Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CD146 İzolasyonu

7.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53782

⸱

17 Haziran 2016

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Bu makalede

Özet

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

Özet

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. Ayrıca, büyük olasılıkla normal organ gelişiminde rol var ve hastalık rolleri, bir fibrotik doğa ile özellikle atfedilmiştir. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Burada anlatılan izolasyon tekniği akciğer ikamet MSC (L-MKH) birden özelliklerini uygular. sıçanların kurban üzerine, akciğerler çıkarıldı ve kan kaldırmak için birden çok kez durulanır. neşter mekanik ayrışma ardından, akciğerler kollajenaz tip I, nötr proteaz ve DNaz tip I obtaine bir karışımını kullanarak 2-3 saat sindirilirD tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yıkandı ve yoğunluk gradyan ortamı (yoğunluk 1.073 g / ml) üzerine yayıldı. Santrifüj işleminden sonra, interfaz gelen hücreler yıkanır ve kültürü ile işlenmiş balonlarına kaplanmıştır. Hücreler, fizyolojik,% 5 O2 4-7 gün% 5 CO2 şartları için kültürlenir. Fibroblastlar (CD146 -) tüketmek ve CD146 + hücreleri yalnızca L-MSC'ler (CD146 +), pozitif seçim popülasyonu sağlamak için manyetik boncuk seçim yoluyla gerçekleştirilir. Özet olarak, bu prosedür, güvenli başka in vitro çalışma ve işleme için primer L-MSC nüfusu üretir. Çünkü protokol doğası, kolayca diğer deneysel hayvan modellerinde tercüme edilebilir.

Giriş

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. gelişimi sırasında, akciğer olmak üzere, mezenşimin gelişimsel ipuçları önemli bir kaynak olduğunu ve yerleşik MKH bu merkezinde olması olası bir aday vardır. Ayrıca, kanıtlar ikamet MKH kanser 1,2 ve fibrozis 3 de dahil olmak üzere, yetişkin hastalıkları altüst ortaya çıkmaktadır. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin 4 izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Kök hücre antijenini-1 (Sca-1) doku kök hücrelerin bir çeşitliliği için bir markör olarak farelerde tespit edilmiştir, ve L-MSC 5 izole edilmesi için de kullanılabilir, ancak ne yazık varBaşka bir tür 6 ortologlarını da bilinir. Araştırmacılar akciğer dokusu ya da sıvı ya da L-MSC izolasyonu için farklı yalıtım çeşitli yöntemler bildirilmiştir. / CD45 - / - CD90 + hücreleri 7, CD31 - / CD45 - / epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) - Bu, CD31 seçilmesi (FACS) göre yöntem flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması değişir / Sca-1 + hücreleri 8, çok ilaca dirençli taşıyıcı kıyılmış dokusu 13 takım plastik bağlılık 11,12 ve göç ATP bağlayıcı kaset G (ABCG2) pozitif hücreler 9 veya Hoechst 33.342 boya efflux 10.

Burada sunulan yöntemin avantajı pek çok kat bulunmaktadır. Yumuşak enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı 14 kullanılarak, tek bir MKH'lerin arasında, ancak epitelial veya endotelial hücreleri hariç yoğunluğu aralığının tüm hücreleri elde edilir. sonraki plastik bağlılık adım sadece mesench sağlarymal hücreleri lökosit ortadan kaldırarak, yapışır ve kültür kalmak. Bu hücreler CD146 ifade yok gibi en önemlisi, ancak CD146 + seçim aşaması, fibroblast ortadan kaldırılması için izin verir. Hücre yapışma molekülü CD146 ekspresyonu pozitif multipotency ile ilişkilidir ve bir mezenkimal hücre popülasyonu 15-19 den fibroblastlar ayıklamak için iyi bir belirteç etmektir. Sadece MSC değil, aynı zamanda lipofibroblasts 5,20 ifade edilmediği gibi bu, bir seçme markeri olarak CD90 ile bir avantajdır. o hücreler üzerinde nazik olduğu gibi bu protokolde açıkça, bir manyetik boncuk seçimi seçmiş ve tüm prosedür steril şartlarda yapılabilir. sonucudur yönteme karşı, bu izolasyon yönteminin bir başka önemli avantajı, sonucudur yöntemi için bir ay ya da daha fazla karşı bu 6-10 gün, nispeten hızlı olmasıdır. Üç beş gün ilk izolasyondan sonra mezenkimal nüfus CD146 + sele hazır ction; Başka bir üç ila beş gün sonra CD146 + hücreleri deneyler için kullanılmaya hazır ya da daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. MKH uzun ex vivo kültür 19 fibroblastlar doğru transdifferentiate olarak kültür azalmış zaman hücrelerinin kalitesini artırır. Son olarak, çünkü protokol doğası, sindirim enzimleri ve inkübasyon süresi seçilerek ayarlanması ile diğer organ sistemleri sadece uygun antikorlar seçerek veya hatta diğer türler için bu yöntemi uygulamak mümkündür.

