Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Evrim Yöntemi yönettiği

10.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53761

⸱

1 Nisan 2016

 ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Bu makalede

Özet

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

In vivo yüksek frekans homolog DNA rekombinasyon bağlanmış inşaat, klonlama ve mutant kütüphanelerin ifadesini içeren bir süreç biyoteknolojik uygulamalar için enzimler tasarlarken Saccharomyces cerevisiae yönlendirilmiş evrim çok çekici avantajlar sunuyor. Burada, toplam etkinliğini arttırmak için bir mantar aril-alkol oksidaz (AAO) örneğine dayalı olarak maya ve ekran mutant kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol mevcut. İki protein kesimleri rastgele mutagenezi ile ve in vivo DNA yeniden birleştirmesinden odaklı yönelik evrim tabi tutuldu. Her bir segment kuşatan 50 bp çıkıntıları tam kendiliğinden kopyalanan plazmidin sebebiyet veren bir doğrusallaştırılmış vektörde AAO-füzyon geninin, doğru yeniden birleştirme sağladı. Fonksiyonel AAO türevleri ile zenginleştirilmiş mutant kütüphaneler S. tarandı Fenton tepkimesi göre hassas bir yüksek verimli bir deney ile cerevisiae süpernatanlar. genel prosesS. kütüphane inşaat cerevisiae ilave PCR reaksiyonları, in vitro DNA rekombinasyon ve ligasyon adımlarından kaçınmak, burada açıklanan kolaylıkla diğer ökaryotik genlerin gelişmeye uygulanabilir.

Giriş

Yönetmen moleküler evrim enzimleri 1, 2 tasarlamak için bir, sağlam, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Doğal olmayan olarak, yeni reaksiyonlarda, yeni yüzeylerde hareket rastgele mutasyon, rekombinasyon ve tarama, enzimlerin geliştirilmiş versiyonları oluşturulabilir yinelenen mermi ile ortamlarda, hatta yeni metabolik hedeflere 3-5 ulaşmak için hücreyi yardımcı olmak. Yönlendirilmiş evrim kullanılan bilgisayarlar arasında, bira mayası Saccharomyces cerevisiae prokaryotik meslektaşları 6,7 aksi bulunmayan karmaşık ökaryotik proteinlerin fonksiyonel ifade çözümler bir repertuar sunuyor.

Hücre biyolojisi çalışmalarında etraflıca kullanılan bu küçük ökaryot modeli yönlendirilmiş evrim 8 tarafından enzimleri mühendisi önemli özellikleri bütün bunlar post-translasyonel modifikasyonlar, manipülasyon ve dönüşüm verimliliği kolaylığı açısından birçok avantajı vardır. Ayrıca, yüksek frekanslıS. homolog DNA rekombinasyon onun etkin proof-okuma aygıtı bağlanmış cerevisiae karmaşık yapay yolların 9-12 tek enzimlerin farklı sistemlerin evrimi teşvik, in vivo kütüphane oluşturma ve gen montaj olanakları geniş bir yelpazeye açar. Laboratuvarımız maya farklı linyinaz moleküler evrim (doğal ahşap çürüme sırasında lignin parçalanması ile ilgili oksiredüktazlan) 13-14 için araçlar ve stratejiler tasarlanması son on harcadı. Bu iletişimde, biz hazırlamak ve S. ekran mutant kütüphaneleri için ayrıntılı bir protokol mevcut Model flavooxidase, -aril alkol oksidazı cerevisiae (AAO 15) -, kolayca diğer enzimlere tercüme edilebilir. Maya hücre aparatı 16, bir yardım: (Homolog in vivo Gruplama tarafından mutajenik Organize Rekombinasyon Süreci Morphing) protokolü odaklanmış yönlendirilmiş evrim yöntemini içerirKültür suyu 17 salgılanan AAO aktivitesi tespit etmek için Fenton tepkimesi göre da çok hassas bir tarama deneyi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Mutant Kütüphanesi İnşaatı

