3 kullanın cerevisiae suşu, BJ5465. (Aşağıya bakınız), tarama sırasında bir iç standart olarak ebeveyn daireselleşmiş vektörle hücrelerini dönüştürmek. Buna ek olarak, PCR parçalarının yokluğunda lineer vektör dönüştürerek arka plan kontrol edin.
      Not: ilk düşük salgılanmasını tespit durumunda, faydalanmaBJ5465 gibi cerevisiae proteaz eksikliği olan suşlarıdır kültür yüzey aktif protein birikimi geliştirmek için. Hedef enzimin hiperglikosilasyon glikosilasyon eksikliği cinslerinin kullanımını maruz (örneğin, sadece daha küçük manoz oligomerleri bağlama kapasitesine sahip Δ kre2), uygun bir seçenek olabilir.
8. Plaka dönüştürdü SC bırakma plakalar üzerinde hücre ve üç gün boyunca 30 ° C'de inkübe. Plakası (urasil ile desteklenmiş SC bırakma tabakalarına) URA3 ^- S. taranması için bir negatif kontrol olarak plazmid eksik S. cerevisiae hücreleri (aşağıya bakınız).

Testi Tarama 2. Yüksek Verimli (Şekil 3)

1. bir pipetleme robotu yardımıyla göz başına 50 | il minimum ortam maddesi ile (2.000 klon kütüphanesinin analiz 23 levha) steril 96 oyuklu plakalar bir uygun sayıda doldurun.
2. plakalar dışında SC-açılan bireysel koloniler seçin ve 96-kuyucuğu aktarabilirsiniz.
   1. Her plaka olarak, ebeveyn bir iç standart olarak tip ve iyi URA3 ile H1 ile sütun numarasını 6 aşılamak ^- S. Bir negatif kontrol olarak hiçbir plasmid ile (urasil ile takviye SC ortamı içinde) cerevisiae hücreleri.
      Not: Kuyu H1 urasil ile desteklenmiş bırakma medya ile özel olarak doldurulur. hücre içermeyen boş bir de ihtiva eden ortam ayrıca bir sterilite kontrolü olarak hazırlanabilir.
3. onların kapaklı tabak kapatın ve Parafilm onları sarın. Nemli bir çalkalayıcıda, 30 ° C'de 48 saat, 225 rpm ve 80% bağıl nem için inkübe edin.
4. Parafilm kaldır pipetleme robotu yardımıyla her bir oyuğa sentezleme ortamı 160 ul, plakalar yeniden kapatın ve 24 saat daha inkübe.
   Not: Başka bir yerde ¹⁹ bildirildiği gibi Minimal orta ve ifade ortamı hazırlanır. Salgılama seviyeleri t, ve buna bağlı olarak çalışma altında genin bağlı olarak değişebilirO zaman tüm oyuklara hücre büyümesini senkronize etmek için her bir durumda, optimize edilmelidir kuluçkalama.
5. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2,800 x g plakaları (ana plakalar).
6. Aktarım robot çok istasyonlu işleme bir sıvı kullanarak çoğaltma plakasına ana plakadaki kuyulardan süpernatan 20 ul.
   Not: enzim salgılanmasını desteklemek amacıyla yaygın maya heterolog ekspresyonu (kullanılan sinyal peptidleri hedef proteinin doğal sinyal peptidi yerine tavsiye edilir, örneğin, α faktörü prepro-lideri, S. K _1. Öldürücü toksini lideri cerevisiae veya her iki peptit ¹³⁾ daha uyumlu versiyonlarıdır. Seçenek olarak ise, doğal sinyal peptid sadece maya içinde salgılanması için açığa çıkabilir.
7. Pipetleme robot yardımı ile 100 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 6.0 içinde 2 mM p -methoxybenzylalcohol 20 ul ekle. 96-biz kısaca plakaları karıştırınve kap mikseri ll, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe.
8. Pipetleme robot ile, her çoğaltma plakasına FOX reaktifi 160 ul ve de FOX karışımının karıştırıcı (nihai konsantrasyon kısaca karıştırılmıştır: 100 uM ksilenol turuncu, 250 uM Fe _{(NH4) 2 (SO4) 2} ve 25 mM H ₂ SO _4).
   1. Bu tür organik yardımcı solventlerin (DMSO, etanol, metanol) veya sorbitol ¹⁷ olarak duyarlılığını artırmak için bir reaktif için çeşitli katkı maddeleri ekleyin. Burada, 100 mm (Şekil 4) bir son konsantrasyona kadar sorbitol eklenerek cevap yükseltmek.
9. Bir plaka okuyucusu üzerinde 560 nm'de plakaları (uç noktası modu, t = ₀₎ okuyun.
10. Renk gelişene kadar oda sıcaklığında inkübe ve tekrar (t ₁₎ emilimini ölçmek.
    1. kuluçkadan sonra Abs değeri arasındaki farktan göreceli aktivitesini hesaplamak ve ilk ölçüm o pare normalizeHer bir plaka için ntal tipi (¨t ₁ - t = _0).
11. yanlış pozitif ekarte etmek iki ardışık yeniden gösterimleri için en iyi mutant hit Konu.
    Not: Genellikle, yeniden gösterimleri plazmid ¹⁹ yaş maya hücrelerinin dönüşümü, ardından, Escherichia coli içinde maya, amplifikasyon ve arıtma için plazmid izolasyon bulunmaktadır. Seçilen her bir klon pentaplicate yeniden elenir.