Bu izolasyon yönteminin ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir ve izolasyon ve CD146 + alt populasyonun sonraki seçimi genel şematik bir görünümüdür, sırasıyla Şekil 1 A ve 1 B 'de verilmektedir. Ayrıca, ayrıntıları bu hücrelerin dondurulması ve çözülmesi, geçiş için dahil edilmiştir.

reklam / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
. Pulmoner mezenkimal hücreler (A) ve daha sonraki CD146 + hücre seçimi (B) min = dakika izolasyonu Şekil 1. Şematik genel bakış; EDTA = Etilendiamintetraasetik asit; 2. Ab = ikincil antikor; a-CD146 antikor = birincil anti-CD146 antikor; -ve hücreleri = CD146 negatif hücrelerin; + hücreler = CD146 pozitif hücreler ettik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemler Ottawa Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (hayvan etik protokol Ohri-1696) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi.

Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 1. İzolasyon

  1. 50 ml tüp enzim karışımı hazırlayın: 30 U Nötr Proteaz tartmak, 2500 U kollajenaz I ve 500 U DNAz I. Bu miktarlar yetişkin bir fare veya sıçan yavru akciğerler için yeterli. kullanılana kadar 4 ° C 'de izolasyon ve mağaza gününde hazırlayın.
  2. pentobarbital sodyum, intra-peritonal enjeksiyon ile günde 13 Kurban yavrular (0.2 mi, 65 mg / ml). bilinç oluşturmak için ayak tutam refleks kullanın. Aşağıda tarif edilen hayvanın ölümü, göğüs açılarak sağlanır.
  3. çok dikkatli olmama,% 70 etanol ile hayvan püskürtülerek cildin dezenfekte ve dikkatle diyafram başlayan ve rostral tarafa doğru kesim, cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi açmakakciğerlere zarar. Toraks erişim sağlamak için göğüs kafesi kesip alternatif hemostatik kelepçeler kullanarak açık göğüs kafesi yayıldı, ya da.
  4. kalbi kaldırarak hayvan asıl bulbus olfaktoryusları alındı. kalbi kaldırmak için, küçük forseps ile timus ve kalp kavramak ve cerrahi makas ile bu kesip. artık kan kopmuş aort ve pulmoner arter çıkana kadar hemen ardından, bir gazlı bez ile kan emer.
  5. aşağıdaki gibi toraks akciğerlere kaldırın: küçük forseps ile trakea tutun, daha sonra rostral tarafında cerrahi makas ile trakea sever. yavaşça toraks dışına akciğer paketini çekerken, akciğerler serbest göğüs kafesi boyunca sırt tarafında herhangi bir bağ dokusu kesip.
  6. cerrahi makas ile diyafram boyunca keserek aorta ve yemek borusu akciğerlere Sever. Şimdi akciğerler tamamen toraks arınmış bir gazlı bez ile hafifçe kalan kan kaldırın.
  7. sur ile trakea ve bronşlar kaldırjik makas ve dikkatli bir şekilde soğuk 35 mi% 30 sitrat-fosfat-Dekstroz Adenin (CPDA-1) pıhtı önleyici ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp akciğer lobları transferi (26.30 g trisodyum sitrat dihidrat, 3.27 g askorbik asit monohidrat, 2.22 g monosodyum dihidrojen fosfat, 31.80 g D-glikoz, 1 L 0.275 g adenin H2O arıtıldı; steril filtre kan ve ortadan kaldırmak için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kullanımdan önce 0.22 um membran filtre) kullanılarak çözelti.
  8. % 30 CPDA-1 / PBS içinde 5 dakika çalkalandıktan sonra, 35 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) (RT) içeren yeni bir 50 ml'lik tüpe akciğer transfer sitrat çıkarmak için hafifçe ters. içeren bir tüpe aktarın 35 mi Dulbecco PBS + Sodyum pirüvat + Glukoz (DPBS ++) (RT). Her durulama adımı yaklaşık 5 dakika sürer.