  1. Seçim bölgeler, mevcut kristal yapı ya da homoloji model 18 göre bilgisayar algoritmaları yardımıyla geçişin maruz bırakılması.
    1. Burada, rastgele mutagenez ve rekombinasyon (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), yüksek sadakat PCR ile gen (844 bp) geri kalan yükseltme sırasında (Şekil 1) için Pleurotus eryngii gelen AAO iki bölgesini hedef.
      Not: Birkaç segmentler bağımsız veya kombine şekilde 16 geçişin ele alınabilir.
  2. mutajenik PCR ile hedeflenen bölgelere yükseltin. tanımlı bölgelerin PCR reaksiyonları atma kesimleri arasında alanları (~ 50 bp her) üst üste oluşturun.
    1. DNA şablonu ihtiva eden 50 ul (0.92 ng / | il), 90 nM oligo sens (kademeli bir MI ve kademeli bir M-II AAO-BP RMLN) içindeki bir nihai hacimde segmentler mutajenik PCR Hazırlama 90 nmntisense primeri (kademeli bir M-II için kademeli bir MI ve RMLC için AAO-92C), 0.3 mM dNTP (0.075 mM),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO), 1.5 mM MgCl2, 0.05 mM MnCl2 ve 0.05 U / ul Taq DNA polimerazı. Primerler dizileri Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir.
    2. Aşağıdaki PCR programı kullanarak: 2 dakika boyunca (1 döngü) 95 ° C; 45 saniye, 45 saniye, 50 ° C, 45 sn için 74 ° C (28 döngü) 95 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 74 ° C.
  3. ultra-yüksek sadakat polimeraz olmayan mutajenik bölgeleri yükseltmek ve mutajenik segmentleri ve / veya doğrusallaştırılmış vektör çıkıntılar üst üste gelen alanları bulunmaktadır.
    1. ihtiva eden 50 ul'lik bir son hacim içinde, reaksiyon karışımları hazırlayın: DNA numunesi (0.2 ng / | il), 250 nM oligo sens HFF, 250 nM oligo antisens HFR, 0.8 mM dNTP (0.2 mM her biri),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO) ve DNA polimerazı iproof 0.02 U / ul. Astarlar dizileri ayrıntılı olarak Şekil 1.
    2. Aşağıdaki PCR programı kullanın: 30 sn (1 döngü) için 98 ° C; 10 saniye, 25 saniye boyunca 55 ° C, 45 saniye için 72 ° C (28 döngü) 98 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 72 ° C.
      Not: 1.2 açıklanan koşullara ve 43 bp (plazmid-M1 bölge) 1.3 örtüştüğü ile; 46 bp (M1 bölge HF bölge); 47 bp (HF bölge M2 bölge) ve 61 bp (M2 Bölge- plazmid) maya in vivo ekleme de lehine (Şekil 1) tasarlanmıştır.
    3. imalatçının protokolüne göre, ticari bir jel özütleme kiti (mutajenik ve mutajenik) bütün PCR fragmanları arındırın.
  4. Yaklaşık 50 bp'lik komşu bölgeleri hedef genin 5'- ve 3'-ucuna homolog olan oluşturulur, öyle ki vektör linearize.
    1. 2 ug DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, Tampon Ba 20 ug BSA ve 2 ul içeren bir doğrusallaştırma reaksiyon karışımı hazırlayın20 ul nihai hacim içinde m HI 10x.
    2. 2 saat ve 40 dakika boyunca 37 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe edin. Daha sonra, 20 dakika boyunca 80 ° C 'de inaktivasyonu devam edin.
  5. Kalan dairesel plazmid (Şekil 2) ile kirlenmesini önlemek için agaroz jel ekstraksiyon tarafından lineerleştirilebilir vektörü arındırın.