P. AAO eryngii lignin saldıran başlamak için H 2 O 2 ile mantar peroksidazlar sağlayan bir hücre dışı flavooxidase olduğunu. AAO iki segment etkinliğini ve S ifadesini arttırmak için geçişin tarafından odaklanmakta-yönlendirilmiş evrim tabi tutuldu cerevisiae 19. S. tarafından barındırdığı yabancı enzimlerin bağımsız olarak cerevisiae, maya mutant kütüphaneler inşa fragmanları ve doğrusallaştırılmış vektör içine onların klonlama arasındaki yapıştırma lehine belirli örtüşen bölgelerin mühendislik ilgilidir en kritik konu. Mevcut örnekte, her bir PCR reaksiyonu için, tüm parçalarının, maya, in vivo splicing teşvik etmek için yaklaşık 50 bp çıkıntıları vardı. Parça sayısı monte edilmiş ve doğrusallaştırılmış vektör ile klonlanabilir için rekombinasyon olaylarının sayısı bağlıdır (yani, iki geçiş olayları arasında yer aldıŞekil 1), üç PCR kesimleri olmayan mutagenize segment her iki yanındaki iki mutajenik segment artı doğrusallaştırılmış vektör ile iki ek geçitler alınmış. Onlar dönüşüm verimliliğini artırmak yok iken bizim deneyim göre, 50 bp daha uzun örtüşen diziler iç rekombinasyon olasılığını azaltmak.

Mutasyon yükler, aktif ve aktif olmayan varyantlar (Şekil 5A) rastgele bir örnek sıralanmasıyla onları kontrol daha farklı manzara ile mutant kütüphaneleri örnekleme ebeveyn enzim aktivitesinin <% 10 klonların sayısını hesaplarken, ve tarafından ayarlandı. Varyans S. katsayısının belirlenmesi için cerevisiae hücreleri ebeveyn AAO ile transforme edilmiş ve plakalar üzerinden SC damla ekildi. Bireysel koloniler alınmış ve aşılanmış 96 oyuklu bir plaka ve klon aktivitesi taze müstahzarlardan değerlendirildi edildi. mutajenik örnek2 (Taq / MnCl2 0.05 mM) kütüphane yapım ve tarama için kalkış noktası olarak seçildi.

AAO biyolojik aktivitesi reaksiyon ortamına H 2 O 2 konsantrasyonu arttıkça, biz H 2 O 2 ufak değişiklikler ölçmek için hassas ve doğru bir tahlil için aradı. FOX Fenton tepkimesi 20 göre bir kimyasal metod olup, burada H oksidasyon 2 O 2 sürücüler mavi-mor kompleksi oluşturmak üzere ksilenol turuncu Fe Reaksiyon 3+ (O -cresolsulfone-Phthalein 3 ', 3' '- bis (metilimino) diasetat ε 560 = 1.5 x 10 4 M-1 cm-1). Demir oksidasyon aşaması belirgin ε radikali ile yayılmasını arttırır tahlilin hassasiyetini artırmak için sorbitol eklenmesi ile büyütüldü 560 = 2.25 x 10 5 M-1 cm-1 (Fişekil 4).