    Not: Kalsiyum klorür dihidrat 132.4 mg, magnezyum klorür heksahidrat 100 mg, potasyum klorür (susuz), 200 m: DPBS ++ ticari sipariş veya kadar yapılabilir 21 şug potasyum fosfat monobazik (susuz) 200 mg sodyum klorür (susuz) 8000 mg sodyum fosfat dibazik (susuz) 1,144.5 mg, D-glikoz, 1000 mg sodyum piruvat ve 36 mg 1 L arı H2O, pH 7.3. Steril filtre kullanmadan önce, bir 0.22 mikron membran filtresi kullanılarak çözelti.
  9. (37 ° C önceden ısıtılmış) ++ 10 mi DPBS ekleme ve çözünene kadar hafifçe baş aşağı çevirerek enzim karışımı içinde çözülür.
  10. Yeni 50 ml tüp akciğerlere aktarın ve ince kıyılmış kadar neşter kullanılarak tüp duvara akciğer doğrayın. dokuya (10 mi, yetişkin fare / sıçan yavru akciğer başına enzim karışımı /) enzim karışımı ekleyin tüpü sıkıca kapatın ve (yumuşak çalkalama ile 38 ° C'de inkübe ya ısı karıştırıcı, çalkalanan bir su banyosu ya da su içinde düzenli manuel ajitasyon ile banyo). Fetal doku 60 dakika, çocuk / erişkin doku 90-120 dakika, fibrotik yetişkin doku 120-150 dk: süre doku tipine bağlıdır.
  11. iki değerli katyonlar w şelat sindirim durduruni 200 Etilendiamintetraasetik asit ul (EDTA, 0.15 M, pH 7.4 ile yıkanır. Steril filtre kullanılmadan önce 0.22 um membran filtre kullanılarak çözeltisi).
  12. 20 mi% 5 fetal sığır serumu (FBS) / PBS ilave edin ve yeni bir 50 mL tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden Bütün süspansiyon geçmektedir. 40 ml kadar olan toplam hacim getiren 10 mi,% 5 FBS / PBS ile boru ve hücre süzgecinden yıkayın.
  13. 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj.
  14. 40 ml% 5 FBS / PBS tekrar süspansiyon, (pelet açıkça görülebilir olmalı) Süpernatantı ve santrifüj adımı 1.13 tekrarlayın.
  15. 4 mi,% 5 FBS içinde yeniden süspanse / PBS (RT) ve dikkatli bir şekilde fazla 3 mi yoğunluk gradyan maddesi tabakası (1.073 g / cm3), 15 ml'lik bir tüpe 14. İyi bir interfaz elde etmek için, tek bir hücre süspansiyonu katman, çok düşük bir hızda> 45 ° 'lik açıyla meydana çok önemlidir.
  16. 900 xg'de Santrifüj 20 dakika, orta (5/10) hızlanma, hiçbir yavaşlama, 19 ° C.
  17. in mevcut hücreleri toplayınterphase ve steril 10 ml PBS bunları tekrar süspansiyon.
  18. 500 xg'de 5 dakika, 21 ° C santrifüj.
  19. 500 mi αMEM,% 20 hacim / hacim FBS başına 2 mmol L-glutamin ile takviye edilmiş Süpernatantı ve 10 ml hücre pelletini önceden ısıtılmış tamamlanmış L-MSC kültür ortamı (minimum temel ortam Kartal, alfa modifikasyonu (αMEM), ve% 1 hacim / hacim Penisilin / streptomisin / Amfoterisin B
  20. Tekrar santrifüj adımı 1.18. Daha sonra, önceden ısıtılmış taze kültür ortamı, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
  21. Bu aşamada hücreler çoğu plastik yapışık değildir, çünkü yüksek bir yoğunlukta bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ve plaka kullanarak hücreleri sayın. Sıçan yavru akciğer hücreleri 1-2 önce tohum ekme yoğunluğu yeterince yoğun iken tam kaplama yoğunluğu X, örneğin, bir yetişkin fare akciğer hücreleri 10 5 hücre / cm2'de tohumlanmıştır hayvanın türüne ve yaşına bağlıdır 10 4 hücre / cm2 . 0.2 ml L-MSC kültür ortamı / cm 2 kullanın.
  22. Kültürü L-erişkin nemlendirilmiş bir% 5 O2,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de.
  23. PBS ile bir kez durulama sonra ortam ilk ekimden 24 saat sonra, ve daha sonra, her 3 günde bir değiştirin. Hücreler kökenli hayvan bağlı olarak ortalama 3-5 gün sürer% 80-90 izdiham kadar kültürlü olmalıdır. Yüksek izdiham fibroblastlar içine farklılaşmasını teşvik edecektir.