    1. de bir muhabir bitişik reaksiyon karışımı ayrıca bir alikosu (5 ul) (v, w% 0.75), bir yarı-preparatif düşük erime noktalı agaroz jel mega kuyuya sindirim Reaksiyon karışımı yükleyin.
    2. Run DNA elektroforezi (elektrotlar arasında 5 V / cm, 4 ᵒC) ve mega-kuyuya gelen agaroz jel ayırmak ve 1x TAE 4 ᵒC sıcaklıkta saklayın.
    3. molekül ağırlığı merdiven ve raportör ile sokağın Leke. UV ışık altında bantları gözünüzde canlandırın. Nick pozisyon Lineerleştirilmiş vektör yerleştirir.
      Not: saflaştırılmıştır lineer vektör kalitesi great.Thanks olduğucal faktör maya başarılı rekombinasyon ve montaj, yarı hazırlayıcı DNA elektroforezi için jel boyama kaçının. Boyalar ve jel ekstraksiyonu için, UV'ye maruz kalmadan kullanılması, in vivo rekombinasyon verimliliği ödün, DNA vektörünün stabilitesini etkileyebilir. Toksik EtBr boyalar alternatif olarak, jel Kırmızı ve SYBR boyalar genel olarak jel boyama için kullanılır.
    4. UV ışık yokluğunda, bu izole edilebilir ve böylece lekeli raportör şeritte sıyrık yol göstericiliği kullanılarak Mega oyuklu fragmanında lineer vektör tanımlar.
    5. agarozdan lineer vektör çıkarın ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir jel özütleme kiti ile saflaştırılması.
      Not: antibiyotik ve oksotrofi işaretleri kullanan yüksek kopya epizomal mekik vektörleri: Bu maya GAL1 promoterinin kontrolü altında, urasil bağımsız ve ampisilin dirençli pJRoC30 vektör kullanılabilir Bu örnekte.
  6. eşmolar MI hazırlanmasıPCR parçalarının soğutun ve 2 de lineer vektör ile karıştırarak: doğrusallaştırılmış plazmidin en az 100 ng, 1 oranında (eşmolar kütüphanesi açık / vektör test farklı oranlarda iyi bir dönüşüm verimi elde etmek için).
    1. konsantrasyon ve saflığı belirlemek için PCR parçaları ve 260 nm ve 280 nm 'de lineer vektör absorbansı ölçülür.
  7. Bir ticari maya dönüştürme kiti kullanılarak DNA karışımı maya yetkin hücrelerini dönüştürmek, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzeme Tablo).
    1. Bağımlı S. - Burada bir yoksun proteaz ve URA3 kullanın cerevisiae suşu, BJ5465. (Aşağıya bakınız), tarama sırasında bir iç standart olarak ebeveyn daireselleşmiş vektörle hücrelerini dönüştürmek. Buna ek olarak, PCR parçalarının yokluğunda lineer vektör dönüştürerek arka plan kontrol edin.
      Not: ilk düşük salgılanmasını tespit durumunda, faydalanmaBJ5465 gibi cerevisiae proteaz eksikliği olan suşlarıdır kültür yüzey aktif protein birikimi geliştirmek için. Hedef enzimin hiperglikosilasyon glikosilasyon eksikliği cinslerinin kullanımını maruz (örneğin, sadece daha küçük manoz oligomerleri bağlama kapasitesine sahip Δ kre2), uygun bir seçenek olabilir.
  8. Plaka dönüştürdü SC bırakma plakalar üzerinde hücre ve üç gün boyunca 30 ° C'de inkübe. Plakası (urasil ile desteklenmiş SC bırakma tabakalarına) URA3 - S. taranması için bir negatif kontrol olarak plazmid eksik S. cerevisiae hücreleri (aşağıya bakınız).