Bu analizin tespit kabiliyeti limiti (uM aralığında) üç kez (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ve 4 uM H standartları ile 96 oyuklu plaka içerisinde boş belirlenmesi yöntemi ile hesaplanmıştır 2 O 2 ) ve S. birkaç üst fazlar kullanılarak Plazmid (Şekil 5B) - cerevisiae URA3 eksik. Deney yanıtı zayıftır (H2O 2 en az 30 kadar uM) olarak sorbitol mevcudiyetinde, lineer doğrusallık Bu şeker yokluğunda daha kalıcı olan, ve her ne kadar (en fazla 8 H 2 uM O 2) idi (örneğin, en H2O 2 6 uM, 4-kat artışı yokluğunda -Dark Turuncu (Şekil 5B) 0.24 bir emilimden sorbitol Derin purple- mevcudiyetinde elde edildi). Abs ve AAO konsantrasyonu arasındaki ilişki e artan miktarları ile değerlendirildinzyme (maya süpernatanları elde edilmiş) ve lineer tepki gözlendi; R2 = 0.997 (Şekil 5C).

FOX sinyal kültür suyu farklı unsurları tarafından görünürde herhangi bir müdahalesi olmadan birkaç saat boyunca stabil olduğunu dikkat çekicidir. FOX tahmini duyarlılık süpernatant AAO tarafından üretilen H 2 O 2 ~ 0.4 uM idi yokluğunda sorbitol mevcudiyetinde, ve yaklaşık 2 uM olarak.

2,000 klon mutant kütüphanesi inşa bu testte elenmiştir. Çeşitli AAO mutantlar p-metoksibenzil alkol (Şekil 5D) 19 karşı özellikle gelişmiş salgılanması ve aktivite ile tespit edilmiştir.

Şekil 1.. AAO Evolution Protokolü geçişin AAO iki farklı bölgeleri rastgele mutajenez ve rekombinasyon için hedef alındı: M1 (mavi, 590 bp) sinyal peptid (SP) içerir; (Sarı, 528 bp) M2. (Gri, 844 bp) HF bölge yüksek sadakat polimerazlar ile amplifiye edildi. Mutajenik bölgeler AAO (PDB ID: 3FIM) kristal yapısında haritalanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

PCR ürünleri ve lineer vektör Şekil 2. hazırlanması (A) Analitik agaroz jel (% 1 a: hacim). Şerit 1 ve 7'de bir moleküler ağırlık işaretleyici (1 kb merdiven) ihtiva etmektedir; BamHI ve Xho I Doğrusallaştırılmış vektör, şerit 2; PCR parçası, M1, şerit 3; PCR kademeli M2, şerit 4; PCR kademeli bir HF, şerit 5'tir; vivo NheI (bölgeler MI, HF ve M, II tam AAO geni ihtiva eden) ile lineer vektör yeniden birleştirilen, şerit 6 (b) vektörü doğrusallaştırma, kuşak 1 ve 6 molekül standartları, 1 Kb merdiveni, Plazmid Miniprep, şerit 2; Nhe I, kuşak 3 ile doğrusallaştırılmıştır plazmid; BamHI ve Xho I, şerit 4 ile linearize plazmid; Jel Ekstraksiyon ve sindirim sonra temiz-up, plazmid saflaştırma için şerit 5. (C) Protokol tarafından elde edilen Lineerleştirilmiş plazmid. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Yüksek verim Tarama Protokolü. Işlemine genel bakış. Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.

Şekil 4. FOX yöntemi. Beyaz çürüklük mantarları • OH radikal hidroksil üreten bir Fenton reaksiyonu ile ahşap hücre duvarını saldırırlar. FOX yöntemi çiftler bu reaksiyon portakal (XO) xylenol için, ve XO-Fe 3+ kompleksin absorbansı 560 nm'de ölçülür. Demir oksidasyon reaktif karışıma sorbitol ilave edilerek güçlendirilmiş. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Mutajenik Manzaraları Farklı hata Yüzüstü PCR Koşulları ve Tarama Testinin Doğrulama kullanarak Kütüphaneleri geçişin için. (A ng>) geçişin manzara. kesikli çizgiler testin varyans katsayısı işaret ederken katı yatay çizgi deneyinde ebeveyn Çeşidi faaliyet göstermektedir. yüzdeler ebeveyn enzim aktivitesinin% 10'undan daha az olan klonların sayısı gösterir. Etkinlikler azalan düzende çizilir. (B) FOX saptama sınırı varlığı (siyah daireler), H2O 2 artan konsantrasyonları ve sorbitol yokluğunda (beyaz kareler) ile değerlendirildi. AAO konsantrasyonu (dönüştürücü süpernatantlar) ve Abs 560nm arasındaki (C) Doğrusal korelasyon. Her bir nokta 8 deneylerin ortalama gelir ve standart sapma içerir. (D) Mutant kütüphane manzara. Başka bir yerde 19 bildirildiği gibi seçilmiş varyantları (gölgeli kare) tekrardan taranmıştır. Düz çizgi AAO ebeveyn Çeşidi faaliyet göstermektedir.> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.