CD146 + Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 2. Seçim

  1. Ikincil antikor ile manyetik boncuk kaplanması
    1. Steril koşullarda cryovial Coat yuvarlak tabanlı 10 ug ikincil antikor / 100 ul manyetik boncuk oranında biyotinlenmiş sekonder antikor ile, manyetik boncuklar, 2 ml'lik steril. Beklenen 0.5 x 10 6 hücre başına 10 ul ikincil antikoru kullanarak, ve 100 ul manyetik boncukları ve 10 ug antikor, en az kullanın.
      Not: oranıüreticileri arasında farklılık gösterebilir boncuk hacmi başına kullanılan antikorlarının verilmesinin, seçim boncuk için üreticinin talimatlarına başvurun. Bu protokol, bu protokolün optimizasyonu kullanılan boncuk ve antikor masaya 1 bakınız.
    2. Oda sıcaklığında / 30 dakika (RPM), 30 dakika için bir döner Örnek karıştırıcı içinde inkübe edin.
    3. 1.5 ml steril% 0.1 sığır serum albümini (BSA) boncuk tekrar / PBS ve 3 ml transfer yuvarlak tabanlı tüp (tüp akış sitometrisi). Ek bir 1.5 mi% 0.1 BSA / PBS ile dondurarak saklamaya uygun vialler durulayın ve 3 ml tüp aktarın.
    4. Uygun bir mıknatıs tüp yerleştirin ve tüm boncuk tüpün arka duvara bağlı ve çözelti berrak kalır kadar 2 dakika bekleyin. 3 ml% 0,1 BSA / PBS ile iki kez akış ve tekrar yıkama çıkarın.
    5. ışıktan korumalı 4 ° C 'de 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde boncuklar ve mağaza, yeniden süspanse edin. 5 gün içinde kullanın.
  2. CD146 + L-mezenkimal Etiketleme
    1. yumuşak olmayan bir tripsin çözeltisi kullanılarak PBS ile durulandıktan sonra mezenşimal hücrelerin hasat.
      Not: Cilt kültür şişesi büyüklüğüne (0.2 ml / cm2, orta ya da PBS) bağlıdır.
      1. kültür ortamı çıkarın ve steril PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
      2. Yumuşak olmayan tripsin çözeltinin uygun hacmi ekleyin (Tablo 1 e bakınız). Hücreler müstakil kadar Tablo 1 'de çözeltisi kullanıldığında, yaklaşık kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 10 dakika kuluçkalayın.
      3. 500 x g'de 5 dakika boyunca, L-MSC kültür ortamı, ve santrifüj ekleyerek enzimi.
    2. % 0.1 BSA / PBS içinde, tekrar süspansiyon hücreleri Süpernatantı ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
      Not:% 0.1 BSA hacmi / PBS kültür şişesi büyüklüğüne bağlıdır: 5 ya da 10 mi% 0.1 BSA / PBS için amaçlanmıştır.
    3. Adımı yineleyin 2.2.2 ve 3 ml% 0,1 BSA / PBS (bloklar un hücrelerin özel miktarda tekrar süspansiyonBelirli bağlanma yerleri ve) hücrenin hayatta kalabilmesi için. hücreleri buz üzerinde tutun.
    4. birincil anti-CD146 antikoru ile alt tüp yuvarlak bir 3 ml hazırlayın, ve buz üzerinde tutmak.
      Not: hücrelerin özel bir miktarda ilave edilir ki ilk antikor konsantrasyonu kullanılır antikor bağlıdır. Önerilen anti-sıçan CD146 antikoru için bakınız Tablo 1.
    5. primer antikor ile tüp aşama 2.2.3 hücrelerin toplam hacim. Sıkıca kapatmak ve 15 rpm, 4 ° C'de dönen bir örnek mikserde 30 dakika kuluçkalayın.
    6. 500 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje hücreleri, 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Tekrarlayın santrifüj adımı.
    7. Bölüm 2.1'de talimatlara göre hazırlandı ve 15 rpm, 4 ° C'de dönen bir örnek mikserde 30 dakika inkübe edildi ikincil antikor kaplı boncuklar içeren 3 ml çözelti içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  3. CD146 + L-mezenkimal seçme
    1. Mıknatıs üzerinde etiketli CD146 + L-MKH'lerin içeren tüp yerleştirin. pozitif hücrelerin tüpün arkasına çizilecektir. tüp hareketli veya boncuklar dokunmadan yavaşça steril bir Pasteur pipeti (bu toplanır ve deneysel tasarım göre atılabilir olarak) negatif hücreleri ile süpernatant hasat edilir.
    2. mıknatıstan tüpü çıkarın ve 3 ml% 10 BSA / PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Adım 2.3.1 açıklanan seçim prosedürü tekrarlayın. dört kez daha (Σ 5 Seçim aşama).
    3. Önceden ısıtılmış L-MSC kültür ortamında CD146 + L-mezenkimal yeniden süspanse edin ve mıknatıs geri döner.
    4. Uygun büyüklükte bir kültür şişesi (0.2 ml / cm2) 'de, L-MSC kültür ortamı ve plakadaki supernatant, tekrar süspansiyon çıkarın. Genel bir kural olarak, aynı boyutta bir kültür şişesi içinde plaka hücreleri olan hücreler Boncuk seçiminden önce kaldırılmıştır. CD146 + L-MKH sayısı ve bu nedenle kaplama yoğunluğu, olacakKaynak hayvanın yaşı, türler ve suşuna bağlıdır. Her zaman ~ 5,000 hücre / cm2 bir kaplama yoğunluğu hedefliyoruz.
      Not: boncuk hücre büyümesini rahatsız etmeyecek ve hücreler çoğalmaya olarak yavaş yavaş kaybolacaktır.