Testi Tarama 2. Yüksek Verimli (Şekil 3)

  1. bir pipetleme robotu yardımıyla göz başına 50 | il minimum ortam maddesi ile (2.000 klon kütüphanesinin analiz 23 levha) steril 96 oyuklu plakalar bir uygun sayıda doldurun.
  2. plakalar dışında SC-açılan bireysel koloniler seçin ve 96-kuyucuğu aktarabilirsiniz.
    1. Her plaka olarak, ebeveyn bir iç standart olarak tip ve iyi URA3 ile H1 ile sütun numarasını 6 aşılamak - S. Bir negatif kontrol olarak hiçbir plasmid ile (urasil ile takviye SC ortamı içinde) cerevisiae hücreleri.
      Not: Kuyu H1 urasil ile desteklenmiş bırakma medya ile özel olarak doldurulur. hücre içermeyen boş bir de ihtiva eden ortam ayrıca bir sterilite kontrolü olarak hazırlanabilir.
  3. onların kapaklı tabak kapatın ve Parafilm onları sarın. Nemli bir çalkalayıcıda, 30 ° C'de 48 saat, 225 rpm ve 80% bağıl nem için inkübe edin.
  4. Parafilm kaldır pipetleme robotu yardımıyla her bir oyuğa sentezleme ortamı 160 ul, plakalar yeniden kapatın ve 24 saat daha inkübe.
    Not: Başka bir yerde 19 bildirildiği gibi Minimal orta ve ifade ortamı hazırlanır. Salgılama seviyeleri t, ve buna bağlı olarak çalışma altında genin bağlı olarak değişebilirO zaman tüm oyuklara hücre büyümesini senkronize etmek için her bir durumda, optimize edilmelidir kuluçkalama.
  5. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2,800 x g plakaları (ana plakalar).
  6. Aktarım robot çok istasyonlu işleme bir sıvı kullanarak çoğaltma plakasına ana plakadaki kuyulardan süpernatan 20 ul.
    Not: enzim salgılanmasını desteklemek amacıyla yaygın maya heterolog ekspresyonu (kullanılan sinyal peptidleri hedef proteinin doğal sinyal peptidi yerine tavsiye edilir, örneğin, α faktörü prepro-lideri, S. K 1. Öldürücü toksini lideri cerevisiae veya her iki peptit 13) daha uyumlu versiyonlarıdır. Seçenek olarak ise, doğal sinyal peptid sadece maya içinde salgılanması için açığa çıkabilir.
  7. Pipetleme robot yardımı ile 100 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 6.0 içinde 2 mM p -methoxybenzylalcohol 20 ul ekle. 96-biz kısaca plakaları karıştırınve kap mikseri ll, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe.
  8. Pipetleme robot ile, her çoğaltma plakasına FOX reaktifi 160 ul ve de FOX karışımının karıştırıcı (nihai konsantrasyon kısaca karıştırılmıştır: 100 uM ksilenol turuncu, 250 uM Fe (NH4) 2 (SO4) 2 ve 25 mM H 2 SO 4).
    1. Bu tür organik yardımcı solventlerin (DMSO, etanol, metanol) veya sorbitol 17 olarak duyarlılığını artırmak için bir reaktif için çeşitli katkı maddeleri ekleyin. Burada, 100 mm (Şekil 4) bir son konsantrasyona kadar sorbitol eklenerek cevap yükseltmek.
  9. Bir plaka okuyucusu üzerinde 560 nm'de plakaları (uç noktası modu, t = 0) okuyun.
  10. Renk gelişene kadar oda sıcaklığında inkübe ve tekrar (t 1) emilimini ölçmek.
    1. kuluçkadan sonra Abs değeri arasındaki farktan göreceli aktivitesini hesaplamak ve ilk ölçüm o pare normalizeHer bir plaka için ntal tipi (¨t 1 - t = 0).
  11. yanlış pozitif ekarte etmek iki ardışık yeniden gösterimleri için en iyi mutant hit Konu.
    Not: Genellikle, yeniden gösterimleri plazmid 19 yaş maya hücrelerinin dönüşümü, ardından, Escherichia coli içinde maya, amplifikasyon ve arıtma için plazmid izolasyon bulunmaktadır. Seçilen her bir klon pentaplicate yeniden elenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P. AAO eryngii lignin saldıran başlamak için H 2 O 2 ile mantar peroksidazlar sağlayan bir hücre dışı flavooxidase olduğunu. AAO iki segment etkinliğini ve S ifadesini arttırmak için geçişin tarafından odaklanmakta-yönlendirilmiş evrim tabi tutuldu cerevisiae 19. S. tarafından barındırdığı yabancı enzimlerin bağımsız olarak cerevisiae, maya mutant kütüphaneler inşa fragmanları ve doğrusallaştırılmış ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, ipuçlarını çoğu S. yönlendirilmiş evrim tarafından enzimleri mühendisi laboratuarımızda istihdam özetledik cerevisiae (örnek olarak AAO kullanarak) onlar sadece burada açıklanan ortak bir yaklaşım izlenerek diğer ökaryotik enzim sistemleri ile kullanım için adapte edilebilir, böylece.