3. Dondurucu Hücreler

  1. Aşağıdaki dondurma ortamı kullanın:% 20 FBS,% 12.5 (% 0.9 NaCI içinde% 10 pentastarch)% 60 pentastarch çözeltisi CPDA-1,% 2.5 NaCI (% 0.9),% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) 22.
    Not: tüm malzemeyi varsa,% 5 DMSO,% 30 FBS ve% 65 αMEM içeren bir çözüm iyi bir alternatiftir.
  2. 1 ml her bir cryovials 0.5 x 10 6 hücre / mL, kısım yeniden süspanse hücre bir donma kap kullanılarak -80 ° C 'de O / N dondurma.
  3. Sonraki gün, bir sıvı azot depolama tankı transfer.

4. Çözülme Hücreler

  1. 5 dakika için 37 ° C su banyosu içinde hücreleri bir şişe çözülme.
  2. 10 ml içinde süspanse edin hücreleriönceden ısıtılmış bir kültür ortamı ile 500 x g'de 5 dakika, 21 ° C'de santrifüjlenir.
  3. Süpernatantı ve 10 ml kültür ortamı içinde hücre pelletini. Havalandırmalı kap hücre kültürü içinde tohum hücreleri, 0.2 ml / cm2 ortam 5000 hücre / cm2'de şişeler muamele (örneğin, 75 cm 2 şişeye 15 mL) eklenmiştir.
  4. % 5 Kültür hücreleri O2,% 5 hasat ve / veya deneysel kullanım için% 80-90 konfluent kadar CO2. Aşırı confluency farklılaşmasını neden olacaktır. 5.000 hücre / cm 2 ekim yaparken, L-MKH kültürü 3-4 gün içinde% 80-90 confluency ulaşacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

MKH, yoğunluk ve plastik bağlılığın en güvenilir fiziksel özelliklerinin İki, L-MKH'lerin içeren akciğer mezenkimal hücre fraksiyonu elde etmek için bu protokolün ilk bölümünde kullanılmaktadır. yoğunluk gradyan interfaz akciğer mezenkimal hücrelerin yanı sıra monosit ve makrofajlar dahil olsa da, plastik yapışma kültür 3-5 gün sadece akciğer mezenkimal hücreler kalmasını sağlar izledi. Nitekim bu hücre popülasyonu klasik MSC yüzey belirteçleri CD73, CD90 ve CD146 ifade ve artık herh...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Birincil L-MKH izolasyonu ve kültürü daha iyi işlev ve hücresel düzeyde diğer hücre popülasyonlarının ile olan etkileşimlerini ve akciğer gelişimi, sağlık ve hastalık rollerini anlamak için bir fırsat sunuyor. Bu, belirli bir hücre tek işaretleyici olmaması neredeyse imkansız yerinde bu hücrelerin çalışma yapar, bu özellikle önemlidir. Tüm ilköğretim hücre popülasyonlarının olduğu gibi, kimse bu hücreler (24 gözden) kültür 19 tutulur artık onların karakteri değiştirmek için daha muhtemel o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

JJPC, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. MAM, Alman Ulusal Akademik Vakfı - Studienstiftung des Deutschen Volkes'ten bir başarı bursu alır ve EFCNI'den (Avrupa Yeni Doğan Bebek Bakımı Vakfı) bir hibe ile desteklenir. BT, CIHR, Kanada Akciğer Derneği, Kök Hücre Ağı ve Doğu Ontario Araştırma Enstitüsü Çocuk Hastanesi tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nötr ProteazWorthington Biochemical CorporationLS02104İzolasyon gününde hazırlanın ve 4 ° C'de saklayın;
Kollajenaz IWorthington Biochemical CorporationLS004196İzolasyon gününde hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın; DNAse
ISigma-AldrichD5025İzolasyon gününde hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın;
Pentobarbital sodyum (Ötenazi)Bimeda-MTC Hayvan Sağlığı A.Ş., Dublin, İrlanda-20-30 g arasındaki sıçan yavruları için 0.2 ml kullanın; daha büyük hayvanların daha fazlasına ihtiyacı olabilir.
Dulbecco' s PBS + Sodyum-piruvat + GlikozYaşam Teknolojileri14287-072Bu D-PBS'de bulunan kalsiyum ve magnezyum enzimatik sindirimi kolaylaştırdığından, bu D-PBS'yi kullanmak çok önemlidir
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)GE Healthcare17-5446-52Yoğunluk gradyan ortamı. İyi bir interfaz elde etmek için, tek hücreli süspansiyonun katmanlanmasının >45 ° C'de gerçekleşmesi çok önemlidir; açı çok düşük hızda ve sonraki santrifüjleme 19 ° C'de yapılır.
&alfa; MEMSigma-AldrichM804237 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
200 mM L-GlutaminYaşam Teknolojileri25030-164
100x Antibiyotik-AntimikotikYaşam Teknolojileri15240-062Penisilin / Streptomisin / Fungizone
M-280 DynabeadsYaşam Teknolojileri11205DManyetik boncuklar
biyotinile poliklonal tavşan-anti-fare IgGDako, Agilent TechnologiesE0464Aşağıda açıklanan anti-sıçan CD146 antikoru ile eşleşen biyotinile edilmiş ikincil antikor
DynaBeads ile kullanılması önerilen DynaMag5-magnetLife Technologies12303DMagnet. NOT: mıknatıs üreticiye göre seçilmelidir. Tercih edilen mıknatıs boncuklarının talimatları.
TrypLE ekspres Yaşam Teknolojileri12605-028Nazik tripsin olmayan alternatif, 1 ml TrypLE express / 25 cm 2< / sup> yüzey alanı kullanın. Ayrıldıktan sonra, 3 ml TrypLE
anti-sıçan CD146 antikoruLifespan Biosciences Inc.'iC3584112.5 ve mu; 0,5 x 106 hücre başına l
Pentaspan (pentastarch çözeltisi)Bristol-Myers SquibbKanada-Yerelkan bağışı hizmetleri veya hematoloji departmanları aracılığıyla elde edilebilir. Alternatif olarak, %0.9 NaCl ile 1:1 oranında seyreltilmiş PSI %20 Pentastarch çözeltisi (Koruma Solüsyonları, PST001) kullanılabilir.
Mr. Frosty dondurma kabıThermoFisher Scientific5100-0001L-MSC'leri gece boyunca -80 ° C'de dondururken canlılığı artırır; Ç
kullanılana kadar C kullanılana kadar C , inaktive etmek için 10 ml L-MSC kültür ortamı yeterlidir.

Kaynaklar

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498(2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CD146 Pozitif H crelerEnzimatik SindirimYo unluk Gradyan Santrif jasyonuManyetik Boncuk Se imiPlastik AdezyonuS an Akci er zolasyonuH cre K lt r ProtokolMSC Y zey Belirte leriDoku Sindirimi
CD146 İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.