Kütüphane oluşturulması açısından, biçim vermek ve 16 değiştirilmemiş proteinin geri kalan bölgeleri, bırakarak küçük protein uzanır rasgele mutasyonlar rekombine hızlı t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu projesi Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; Maliyet-Eylem CM1303-Sistem Biyokatalizi; ve Ulusal Projeler Dewry [BIO201343407-R] ve Cambios [RTC-2014-1777-3] tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1. Kültür ortamı
ampisilin sodyum tuzuSigma-AldrichA0166CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto AgarDifco214010
CloramphenicolSigma-AldrichC0378CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-GalaktozSigma-AldrichG0750CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG5767CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Rafinoz pentahidratSigma-Aldrich83400CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
PeptonDifco211677
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichP0662CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
UrasilSigma AldrichU1128
Maya ÖzüDifco212750
Amino Asitsiz Maya Azot BazıDifco291940
Urasil içermeyen Maya Sentetik Bırakma Ortamı TakviyeleriSigma-AldrichY1501
NameCompanyKatalog Numarası<güçlü>Yorumlar
güçlü2. PCR Reaksiyonları
dNTP KarışımıAgilent genomik200415-51her biri 25
mM iProof Yüksek Kaliteli DNA polimerazBio-rad172-5301
Manganez (II) klorür tetrahidratSigma-AldrichM8054CAS N & ordm; 13446-34-9 MW 197.91
Taq DNA PolimerazSigma-AldrichD4545Hata için eğilimli PCR
Name<strong>Company<strong>Katalog NumarasıComments
3. Plazmid doğrusallaştırma
BamHI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0136S
Sığır Serumu AlbüminiNew England BiolabsB9001S
XhoI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0146S
I değil kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0189S
Jel KırmızıBiotium41003DNA boyama için
güçlü > İsim< / strong> <strong > Company < / strong > <strong > Katalog Numarası< / strong > Yorumlar< / strong
> < strong >4. FOX tahlilleri< / güçlü>
Amonyum demir (II) sülfat hekzahidratSigma-AldrichF3754CAS N & ordm; 7783-85-9 MW 392.14
Anysil AlkolSigma AldrichW209902CAS N & ordm; 105-13-5 MW 138.16
D-SorbitolSigma-AldrichS1876CAS N & ordm; 50-70-4 MW 182.17
Hidrojen peroksit% 30Merck Millipore1072090250FOX standart eğrisi
Ksilenol Turuncu disodyum tuzuSigma-Aldrich52097CAS N & ordm; 1611-35-4 MW 716.62
< güçlü > Ad< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü>5. Agaroz jel maddeleri< / güçlü >
AgaroseNorgen28035CAS N & ordm; 9012-36-6
Jel KırmızıBiotium41003DNA analiz boyası
GeneRuler 1kb MerdivenThermo ScientificSM0311DNA MW standart
Yükleme Boyası 6xThermo ScientificR0611
Düşük erime sıcaklığı agarozBio-rad161-3112CAS N & ordm; 39346-81-1
< güçlü > Adı< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü >< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü >6. Kitler ve hücreler
S. cerevisiae suşu BJ5465LGC PromochemATTC 208289Genotip ile proteaz eksikliği olan suşu: MAT & alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Mavi yetkin hücrelerAgilent genomics200150Plazmid saflaştırma ve amplifikasyon için
NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme KitiMacherey-Nagel740,609,250DNA jel ekstraksiyonu
NucleoSpin Plazmid KitiMacherey-Nagel740,588,250Sütun miniprep Kiti
Maya Dönüşüm KitiSigma-AldrichYEAST1-1KTDahil DNA taşıyıcı (Somon testisleri)
Zymoprep maya plazmid miniprep IZymo araştırmasıD2001Mayadan plazmid ekstraksiyonu
AdCompany<strong>Katalog NumarasıComments
7. Plakalar
96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One655101Berrak, steril olmayan, polistiren (aktivite ölçümleri için)
96 oyuklu plakalarGreiner Bio-One655161Berrak, steril, polistiren (mikrofermantasyonlar için)
96 oyuklu plaka kapağıGreiner Bio-One656171Berrak, steril, polistiren (mikrofermantasyonlar için)
<

Kaynaklar

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919(2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Rastgele MutajenezIn Vivo DNA RekombinasyonuFungal Aril-alkol OksidazYüksek Kapasiteli TaramaFenton Reaksiyon AnaliziJel ElektroforeziMaya Transformasyonu
Evrim Yöntemi yönettiği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.